BL21 უჯრედების ლიზისი ულტრაბგერითი დამუშავებით

BL21 უჯრედები არის E. coli-ის შტამი, რომელიც ფართოდ გამოიყენება სამეცნიერო ლაბორატორიებში, ბიოტექნოლოგიასა და სამრეწველო წარმოებაში, პროტეინების მაღალი ეფექტურობით ექსპრესიის უნარის გამო. უჯრედების ულტრაბგერითი დაშლა, ლიზისი და პროტეინების ექსტრაქცია გავრცელებული მეთოდია BL21 უჯრედების შიგთავსიდან სამიზნე პროტეინების იზოლაციისა და შეგროვებისთვის. ულტრაბგერითი დამუშავება სრულად შლის უჯრედს და ათავისუფლებს მასში მოქცეულ ყველა პროტეინს, რაც პროტეინის 100%-ს ხელმისაწვდომს ხდის.

BL21 უჯრედები პროტეინების ექსპრესიისთვის

BL21 უჯრედი არის ქიმიურად კომპეტენტური E. coli-ის ბაქტერიული შტამი, რომელიც შესაფერისია ტრანსფორმაციისა და პროტეინების მაღალი დონის ექსპრესიისთვის T7 რნმ პოლიმერაზა-IPTG ინდუქციის სისტემის გამოყენებით. BL21 უჯრედები უზრუნველყოფს T7 პრომოტორის კონტროლის ქვეშ მყოფი ნებისმიერი გენის მაღალეფექტურ ექსპრესიას. E. coli-ის შტამი BL21(DE3) არის T7 რნმ პოლიმერაზაზე დაფუძნებული პროტეინების მწარმოებელი შტამი, რომელიც გამოიყენება T7 პრომოტორზე დაფუძნებულ ექსპრესიის ვექტორებთან ერთად და ფართოდ გამოიყენება ლაბორატორიებსა და მრეწველობაში რეკომბინანტური პროტეინების წარმოებისთვის. BL21(DE3)-ში რეკომბინანტური პროტეინის მაკოდირებელი გენის ტრანსკრიფციას ახორციელებს ქრომოსომულად კოდირებული T7 რნმ პოლიმერაზა (T7 RNAP), რომელიც ტრანსკრიფციას რვაჯერ უფრო სწრაფად ახორციელებს, ვიდრე ჩვეულებრივი E. coli RNAP. ეს შტამ BL21(DE3)-ს მაღალეფექტურს ხდის და პროტეინების ექსპრესიის ერთ-ერთ ყველაზე სასურველ უჯრედულ სისტემად აქცევს.

BL21 უჯრედებიდან ულტრაბგერითი ლიზისისა და პროტეინების ექსტრაქციის პროტოკოლი

BL21 უჯრედების ლიზისი ძირითადად ხორციელდება ულტრაბგერითი დამუშავებით, ლიზისის ბუფერად გამოყენებულ ნატრიუმის ლაუროილ სარკოზინატთან (ასევე ცნობილია როგორც სარკოზილი) კომბინაციაში. უჯრედების ულტრაბგერითი დაშლისა და პროტეინების ექსტრაქციის უპირატესობებია საიმედოობა, შედეგების განმეორებადობა და ულტრაბგერითი აპარატების მარტივი, უსაფრთხო და სწრაფი ექსპლუატაცია. ქვემოთ მოცემული პროტოკოლი გთავაზობთ BL21 უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზისის ეტაპობრივ ინსტრუქციას:

• შაპერონული პროტეინების მოსაცილებლად BL21 ბაქტერიების ნალექი ხელახლა დაასუსპენდირეს 50 ml ყინულივით ცივ ნატრიუმის ტრის-EDTA (STE) ბუფერში (შემადგენლობა: 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, დამატებული 100 mM PMSF).
• შემდეგ, ემატება 500 მიკროლიტრი ლიზოციმი (10 მგ/ მლ) და უჯრედები ინკუბირდება ყინულზე 15 წუთის განმავლობაში.
• შემდეგ, ემატება 500 ul DTT და 7 ml სარკოზილი (10% (w/v) მომზადებული STE ბუფერში).
• აუცილებელია გასუფთავებისთვის გამოყენებული ყველა ბუფერის ყინულივით ცივ მდგომარეობაში შენარჩუნება და ნიმუშების მუდმივად ყინულზე მოთავსება. გასუფთავების ყველა ეტაპი, თუ შესაძლებელია, ცივ ოთახში უნდა ჩატარდეს.



• ულტრაბგერითი ლიზისისა და პროტეინების ექსტრაქციისთვის, ნიმუშები დამუშავდება VialTweeter MultiSample ულტრაბგერითი აპარატით 4 x 30 წმ განმავლობაში, 100% ამპლიტუდით, ულტრაბგერითი დამუშავების ციკლებს შორის 2 წუთიანი ინტერვალით. ალტერნატივად, შეიძლება გამოყენებულ იქნას ზონდური ტიპის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი მიკროწვერით, მაგალითად, UP200Ht S26d2-ით (3 x 30 წმ, 2 წთ. პაუზა ულტრაბგერით ციკლებს შორის, 80% ამპლიტუდა).
• გასუფთავების შემდგომი ეტაპებისთვის ნიმუშები უნდა ინახებოდეს ყინულზე ან, ალტერნატიულად, -80°C-ზე შემდგომ დამუშავებამდე.

ულტრაბგერითი ლიზისი ზუსტი ტემპერატურული კონტროლის ქვეშ

ზუსტი და საიმედო ტემპერატურული კონტროლი გადამწყვეტია ბიოლოგიურ ნიმუშებთან მუშაობისას. მაღალი ტემპერატურა ნიმუშებში პროტეინების თერმულად გამოწვეულ დეგრადაციას იწყებს.
ნიმუშების მომზადების ყველა მექანიკური მეთოდის მსგავსად, ულტრაბგერითი დამუშავებაც წარმოქმნის სითბოს. თუმცა, VialTweeter-ის გამოყენებისას ნიმუშების ტემპერატურის კარგად კონტროლი შესაძლებელია. გთავაზობთ სხვადასხვა ვარიანტს თქვენი ნიმუშების ტემპერატურის მონიტორინგისა და კონტროლისთვის, როდესაც მათ VialTweeter-ით და VialPress-ით ანალიზისთვის ამზადებთ.

1. ნიმუშის ტემპერატურის მონიტორინგი: ულტრაბგერითი პროცესორი UP200St, რომელიც VialTweeter-ს ამუშავებს, აღჭურვილია ინტელექტუალური პროგრამული უზრუნველყოფითა და მისაერთებელი ტემპერატურის სენსორით. შეაერთეთ ტემპერატურის სენსორი UP200St-თან და მოათავსეთ სენსორის წვერი ნიმუშის ერთ-ერთ სინჯარაში. ციფრული ფერადი სენსორული ეკრანის მეშვეობით შეგიძლიათ UP200St-ის მენიუში დააყენოთ კონკრეტული ტემპერატურული დიაპაზონი თქვენი ნიმუშის ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის. ულტრაბგერითი აპარატი ავტომატურად გაჩერდება მაქსიმალური ტემპერატურის მიღწევისას და შეჩერდება, სანამ ნიმუშის ტემპერატურა დაყენებული ტემპერატურული დიაპაზონის ∆ ქვედა მნიშვნელობამდე არ დაეცემა. შემდეგ ულტრაბგერითი დამუშავება ავტომატურად განახლდება. ეს ინტელექტუალური ფუნქცია ხელს უშლის სითბოთი გამოწვეულ დეგრადაციას.
2. VialTweeter ბლოკი შეიძლება წინასწარ გაგრილდეს. ჩასვით VialTweeter ბლოკი (მხოლოდ სონოტროდი ტრანსდუცერის გარეშე!) მაცივარში ან გამაყინავში, რათა წინასწარ გაგრილდეს ტიტანის ბლოკი, რაც ხელს უწყობს ნიმუშში ტემპერატურის მატების გადავადებას. შესაძლებლობის შემთხვევაში, ნიმუში თავადაც შეიძლება წინასწარ გაგრილდეს.
3. გამოიყენეთ მშრალი ყინული ულტრაბგერითი დამუშავების დროს გასაგრილებლად. გამოიყენეთ მშრალი ყინულით სავსე არაღრმა ლანგარი და მოათავსეთ VialTweeter ყინულზე ისე, რომ სითბო სწრაფად გაიფანტოს.

მომხმარებლები მთელ მსოფლიოში იყენებენ VialTweeter-ს და VialPress-ს ყოველდღიური ნიმუშების მომზადების სამუშაოებისთვის ბიოლოგიურ, ბიოქიმიურ, სამედიცინო და კლინიკურ ლაბორატორიებში. UP200St პროცესორის ინტელექტუალური პროგრამული უზრუნველყოფა და ტემპერატურის კონტროლი უზრუნველყოფს ტემპერატურის საიმედო კონტროლს და თავიდან იცილებს სითბოთი გამოწვეულ ნიმუშის დაშლას. ულტრაბგერითი ნიმუშების მომზადება VialTweeter-ით და VialPress-ით იძლევა მაღალსაიმედო და გამეორებად შედეგებს!
 

იპოვეთ უჯრედების ოპტიმალური ულტრაბგერითი დამშლელი თქვენი ლიზისის ამოცანისთვის

Hielscher Ultrasonics არის ლაბორატორიული, მაგიდაზე დასადგმელი და სამრეწველო მასშტაბის სისტემებისთვის განკუთვნილი უჯრედების მაღალი წარმადობის ულტრაბგერითი დამშლელებისა და ჰომოგენიზატორების წარმოების მრავალწლიანი გამოცდილების მქონე მწარმოებელი. თქვენი ბაქტერიული უჯრედული კულტურის ზომა, კვლევის ან წარმოების მიზანი და საათში ან დღეში დასამუშავებელი უჯრედების მოცულობა მნიშვნელოვანი ფაქტორებია თქვენი ამოცანისთვის შესაფერისი უჯრედების ულტრაბგერითი დამშლელის შესარჩევად.
Hielscher Ultrasonics გთავაზობთ სხვადასხვა გადაწყვეტას რამდენიმე ნიმუშის (VialTweeter-ით მაქსიმუმ 10 ფლაკონი) და ნიმუშების დიდი რაოდენობის (მაგ., მიკროტიტრული ფირფიტები / ELISA ფირფიტები UIP400MTP-ით) ერთდროული ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის. ასორტიმენტი მოიცავს როგორც კლასიკურ ზონდური ტიპის ლაბორატორიულ ულტრაბგერით აპარატებს 50-დან 400 ვატამდე სიმძლავრით, ისე სრულად სამრეწველო ულტრაბგერით პროცესორებს, თითო ერთეულზე მაქსიმუმ 16 000 ვატამდე სიმძლავრით, ფართომასშტაბიან წარმოებაში უჯრედების კომერციული დაშლისა და ცილების ექსტრაქციისთვის. Hielscher-ის ყველა ულტრაბგერითი აპარატი შექმნილია 24/7/365 რეჟიმში სრული დატვირთვით მუშაობისთვის. გამძლეობა და საიმედოობა ჩვენი ულტრაბგერითი მოწყობილობების ძირითადი თვისებებია.
ყველა ციფრული ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი აღჭურვილია ინტელექტუალური პროგრამული უზრუნველყოფით, ფერადი სენსორული ეკრანითა და მონაცემთა ავტომატური რეგისტრაციის ფუნქციით, რაც ულტრაბგერით მოწყობილობას ლაბორატორიებსა და საწარმოებში მოსახერხებელ სამუშაო ინსტრუმენტად აქცევს.
გვაცნობეთ, რა ტიპის უჯრედების შემცველი ბიოლოგიური ნიმუშები უნდა დაამუშაოთ, რა მოცულობით, რა სიხშირით და რა მიზნით. ჩვენ გირჩევთ თქვენი პროცესის მოთხოვნებისთვის ყველაზე შესაფერის უჯრედების ულტრაბგერით დამშლელს.

ქვემოთ მოცემული ცხრილი წარმოდგენას გაძლევთ ჩვენი ულტრაბგერითი სისტემების მიახლოებით დამუშავების წარმადობაზე – კომპაქტური ხელის ჰომოგენიზატორებიდან და MultiSample ულტრაბგერითი აპარატებიდან კომერციული გამოყენებისთვის განკუთვნილ სამრეწველო ულტრაბგერით პროცესორებამდე:

ლიტერატურა / რეფერენციები

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.