BL21 უჯრედების უჯრედის ლიზისი ულტრაბგერითი გამოკვლევით
BL21 უჯრედები წარმოადგენს E. coli-ს შტამს, რომელიც ფართოდ გამოიყენება კვლევით ლაბორატორიებში, ბიოტექნოლოგიასა და სამრეწველო წარმოებაში, მათი მაღალი ეფექტურობის ცილების გამოხატვის უნარის გამო. ულტრაბგერითი უჯრედების დაშლა, ლიზისი და ცილის ექსტრაქცია არის გავრცელებული მეთოდი BL21 უჯრედების უჯრედული ინტერიერიდან მიზნობრივი ცილების იზოლირებისთვის და შეგროვებისთვის. ულტრაბგერითი არღვევს უჯრედს მთლიანად და ათავისუფლებს ყველა ჩაფლულ ცილას, რაც ცილის 100% ხელმისაწვდომს ხდის.
BL21 უჯრედები ცილის გამოხატვისთვის
BL21 უჯრედი არის ქიმიურად კომპეტენტური E. coli ბაქტერიული შტამი, რომელიც შესაფერისია ტრანსფორმაციისთვის და მაღალი დონის ცილის გამოხატვისთვის T7 RNA პოლიმერაზა-IPTG ინდუქციური სისტემის გამოყენებით. BL21 უჯრედები იძლევა მაღალი ეფექტურობის ცილის გამოხატვას ნებისმიერი გენის, რომელიც იმყოფება T7 პრომოტორის კონტროლის ქვეშ. E. coli შტამი BL21(DE3) არის T7 RNA პოლიმერაზაზე დაფუძნებული პროტეინის წარმოების შტამი, კომბინირებული T7 პრომოტორზე დაფუძნებულ ექსპრესიულ ვექტორებთან და ფართოდ გამოიყენება ლაბორატორიებსა და ინდუსტრიაში რეკომბინანტული ცილების წარმოებისთვის. BL21(DE3)-ში რეკომბინანტული ცილის მაკოდირებელი გენის ექსპრესია ტრანსკრიბირებულია ქრომოსომულად კოდირებული T7 რნმ პოლიმერაზას (T7 RNAP) მიერ, რომელიც ტრანსკრიბირდება რვაჯერ უფრო სწრაფად, ვიდრე ჩვეულებრივი E. coli RNAP. ეს ხდის შტამს BL21(DE3) უაღრესად ეფექტურს და აქცევს მას ერთ-ერთ ყველაზე სასურველ ცილის გამოხატვის უჯრედულ სისტემად.
პროტოკოლი ულტრაბგერითი ლიზისისა და BL21 უჯრედებიდან ცილის ექსტრაქციისთვის
BL21 უჯრედების უჯრედის ლიზისი ძირითადად ხორციელდება ულტრაბგერითი მოქმედების გამოყენებით ნატრიუმის ლაუროილ სარკოზინატთან (ასევე ცნობილი როგორც სარკოსილი), როგორც ლიზის ბუფერი. ულტრაბგერითი უჯრედების დაშლისა და ცილების ექსტრაქციის უპირატესობა მდგომარეობს ულტრაბგერითი აპარატების საიმედოობაში, განმეორებადობაში, ასევე მარტივ, უსაფრთხო და სწრაფ მუშაობაში. ქვემოთ მოცემული პროტოკოლი იძლევა ნაბიჯ-ნაბიჯ მიმართულებას ულტრაბგერითი BL21 უჯრედების ლიზისისთვის:
- ჩაპერონის ცილების ამოღების მიზნით, BL21 ბაქტერიული მარცვლები ხელახლა განთავსდა 50 მლ ყინულის ცივ ნატრიუმის Tris-EDTA (STE) ბუფერში (შედგება 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl დამატებული 100 mM-ით. PMSF).
- ემატება 500 მლ ლიზოზიმი (10 მგ/მლ) და უჯრედები ინკუბირებულია ყინულზე 15 წუთის განმავლობაში.
- ამის შემდეგ ემატება 500 მლ DTT და 7 მლ სარკოსილი (10% (w/v) შედგენილი STE ბუფერში).
- აუცილებელია, რომ ყველა გამწმენდი ბუფერი ყინულივით იყოს და ნიმუშები ყინულზე მუდმივად იყოს შენახული. გაწმენდის ყველა ეტაპი უნდა ჩატარდეს ცივ ოთახში, თუ ეს შესაძლებელია.
- ულტრაბგერითი ლიზისა და ცილის ექსტრაქციისთვის, ნიმუშები სონიფიცირებულია VialTweeter MultiSample ულტრაბგერითი 4 x 30 წამის განმავლობაში 100% ამპლიტუდაზე 2 წუთიანი ინტერვალით თითოეულ სონიკაციას შორის. ალტერნატიულად, ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი მიკრო წვერით, მაგ. UP200Ht S26d2-ით (3 x 30 წმ, 2 წთ. პაუზა ულტრაბგერითი ციკლებს შორის, 80% ამპლიტუდა) შეიძლება გამოყენებულ იქნას.
- შემდგომი გაწმენდის საფეხურებისთვის, ნიმუშები უნდა ინახებოდეს ყინულზე ან ალტერნატიულად ინახებოდეს -80°C-ზე შემდგომ დამუშავებამდე.
ულტრაბგერითი უჯრედის დამრღვევი UP200St მიკრო წვერით S26d2 ლიზისა და ცილის ექსტრაქციისთვის
ულტრაბგერითი ლიზისი ზუსტი ტემპერატურის კონტროლის ქვეშ
ტემპერატურის ზუსტი და საიმედო კონტროლი გადამწყვეტია ბიოლოგიური ნიმუშების დამუშავებისას. მაღალი ტემპერატურა იწვევს ნიმუშებში თერმულად გამოწვეულ ცილების დეგრადაციას.
როგორც ყველა მექანიკური ნიმუშის მომზადების ტექნიკა, sonication ქმნის სითბოს. თუმცა, ნიმუშების ტემპერატურა კარგად შეიძლება კონტროლდებოდეს VialTweeter-ის გამოყენებისას. ჩვენ წარმოგიდგენთ სხვადასხვა ვარიანტს თქვენი ნიმუშების ტემპერატურის მონიტორინგისა და კონტროლისთვის, სანამ ამზადებთ მათ VialTweeter-ით და VialPress-ით ანალიზისთვის.
- ნიმუშის ტემპერატურის მონიტორინგი: ულტრაბგერითი პროცესორი UP200St, რომელიც მართავს VialTweeter-ს, აღჭურვილია ინტელექტუალური პროგრამული უზრუნველყოფით და ჩართვის ტემპერატურის სენსორით. შეაერთეთ ტემპერატურის სენსორი UP200St-ში და ჩადეთ ტემპერატურის სენსორის წვერი ნიმუშის ერთ-ერთ მილში. ციფრული ფერადი სენსორული დისპლეის საშუალებით შეგიძლიათ დააყენოთ UP200St-ის მენიუში სპეციფიკური ტემპერატურის დიაპაზონი თქვენი ნიმუშის გაჟონვისთვის. მაქსიმალური ტემპერატურის მიღწევისას ულტრაბგერითი ავტომატურად გაჩერდება და შეჩერდება მანამ, სანამ ნიმუშის ტემპერატურა არ დაიწევს დაყენებული ტემპერატურის Δ დაბალ მნიშვნელობამდე. შემდეგ ხმოვანი გამოსხივება ისევ ავტომატურად იწყება. ეს ჭკვიანი ფუნქცია ხელს უშლის სითბოს გამოწვეულ დეგრადაციას.
- VialTweeter-ის ბლოკი შეიძლება წინასწარ გაცივდეს. ჩადეთ VialTweeter-ის ბლოკი (მხოლოდ სონოტროდი გადამყვანის გარეშე!) მაცივარში ან საყინულეში, რათა წინასწარ გაცივდეს ტიტანის ბლოკი, რაც ხელს უწყობს ნიმუშის ტემპერატურის აწევის გადადებას. თუ შესაძლებელია, თავად ნიმუშიც შეიძლება წინასწარ გაცივდეს.
- გამოიყენეთ მშრალი ყინული გაციებისას სონიკაციის დროს. გამოიყენეთ არაღრმა უჯრა სავსე მშრალი ყინულით და მოათავსეთ VialTweeter ყინულზე ისე, რომ სითბო სწრაფად გაიფანტოს.
მომხმარებლები მთელ მსოფლიოში იყენებენ VialTweeter-ს და VialPress-ს ყოველდღიური ნიმუშის მომზადებისთვის ბიოლოგიურ, ბიოქიმიურ, სამედიცინო და კლინიკურ ლაბორატორიებში. UP200St პროცესორის ინტელექტუალური პროგრამული უზრუნველყოფა და ტემპერატურის კონტროლი, ტემპერატურა საიმედოდ კონტროლდება და აცილებულია თერმით გამოწვეული ნიმუშის დეგრადაცია. ულტრაბგერითი ნიმუშის მომზადება VialTweeter-ით და VialPress-ით იძლევა უაღრესად სანდო და გამეორებად შედეგებს!
იპოვეთ ოპტიმალური ულტრაბგერითი დამრღვევი თქვენი Lysis აპლიკაციისთვის
Hielscher Ultrasonics არის დიდი ხნის გამოცდილი მწარმოებელი მაღალი ხარისხის ულტრაბგერითი უჯრედების დამრღვევებისა და ჰომოგენიზატორების ლაბორატორიებისთვის, სკამების და სამრეწველო მასშტაბის სისტემებისთვის. თქვენი ბაქტერიული უჯრედების კულტურის ზომა, თქვენი კვლევის ან წარმოების მიზანი და უჯრედის მოცულობა საათში ან დღეში დასამუშავებლად არის აუცილებელი ფაქტორები თქვენი განაცხადისთვის ულტრაბგერითი უჯრედების სწორი დამრღვევის მოსაძებნად.
Hielscher Ultrasonics გთავაზობთ სხვადასხვა გადაწყვეტილებებს მრავალ ნიმუშის (10-მდე ფლაკონამდე VialTweeter-ით) და მასიური ნიმუშების (ანუ მიკროტიტრული ფირფიტები / ELISA ფირფიტები UIP400MTP-ით), ასევე კლასიკური ზონდის ტიპის ლაბორატორიული ულტრაბგერითი ერთდროული გაჟღერებისთვის. სიმძლავრის დონეები 50-დან 400 ვატამდე სრულად სამრეწველო ულტრაბგერითი პროცესორებისთვის 16000 ვატამდე ერთეულზე კომერციული უჯრედების დაშლისა და ცილების მოპოვებისთვის დიდ წარმოებაში. ყველა Hielscher ულტრაბგერითი აგებულია 24/7/365 ოპერაციისთვის სრული დატვირთვით. გამძლეობა და საიმედოობა ჩვენი ულტრაბგერითი მოწყობილობების ძირითადი მახასიათებლებია.
ყველა ციფრული ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი აღჭურვილია ჭკვიანი პროგრამული უზრუნველყოფით, ფერადი სენსორული დისპლეით და მონაცემთა ავტომატური პროტოკოლით, რაც ულტრაბგერითი მოწყობილობა ხელსაყრელ სამუშაო ინსტრუმენტად აქცევს ლაბორატორიულ და საწარმოო ობიექტებში.
შეგვატყობინეთ, რა ტიპის უჯრედები, რა მოცულობის, რა სიხშირით და რა სამიზნით გაქვთ თქვენი ბიოლოგიური ნიმუშების დამუშავება. ჩვენ გირჩევთ ულტრაბგერითი უჯრედების ყველაზე შესაფერის დამრღვევს თქვენი პროცესის მოთხოვნებისთვის.
ქვემოთ მოყვანილი ცხრილი გვაწვდის მითითებას ჩვენი ულტრაბგერითი სისტემების დამუშავების სავარაუდო სიმძლავრის შესახებ კომპაქტური ხელის ჰომოგენიზატორებიდან და MultiSample Ultrasonicators-დან სამრეწველო ულტრაბგერითი პროცესორებით კომერციული გამოყენებისთვის:
| სურათების მოცულობა | Დინების სიჩქარე | რეკომენდებული მოწყობილობები |
|---|---|---|
| 96 ჭაბურღილის / მიკროტიტრიანი ფირფიტები | na | UIP400MTP |
| 10 ფლაკონი 0.5-დან 1.5მლ-მდე | na | VialTweeter UP200 St |
| 0.01-დან 250მლ-მდე | 5-დან 100 მლ/წთ-მდე | UP50H |
| 0.01-დან 500მლ-მდე | 10-დან 200 მლ/წთ-მდე | UP100H |
| 10-დან 2000 მლ-მდე | 20-დან 400 მლ/წთ-მდე | UP200Ht, UP400 ქ |
| 0.1-დან 20ლ-მდე | 0.2-დან 4ლ/წთ-მდე | UIP2000hdT |
| 10-დან 100 ლ-მდე | 2-დან 10ლ/წთ-მდე | UIP4000hdT |
| na | 10-დან 100ლ/წთ-მდე | UIP16000 |
| na | უფრო დიდი | კასეტური UIP16000 |
Დაგვიკავშირდით! / Გვკითხე ჩვენ!
UIP400MTP ფირფიტის სონიკატორი მაღალი გამტარუნარიანობის უჯრედების დარღვევისთვის 96 ჭაბურღილ ფირფიტებში
ულტრაბგერითი UP200Ht 2მმ მიკროწვერით S26d2 მცირე ნიმუშების სონიკაციისთვის
წაიკითხეთ მეტი იმის შესახებ, თუ როგორ შეგიძლიათ გამოიყენოთ თქვენი ულტრაბგერითი ქსოვილის ჰომოგენიზატორი ბუფერული ხსნარების ეფექტური და საიმედო მომზადებისთვის!
ფაქტები, რომელთა ცოდნაც ღირს
ეშერიხია კოლის ბაქტერია
Escherichia coli არის ბაქტერიის ტიპი, რომელიც არ წარმოადგენს სპორას, გრამუარყოფითს და ხასიათდება სწორი ღეროს სახით. E.coli ბაქტერია იმყოფება ადამიანისა და ცხოველების გარემოში, საკვებსა და ნაწლავებში. E. coli ჩვეულებრივ მოძრავია პერიტრიხული დროშების გამოყენებით, მაგრამ არის არამოძრავი ტიპებიც. E.coli არის ეგრეთ წოდებული ფაკულტატურად ანაერობული ქიმიოორგანოტროფული ორგანიზმები, რაც ნიშნავს, რომ მათ შეუძლიათ როგორც რესპირაციული, ასევე ფერმენტული მეტაბოლიზმი. E.coli-ის ტიპების უმეტესობა კეთილთვისებიანია და ასრულებს სასარგებლო ფუნქციებს ორგანიზმში, მაგ., თრგუნავს მავნე ბაქტერიების სახეობების ზრდას, ვიტამინების სინთეზს და ა.შ.
Escherichia coli ბაქტერიების ე.წ. B ტიპის უჯრედები წარმოადგენს E.coli შტამების სპეციალურ კატეგორიას, რომლებიც ფართოდ გამოიყენება კვლევებში ისეთი მექანიზმების გამოსაკვლევად, როგორიცაა ბაქტერიოფაგების მგრძნობელობა ან შეზღუდვა-მოდიფიკაციის სისტემები. გარდა ამისა, E.coli ბაქტერია ფასდება, როგორც საიმედო მუშა ცილის ექსპრესიისთვის ბიოტექნოლოგიისა და სიცოცხლის მეცნიერების ლაბორატორიებში. მაგალითად, E.coli გამოიყენება ისეთი ნაერთების სინთეზირებისთვის, როგორიცაა ცილები და ოლიგოსაქარიდები სამრეწველო მასშტაბით. სპეციფიკური მახასიათებლების გამო, როგორიცაა პროტეაზას დეფიციტი, დაბალი აცეტატის წარმოება გლუკოზის მაღალ დონეზე და გაძლიერებული გამტარიანობა, E. coli B უჯრედები ყველაზე ხშირად გამოიყენება მასპინძელი უჯრედები გენმოდიფიცირებული ცილების წარმოებისთვის.
რეკომბინანტული ცილა
რეკომბინანტული ცილები (rProt) მნიშვნელოვან მნიშვნელობას იძენს მრავალფეროვან ფილიალებში, მათ შორის ქიმიურ წარმოებაში, ფარმაცევტულ, კოსმეტიკურ, ადამიანისა და ცხოველების მედიცინაში, სოფლის მეურნეობაში, საკვებში და ნარჩენების დამუშავების ინდუსტრიებში.
რეკომბინანტული ცილის წარმოება მოითხოვს გამოხატვის სისტემის გამოყენებას. როგორც რეკომბინანტული დნმ-ის წარმოქმნის უჯრედული სისტემების გამომხატველი, შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც პროკარიოტული, ასევე ევკარიოტული უჯრედები. მიუხედავად იმისა, რომ ბაქტერიული უჯრედი ყველაზე ფართოდ გამოიყენება ცილების გამოხატვისთვის ფაქტორების გამო, როგორიცაა დაბალი ღირებულება, მარტივი მასშტაბირება და მედიის მარტივი პირობები, ძუძუმწოვრების, საფუარის, წყალმცენარეების, მწერებისგან და უჯრედებისგან თავისუფალი სისტემები არის ალტერნატივები. ცილის ტიპი, ფუნქციური აქტივობა, ისევე როგორც გამოხატული ცილის საჭირო გამოსავალი გავლენას ახდენს ცილის ექსპრესიისთვის გამოყენებული უჯრედული სისტემის შერჩევაზე.
რეკომბინანტული ცილის გამოხატვის მიზნით, კონკრეტული უჯრედი უნდა გადაიტანოს დნმ-ის ვექტორით, რომელიც შეიცავს რეკომბინანტული დნმ-ის შაბლონს. შაბლონით გადატანილი უჯრედები შემდეგ კულტივირებულია. უჯრედული მექანიზმის შედეგად უჯრედები ტრანსკრიფებენ და თარგმნიან ინტერესის პროტეინს, რითაც წარმოქმნიან მიზანმიმართულ პროტეინს.
იმის გამო, რომ გამოხატული ცილები უჯრედულ მატრიქსშია მოქცეული, უჯრედი უნდა იყოს ლიზირებული (დარღვევა და დაშლა) ცილების გასათავისუფლებლად. შემდგომი გაწმენდის ეტაპზე ცილა გამოიყოფა და იწმინდება.
პირველი რეკომბინანტული ცილა, რომელიც გამოიყენება მკურნალობაში, იყო ადამიანის რეკომბინანტული ინსულინი 1982 წელს. დღესდღეობით, მსოფლიოში 170-ზე მეტი სახის რეკომბინანტული ცილა იწარმოება სამედიცინო სამკურნალოდ. მედიცინაში გამოყენებული რეკომბინანტული პროტეინებია, მაგალითად, რეკომბინანტული ჰორმონები, ინტერფერონები, ინტერლეიკინები, ზრდის ფაქტორები, სიმსივნის ნეკროზის ფაქტორები, სისხლის შედედების ფაქტორები, თრომბოლიზური პრეპარატები და ფერმენტები ისეთი ძირითადი დაავადებების სამკურნალოდ, როგორიცაა დიაბეტი, ჯუჯა, მიოკარდიუმის ინფარქტი, გულის შეგუბებითი უკმარისობა. ცერებრალური აპოპლექსია, გაფანტული სკლეროზი, ნეიტროპენია, თრომბოციტოპენია, ანემია, ჰეპატიტი, რევმატოიდული ართრიტი, ასთმა, კრონის დაავადება და კიბოს თერაპია. (შდრ. Phuc V. Pham, Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
ლიტერატურა / ლიტერატურა
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter sonicator 10 ნიმუშის ერთდროული გაჟღერებისთვის, მაგ. BL21 უჯრედების დარღვევისთვის
მაღალი ხარისხის ულტრაბგერითი! Hielscher-ის პროდუქციის ასორტიმენტი მოიცავს სრულ სპექტრს კომპაქტური ლაბორატორიული ულტრაბგერითი აპარატიდან სკამის ზედა ერთეულებამდე სრულ ინდუსტრიულ ულტრაბგერით სისტემებამდე.