ბიოინჟინერული უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზისი სამრეწველო წარმოებაში

ბიოინჟინერული ბაქტერიული სახეობები, როგორიცაა E. coli, ასევე გენეტიკურად მოდიფიცირებული ძუძუმწოვრებისა და მცენარეების უჯრედული ტიპები ფართოდ გამოიყენება ბიოტექნოლოგიაში მოლეკულების ექსპრესიისთვის. ამ სინთეზირებული ბიომოლეკულების გამოსათავისუფლებლად საჭიროა უჯრედების დისრუფციის სანდო ტექნიკა. მაღალი წარმადობის ულტრაბგერითი დამუშავება არის დადასტურებული მეთოდი ეფექტური და სანდო უჯრედული ლიზისისთვის – მარტივად მასშტაბირებადი დიდი გამტარუნარიანობისთვის. Hielscher Ultrasonics გთავაზობთ მაღალი წარმადობის ულტრაბგერით აპარატურას ეფექტური უჯრედული ლიზისისთვის, რათა წარმოიქმნას მაღალი ხარისხის ბიომოლეკულების დიდი მოცულობები.

მოლეკულების ექსტრაქცია უჯრედული ფაბრიკებიდან

ბიომოლეკულების ფართო სპექტრის წარმოებისთვის, სხვადასხვა ინჟინერული მიკრობები და მცენარეული უჯრედები შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც მიკრობული უჯრედული ფაბრიკები, მათ შორის Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, ციანობაქტერიები, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana და წყალმცენარეები, ბევრ სხვათა შორის. ამ უჯრედულ ფაბრიკებს შეუძლიათ წარმოქმნან ცილები, ლიპიდები, ბიოქიმიკატები, პოლიმერები, ბიოსაწვავი და ოლეოქიმიკატები, რომლებიც გამოიყენება როგორც საკვები ან სამრეწველო დანიშნულების ნედლეული. უჯრედული ფაბრიკების როლში გამოყენებული უჯრედები კულტივირდება დახურულ ბიორეაქტორებში, სადაც მათ შეუძლიათ მიაღწიონ მაღალ ეფექტურობას, სპეციფიკურობას და დაბალ ენერგეტიკულ მოთხოვნებს.
ბიოინჟინერული უჯრედული კულტურებიდან სამიზნე მოლეკულების იზოლაციისთვის, უჯრედები უნდა დაინგრეოს ისე, რომ უჯრედშიდა მასალა გამოიყოს. ულტრაბგერითი უჯრედული დისრუპტორები დამკვიდრებულია, როგორც უჯრედული დეზინტეგრაციისა და კომპონენტების გამოყოფის მაღალსანდო და ეფექტური ტექნიკა.

მიკრობული უჯრედული ფაბრიკები არის მეტაბოლურად ინჟინერული უჯრედები, რომლებიც გამოიყენება სხვადასხვა ღირებული კომპონენტების სინთეზისთვის. ულტრაბგერითი უჯრედული დისრუფცია არის ეფექტური და სანდო მეთოდი ღირებული კომპონენტების უჯრედის შიგნიდან გამოსათავისუფლებლად.
კვლევა და გრაფიკა: ©Villaverde, 2010.

ულტრაბგერითი უჯრედული დისრუპტორების უპირატესობები

როგორც არათერმული, რბილი, მაგრამ მაღალეფექტური ტექნოლოგია, ულტრაბგერითი დისრუპტორები გამოიყენება ლაბორატორიასა და მრეწველობაში უჯრედების ლიზისისთვის და მაღალი ხარისხის ექსტრაქტების წარმოებისთვის, მაგალითად, უჯრედული ფაბრიკებიდან მოლეკულების იზოლაციისთვის.

მძლავრი ულტრაბგერა მიკრობული უჯრედული ფაბრიკების ეფექტური დაშლისთვის

ულტრაბგერითი უჯრედული დისრუპტორების მექანიზმი და ეფექტები:
უჯრედების ულტრაბგერითი დაშლა იყენებს ულტრაბგერითი ტალღების ენერგიას. ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი / უჯრედების დისრუპტორი აღჭურვილია ტიტანის შენადნობისგან დამზადებული ზონდით (იგივე სონოტროდი), რომელიც ირხევა მაღალ სიხშირეზე, დაახლოებით 20 kHz. ეს ნიშნავს, რომ ულტრაბგერითი ზონდი ულტრაბგერით დასამუშავებელ სითხეს წამში 20,000 რხევას გადასცემს. სითხეში გადაცემული ულტრაბგერითი ტალღები ხასიათდება მაღალი და დაბალი წნევის მონაცვლე ციკლებით. დაბალი წნევის ციკლის დროს სითხე ფართოვდება და წარმოიქმნება უმცირესი ვაკუუმური ბუშტუკები. ეს ძალიან მცირე ბუშტუკები იზრდება წნევის რამდენიმე მონაცვლე ციკლის განმავლობაში, სანამ მეტი ენერგიის შთანთქმას ვეღარ შეძლებენ. ამ მომენტში კავიტაციური ბუშტუკები ძალზე ინტენსიურად კოლაფსირდება და ადგილობრივად ქმნის ენერგიის უაღრესად მაღალი სიმკვრივის მქონე გარემოს. ეს ფენომენი ცნობილია როგორც აკუსტიკური კავიტაცია და ხასიათდება ადგილობრივად ძალიან მაღალი ტემპერატურებით, ძალიან მაღალი წნევებითა და ძვრის ძალებით. ეს ძვრის ძაბვები ეფექტურად არღვევს უჯრედის კედლებს და ზრდის მასის გადატანას უჯრედის შიგთავსსა და გარემომცველ გამხსნელს შორის. ულტრაბგერით წარმოქმნილი ძვრის ძალების გამოყენება წმინდად მექანიკური მეთოდია, რომელიც ფართოდ გამოიყენება და რეკომენდებულია ბაქტერიული უჯრედების დაშლისა და ცილების იზოლაციისთვის. როგორც უჯრედების დაშლის მარტივი და სწრაფი მეთოდი, ულტრაბგერითი დამუშავება იდეალურია მცირე, საშუალო და დიდი მოცულობებიდან იზოლაციისთვის. Hielscher-ის ციფრული ულტრაბგერითი აპარატები აღჭურვილია პარამეტრების მკაფიო მენიუთი ულტრაბგერითი დამუშავების ზუსტი კონტროლისთვის. ულტრაბგერითი დამუშავების ყველა მონაცემი ავტომატურად ინახება ჩაშენებულ SD-ბარათზე და მარტივად არის ხელმისაწვდომი. ულტრაბგერითი დეზინტეგრაციის პროცესში სითბოს გაფანტვის დახვეწილი საშუალებები, როგორიცაა გარე გაგრილება, ულტრაბგერითი დამუშავება პულსურ რეჟიმში და ა.შ., უზრუნველყოფს პროცესის იდეალური ტემპერატურის შენარჩუნებას და, შესაბამისად, ექსტრაქციით მიღებული სითბოსადმი მგრძნობიარე ნაერთების დაუზიანებლობას.

კვლევები ადასტურებს ულტრაბგერითი უჯრედების დისრუფციისა და ექსტრაქციის ძლიერ მხარეებს

პროფ. Chemat და სხვ. (2017) თავიანთ კვლევაში აღნიშნავენ, რომ „ულტრაბგერით ხელშეწყობილი ექსტრაქცია საკვებისა და ბუნებრივი პროდუქტების დამუშავების ტრადიციული მეთოდების ეკოლოგიურად სუფთა და ეკონომიკურად გამართლებული ალტერნატივაა. მთავარი სარგებელი ექსტრაქციისა და დამუშავების დროის, გამოყენებული ენერგიისა და გამხსნელების რაოდენობის, ტექნოლოგიური ოპერაციების რაოდენობისა და CO₂ CO₂ ემისიების შემცირებაა.”
Gabig-Ciminska და სხვ. (2014) თავიანთ კვლევაში იყენებდნენ მაღალი წნევის ჰომოგენიზატორსა და უჯრედების ულტრაბგერით დისრუპტორს სპორების ლიზისისა და დნმ-ის გამოთავისუფლებისთვის. უჯრედების დაშლის ორივე მეთოდის შედარებისას კვლევითი ჯგუფი სპორების დნმ-ის მისაღებად უჯრედების ლიზისის შესახებ ასკვნის: „ანალიზი ჩატარდა მაღალი წნევის ჰომოგენიზაციით მიღებული უჯრედული ლიზატების გამოყენებით. შემდეგ მივხვდით, რომ უჯრედების ულტრაბგერით დაშლას ამ მიზნისთვის გამორჩეული უპირატესობები აქვს. ეს მეთოდი საკმაოდ სწრაფია და მისი გამოყენება მცირე მოცულობის ნიმუშებისთვისაც შეიძლება.“ (Gabig-Ciminska et al., 2014)

ბიომოლეკულები უჯრედული ქარხნებიდან საკვების წარმოებისთვის

მიკრობული უჯრედული ქარხნები წარმოების პრაქტიკულად განხორციელებადი და ეფექტური მეთოდია, რომელიც იყენებს მიკრობულ ორგანიზმებს ბუნებრივი და მათთვის არაბუნებრივი მეტაბოლიტების მაღალი გამოსავლიანობით მისაღებად ისეთი მიკროორგანიზმების მეტაბოლური ბიოინჟინერიის გზით, როგორიცაა ბაქტერიები, საფუარები, სოკოები და ა.შ. მაგალითად, დიდი რაოდენობით ფერმენტებს აწარმოებენ ისეთი მიკროორგანიზმების გამოყენებით, როგორიცაა Aspergillus oryzae, სოკოები და ბაქტერიები. დიდი რაოდენობით წარმოებული ეს ფერმენტები გამოიყენება საკვებისა და სასმელების წარმოებაში, ასევე სოფლის მეურნეობაში, ბიოენერგეტიკასა და საყოფაცხოვრებო მოვლის საშუალებებში.
ზოგიერთი ბაქტერია, როგორიცაა Acetobacter xylinum და Gluconacetobacter xylinus, აწარმოებს ცელულოზას ფერმენტაციის პროცესში, სადაც ნანოფიბრები სინთეზირდება „ქვედა-ზემოთ“ პროცესით. ბაქტერიული ცელულოზა (ასევე ცნობილია როგორც მიკრობული ცელულოზა) ქიმიურად ეკვივალენტურია მცენარეული ცელულოზის, მაგრამ მას აქვს კრისტალურობის მაღალი ხარისხი და მაღალი სიწმინდე (თავისუფალი ლიგნინის, ჰემიცელულოზის, პექტინისა და სხვა ბიოგენური კომპონენტებისგან), ასევე ცელულოზის ნანოფიბრებით ნაქსოვი სამგანზომილებიანი (3D) რეტიკულური ქსელის უნიკალური სტრუქტურა. (იხ. Zhong, 2020) მცენარეული წარმოშობის ცელულოზასთან შედარებით, ბაქტერიული ცელულოზა უფრო მდგრადია და მიღებული ცელულოზა სუფთაა, რაც არ მოითხოვს რთული გასუფთავების ეტაპებს. ულტრაბგერითი დამუშავება და გამხსნელით ექსტრაქცია NaOH-ის ან SDS-ის (ნატრიუმის დოდეცილსულფატი) გამოყენებით ძალიან ეფექტურია ბაქტერიული ცელულოზის იზოლაციისთვის ბაქტერიული უჯრედებიდან.

ბიომოლეკულები უჯრედული ქარხნებიდან ფარმაცევტული და ვაქცინების წარმოებისთვის

უჯრედული ქარხნებიდან მიღებული ერთ-ერთი ყველაზე მნიშვნელოვანი ფარმაცევტული პროდუქტია ადამიანის ინსულინი. ბიოინჟინერული ინსულინის წარმოებისთვის ძირითადად გამოიყენება E. coli და Saccharomyces cerevisiae. რადგან ბიოსინთეზირებული ნანოზომის მოლეკულები მაღალი ბიოთავსებადობით ხასიათდება, ბიოლოგიური ნანონაწილაკები, როგორიცაა ფერიტინი, ხელსაყრელია ბიოწარმოებაში მრავალი დანიშნულებით გამოსაყენებლად. გარდა ამისა, მეტაბოლური ინჟინერიით მოდიფიცირებულ მიკრობებში წარმოება ხშირად მნიშვნელოვნად უფრო ეფექტურია მიღებული გამოსავლიანობის თვალსაზრისით. მაგალითად, არტემიზინინის მჟავას, რესვერატროლისა და ლიკოპენის წარმოება ათიდან რამდენიმე ასეულჯერ გაიზარდა და სამრეწველო მასშტაბის წარმოება უკვე დანერგილია ან შემუშავების პროცესშია. (იხ. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
მაგალითად, ცილაზე დაფუძნებული ნანოზომის ბიომოლეკულები თვითშეკრებადობის თვისებებით, როგორიცაა ფერიტინი და ვირუსის მსგავსი ნაწილაკები, განსაკუთრებით საინტერესოა ვაქცინების შემუშავებისთვის, რადგან ისინი იმიტირებენ როგორც პათოგენების ზომას, ისე სტრუქტურას და შესაძლებელია მათ ზედაპირზე ანტიგენების კონიუგაცია იმუნურ უჯრედებთან ურთიერთქმედების გასააქტიურებლად. ასეთი მოლეკულები ექსპრესირდება ე.წ. უჯრედულ ქარხნებში (მაგ., ინჟინერირებული E. coli შტამები), რომლებიც აწარმოებენ კონკრეტულ სამიზნე მოლეკულას.

E. coli BL21-ის ულტრაბგერითი ლიზისა და ფერიტინის გამოყოფის პროტოკოლი

ფერიტინი არის ცილა, რომლის ძირითადი ფუნქცია რკინის შენახვაა. ფერიტინი პერსპექტიულია ვაქცინებში თვითშეკრებადი ნანონაწილაკების სახით გამოსაყენებლად, სადაც ის ვაქცინის მიწოდების საშუალებად გამოიყენება (მაგ. SARS-Cov-2 სპაიკ ცილები). Sun et. al. (2016)-ის სამეცნიერო კვლევა აჩვენებს, რომ რეკომბინანტური ფერიტინი შეიძლება გამოიყოს ხსნადი ფორმით Escherichia coli-დან NaCl-ის დაბალი კონცენტრაციების დროს (≤50 mmol/L). ფერიტინის E. coli BL21-ში ექსპრესირებისა და ფერიტინის გამოყოფის მიზნით, წარმატებით იქნა გამოყენებული შემდეგი პროტოკოლი. რეკომბინანტური pET-28a/ferritin პლაზმიდა შეყვანილ იქნა E coli BL21 (DE3) შტამში ტრანსფორმაციის გზით. ფერიტინის მაექსპრესირებელი E coli BL21 (DE3) უჯრედები კულტივირდებოდა LB საკვებ არეში 0,5% კანამიცინით 37°C-ზე და OD600-ის 0,6 მნიშვნელობისას ექსპრესია ინდუცირდებოდა 0,4% იზოპროპილ-β-D-თიოგალაქტოპირანოზიდით 3 საათის განმავლობაში 37°C-ზე. საბოლოო კულტურა შემდეგ შეგროვდა ცენტრიფუგირებით 8000g-ზე 10 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე და მიღებული ნალექი შეგროვდა. შემდეგ ნალექი რესუსპენდირდა, შესაბამისად, LB არეში (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% საფუარის ექსტრაქტი)/ლიზის ბუფერში (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) და NaCl-ის სხვადასხვა კონცენტრაციის ხსნარში (0, 50, 100, 170 და 300 mmol/L). ბაქტერიული უჯრედების ლიზისთვის ულტრაბგერითი დამუშავება გამოიყენებოდა იმპულსურ რეჟიმში: მაგ., გამოიყენებოდა ულტრაბგერითი პროცესორი UP400St 100% ამპლიტუდით, 5 წამი ჩართული / 10 წამი გამორთული ციკლით, 40 ციკლის განმავლობაში) და შემდეგ ცენტრიფუგირებული იქნა 10 000g-ზე 15 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე. სუპერნატანტი და ნალექი გაანალიზდა ნატრიუმის დოდეცილსულფატის თანაობისას პოლიაკრილამიდის გელში ელექტროფორეზით (SDS-PAGE). ყველა ნატრიუმის დოდეცილსულფატით შეღებილი გელი სკანირდებოდა მაღალი გარჩევადობის სკანერით. გელის გამოსახულებები ანალიზდებოდა Magic Chemi 1D პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით. ოპტიმალური მკაფიოობის მისაღწევად ცილის ზოლები პარამეტრების კორექტირებით გამოვლინდა. ზოლების მონაცემები მიღებულ იქნა სამი ტექნიკური გამეორებიდან. (იხ. Sun et al., 2016)

ულტრაბგერითი უჯრედების დამშლელი აპარატები უჯრედული ფაბრიკების სამრეწველო ლიზისთვის

ულტრაბგერითი ლიზი და ექსტრაქცია არის საიმედო და მოსახერხებელი მეთოდი მეტაბოლიტების უჯრედული ფაბრიკებიდან გამოსაყოფად, რითაც ხელს უწყობს სამიზნე მოლეკულების ეფექტურ წარმოებას. ულტრაბგერითი უჯრედების დამშლელი აპარატები ხელმისაწვდომია ლაბორატორიულიდან სამრეწველო ზომამდე და პროცესები შეიძლება სრულად ლინეარულად გაიზარდოს.
Hielscher Ultrasonics არის თქვენი კომპეტენტური პარტნიორი მაღალი წარმადობის ულტრაბგერითი დამშლელი აპარატებისთვის და აქვს ხანგრძლივი გამოცდილება ულტრაბგერითი სისტემების ინტეგრაციის სფეროში ლაბორატორიულ და სამრეწველო პირობებში.
როდესაც საქმე ეხება დახვეწილ აპარატურასა და პროგრამულ უზრუნველყოფას, Hielscher Ultrasonics-ის უჯრედების დამშლელი სისტემები აკმაყოფილებს ყველა მოთხოვნას პროცესის ოპტიმალური კონტროლის, მარტივი ექსპლუატაციისა და გამოყენების მოხერხებულობისთვის. Hielscher-ის ულტრაბგერითი აპარატების კლიენტები და მომხმარებლები აფასებენ იმ უპირატესობას, რომ Hielscher-ის ულტრაბგერითი უჯრედების დამშლელი და ექსტრაქციის აპარატები პროცესის ზუსტი მონიტორინგისა და კონტროლის საშუალებას იძლევა – ციფრული სენსორული ეკრანისა და ბრაუზერით დისტანციური მართვის საშუალებით. ულტრაბგერითი დამუშავების ყველა მნიშვნელოვანი მონაცემი (მაგ. წმინდა ენერგია, ჯამური ენერგია, ამპლიტუდა, ხანგრძლივობა, ტემპერატურა, წნევა) ავტომატურად ინახება CSV ფაილში ინტეგრირებულ SD-ბარათზე. ეს ხელს უწყობს გამეორებადი და რეპროდუცირებადი შედეგების მიღებას და აადვილებს პროცესის სტანდარტიზაციას, ასევე კარგი წარმოების პრაქტიკის (cGMP) მოთხოვნების შესრულებას.
რა თქმა უნდა, Hielscher-ის ულტრაბგერითი პროცესორები შექმნილია 24/7 სრული დატვირთვით მუშაობისთვის და, შესაბამისად, მათი საიმედოდ ექსპლუატაცია შესაძლებელია სამრეწველო წარმოების პირობებში. მაღალი გამძლეობისა და ტექნიკური მომსახურების მცირე საჭიროების გამო ულტრაბგერითი აპარატების მოცდენის დრო ძალიან მცირეა. CIP (ადგილზე გაწმენდა) და SIP (ადგილზე სტერილიზაცია) ფუნქციები ამცირებს შრომატევადი გაწმენდის საჭიროებას, განსაკუთრებით იმის გამო, რომ სითხესთან შეხებაში მყოფ ყველა ნაწილს გლუვი ლითონის ზედაპირი აქვს (ფარული ხვრელებისა და საქშენების გარეშე).
ქვემოთ მოცემული ცხრილი გაძლევთ წარმოდგენას ჩვენი ულტრაბგერითი აპარატების დაახლოებითი დამუშავების სიმძლავრის შესახებ: