Drosophila melanogaster ფართოდ გამოიყენება ლაბორატორიებში, როგორც მოდელის ორგანიზმი. ამიტომ, ხშირად უნდა ჩატარდეს წინასწარი ანალიტიკური ეტაპები, როგორიცაა ლიზი, უჯრედის მოშლა, ცილის მოპოვება და Drosophila melanogaster ნიმუშების დნმ-ის გადაკვეთა. ულტრაბგერითი დემმბრატორი საიმედო და ეფექტურია და მათი გამოყენება შესაძლებელია სხვადასხვა დავალებების შესასრულებლად, როგორიცაა ლიზი, ცილის მოპოვება ან დნმ-ის ფრაგმენტაცია მარტივად, მხოლოდ ულტრაბგერითი პროცესის პარამეტრების რეგულირებით. ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები ამრიგად მოქნილი იარაღები არიან, რომელთა ფართო სპექტრია.

ულტრაბგერითი ლიზი და პროტეინის მოპოვება

ლიზი, უჯრედის ხსნა, ქსოვილის ჰომოგენიზაცია და ცილის მოპოვება არის ულტრაბგერითი დემმბრატორების ბიოლოგიური ლაბორატორიების ტიპიური ამოცანები. ულტრაბგერითი დამშლელები და უჯრედების დამშლელები კარგად შეეფერება ცხოველური ქსოვილების, მწერების (მაგ., Drosophila melanogaster, C. elegans) ან მცენარის ნიმუშების ჰომოგენიზაციას. ულტრასონიკაციის შემდგომი გამოყენებაა უჯრედების სუსპენზიებისა და მარცვლების ლიზირება, ასევე უჯრედშიდა ცილების მოპოვება.
ულტრაბგერითი ლიზი და ცილის მოპოვება ძალზე საიმედო და განმეორებადი პროცესებია, რომელთა შესრულება შესაძლებელია დადგენილი პროტოკოლების საფუძველზე. მას შემდეგ, რაც ულტრაბგერითი პროცესის ინტენსივობა შეიძლება ზუსტად დაარეგულიროთ სონიფიკაციის ისეთი პარამეტრების საშუალებით, როგორიცაა ამპლიტუდა, ციკლი / პულსის რეჟიმი, ტემპერატურა და ნიმუშის მოცულობა, ერთხელ დადასტურებული პროტოკოლების განმეორება შეიძლება იგივე შედეგით.

ულტრაბგერითი დნმ და რნმ ფრაგმენტაცია

უჯრედის ლიზისისა და ცილის მოპოვების შემდეგ, ნიმუშის მომზადების საერთო აუცილებელი ეტაპია დნმ-ის, რნმ-ის და ქრომატინის მოკვეთა და დაქუცმაცება, მაგ. დნმ და რნმ ფრაგმენტაციის საიმედოდ მიღწევა შესაძლებელია კოვალენტური ობლიგაციების გაწყვეტით, რომლებიც დნმ-ს ფიზიკურ ძალებთან ერთად ატარებენ. ფიზიკური მაკრატლის გამოყენებით, როგორიცაა მატონიზირება, თავდაპირველად დნმ – ის ძაფები იშლება, შემდეგ კი დნმ – ის ფრაგმენტი ხდება უფრო პატარა ნაჭრებად.
ულტრაბგერითი დნმ – ის ფრაგმენტაცია საიმედო და ეფექტურია მიზნობრივი სიგრძის დნმ – ის გადაჭრაში, მაგ. ულტრაბგერითი დნმ – ის ფრაგმენტაციის ძირითადი უპირატესობები მოიცავს ულტრაბგერითი პროცესის პარამეტრების და ინტენსივობის ზუსტ კონტროლს. ულტრაბგერითი პროცესის პარამეტრების დარეგულირება შესაძლებელია ზუსტად sonition ინტენსივობის, ციკლებისა და დროის მიხედვით. ეს საშუალებას იძლევა შეიქმნას სასურველი დნმ ზომები და მიზნობრივი დნმ სიგრძე შეიძლება საიმედოდ წარმოიქმნას, ისევე როგორც გამრავლება. ულტრაბგერითი დნმ-ის გადაკვეთა ასევე იდეალურია მაღალი მოლეკულური წონის დნმ-ის ფრაგმენტების შესაქმნელად.

პროტოკოლები Drosophila melanogaster- ის ულტრაბგერითი ლიზისისთვის

ქვემოთ შეგიძლიათ ნახოთ სხვადასხვა პროტოკოლები ულტრაბგერითი დახმარებით ლიზისის, ცილის მოპოვებისა და დროსოფილას ნიმუშების დნმ-ის ან ქრომატინის ფრაგმენტაციის შესახებ.

ულტრაბგერითი ლიზისი ჯვარედინი დამაკავშირებელი იმუნოპროდუქტების (CLIP) ანალიზისთვის

CLIP ანალიზი შესრულდა, როგორც ადრე იყო ნათქვამი, გარკვეული ცვლილებებით. 0– დან 1 დღემდე ველური ტიპის მდედრობითი სქესის დაახლოებით 20 მგ საკვერცხეები გადაკვეთა UV– ზე (3 × 2000 მკჯ / სმ 2), ჰომოგენიზირდა ყინულზე 1 მლ RCB ბუფერში (50 მმ HEPES pH 7,4, 200 მლ NaCl, 2,5 მმ MgCl2, 0,1% ტრიტონის X-100, 250 მმ საქაროზა, 1 მმ DTT, 1 × EDTA თავისუფალი პროტეაზას ინჰიბიტორები, 1 მმ PMSF), რომელსაც ემატება 300 U RNAseOUT და ათავსებს ყინულზე 30 წთ. ჰომოგენატი გაასუფთავეს ყინულზე, 80% ენერგიით, ხუთჯერ 20 წამში და 60 წმ დანარჩენი შორის Hielscher ულტრაბგერითი პროცესორის გამოყენებით UP100H (100 W, 30 kHz) და ცენტრიფუგირებული (16000 × გ 5 წთ 4 ° C ტემპერატურაზე). ხსნადი ექსტრაქტი გაიწმინდა 20 მკლ Protein-G დინაბანით 20 წთ 4 ° C ტემპერატურაზე. იმუნობლოტირებისთვის სინჯების ამოღების და RNA შეყვანის რაოდენობის (1%) შემდეგ, HP1 იმუნოპესიტირებული იქნა ანტი-HP1 9A9 ანტისხეულებით 450 მკლ წინასწარ გაწმენდილი ექსტრაქტით 4 საათის განმავლობაში, ინკუბაციით 50 მკლ Protein-G დინალექებით. იმუნოპროდუქტები 4 ჯერ დაიბანეთ RCB– ით. იმუნოციპირებული RNA- ების გასათავისუფლებლად, მარცვლოვან მძივებს ადუღებენ 100 მკლ UltraPure DEPC დამუშავებულ წყალში 5 წთ. 900 μL Qiazol რეაგენტი დაემატა ზედმეტ ნივთიერებას, რომელიც ამოღებულია RNA მომზადებისთვის. RNA გაწმენდილი იქნა გამოყენებული, როგორც შაბლონი cDNA- ს სინთეზისთვის, ოლიგო dT, შემთხვევითი ჰექსამერების და SuperScript საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას III მწარმოებლის პროტოკოლის შესაბამისად.
(კასალე და სხვ. 2019)

ულტრაბგერითი ლიზისი ქრომატინის იმუნოპროდუქტების ანალიზისთვის

ქრომატინის იმუნოპროდუქტი შესრულდა მენეს მიერ მცირედი ცვლილებებით აღწერილი მეთოდის შესაბამისად. 0– დან 1 დღემდე ველური ტიპის მდედრობითი სქესის დაახლოებით 20 მგ საკვერცხეები ჰომოგენიზირდა 1 მლ NEB ბუფერში (10 მმ HEPES-Na pH 8,0, 10 მმ NaCl, 0,1 მმ EGTA-Na pH 8, 0,5 მმ EDTA-Na pH 8, 1 მმ DTT, 0,5% NP-40, 0,5 მმ სპერმიდინი, 0,15 მმ სპერმინი, 1 × EDTA თავისუფალი პროტეაზის სრული ინჰიბიტორები) ჰომოგენიზატორით / ჩაძირვის დისპერსიით 1 წთ (3000 წთ / საათში). ჰომოგენიტი გადაიტანეს წინასწარ გაციებულ შუშის ჭრილში და 15 სრული პარალიზი გამოიყენეს მჭიდრო პესტელით. შემდეგ თავისუფალი ბირთვების ცენტრიფუგა მოხდა 6000xg ტემპერატურაზე 10 წთ-ის განმავლობაში 4 ° C ტემპერატურაზე. ბირთვების შემცველი მარცვლები განახლდა 1 მლ NEB– ში და ცენტრიფუგირებული იქნა 20000 × გ – ზე 20 წთ საქაროზას გრადიენტზე (0,65 მლ 1,6 მ საქაროზა NEB– ში, 0,35 მლ 0,8 მ საქაროზა NEB– ში). ნალექი გადაიტანეს 1 მლ NEB– ში და ფორმალდეჰიდში, საბოლოო კონცენტრაციამდე 1%. ბირთვები ერთმანეთთან კავშირში იყო 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე და ითიშებოდა 1/10 მოცულობით 1,375 მ გლიცინის დამატებით. ბირთვების შეგროვება მოხდა ცენტრიფუგაციით 6000 × გ 5 წუთის განმავლობაში. ბირთვები ორჯერ გარეცხილია 1 მლ NEB– ში და გადაიტანეს 1 მლ ლიზის ბუფერში (15 მმ HEPES-Na pH 7,6, 140 მმ NaCl, 0,5 მმ EGTA, 1 მმ EDTA pH– ზე 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na დეოქსიქოლატი, 0,1% SDS, 0,5% N- ლაუროილსარკოზინი და 1 × EDTA თავისუფალი პროტეაზის სრული ინჰიბიტორები). ბირთვების დამუშავება მოხდა Hielscher ულტრაბგერითი პროცესორის გამოყენებით UP100H (100 W, 30 kHz) ექვსჯერ 20 წამი და 1 წუთი ყინულზე. Sonicated ბირთვების ცენტრიფუგირება მოხდა 13000 × გ 4 წუთის განმავლობაში 4 ° C ტემპერატურაზე. გაჟღენთილი ქრომატინის უმეტესობა იყო 500-დან 1000 ფუძის წყვილი (შპტ) სიგრძით. თითოეული იმუნოპროდუქციისთვის 15 მკგ ქრომატინის ინკუბაცია ჩატარდა 10 მკგ HP1 9A9 მონოკლონური ანტისხეულის არსებობით (3 საათი 4 ° C ტემპერატურაზე მბრუნავ ბორბალში). შემდეგ დაემატა 50 მკლ dynabeads ცილის G და ინკუბაცია გაგრძელდა მთელი ღამის განმავლობაში 4 ° C ტემპერატურაზე. ზედმეტი ნივთიერებები გადააგდეს და ნიმუშები გარეცხეს ორჯერ ლიზის ბუფერში (თითოეული რეცხვა 15 წთ 4 ° C ტემპერატურაზე) და ორჯერ TE ბუფერში (1 მმ EDTA, 10 მმ TrisHCl pH 8). ქრომატინი გამოიყოფა მძივებისგან ორ ეტაპად; პირველი 100 მკლ ელუციონის ბუფერული 1 – ში (10 მმ EDTA, 1% SDS, 50 მმ TrisHCl pH 8 – ზე) 65 ° C ტემპერატურაზე 15 წუთის განმავლობაში, რასაც მოჰყვა ცენტრალიზება და ზედმეტი ზედაპირის აღდგენა. მძივების მასალა ხელახლა მოიპოვეს 100 მკლ TE + 0.67% SDS- ში. კომბინირებული ელატი (200 მკლ) ინკუბაციით მოხდა მთელი ღამით 65 ° C ტემპერატურაზე, რომ გადალახოს ჯვარედინი კავშირები და დამუშავდეს 50 მკგ / მლ RNaseA 15 წუთის განმავლობაში 65 ° C და 500 მკგ / მლ Proteinase K 3 საათის განმავლობაში 65 ° C ტემპერატურაზე. ნიმუშები მოიპოვეს ფენოლ-ქლოროფორმმა და ააფრქვინეს ეთანოლი. დნმ გადაიყვანეს 25 მკლ წყალში. მოლეკულური ანალიზების მაქსიმალურად გაზრდის მიზნით, დნმ-ის იმუნოციტირებით, კანდიდატი გენები გამრავლდა წყვილებში ოპტიმიზირებული დუპლექსი-PCR პროტოკოლის საშუალებით, ორი განსხვავებული პრაიმერის გამოყენებით, ერთნაირი რეაქციის დროს დნობის მსგავსი ტემპერატურის მქონე.
(კასალე და სხვ. 2019)
 

მაღალი ხარისხის ულტრაბგერითი უჯრედის გამშლელი საშუალებები ბიოლოგიური ნიმუშებისთვის

Hielscher Ultrasonics არის თქვენი დიდი ხნის პარტნიორი, როდესაც საქმე ეხება მაღალპროდუქტიულ ულტრასონიკატორებს უჯრედის მოშლის, ლიზისის, ცილის მოპოვების, დნმ-ის, რნმ-ის და ქრომატინის ფრაგმენტაციისთვის, ასევე ნიმუშის მომზადების სხვა წინასწარ ანალიზურ ეტაპებზე. ულტრაბგერითი ლაბორატორიის ჰომოგენიზატორების და ნიმუშის მოსამზადებელი დანადგარების სრულყოფილი პორტფელის შეთავაზებას, Hielscher- ს აქვს ულტრაბგერითი იდეალური მოწყობილობა თქვენი ბიოლოგიური გამოყენებისათვის და მოთხოვნებისთვის.
კლასიკური გამოძიების ტიპის ულტრაბგერითი მიკრო წვერით, როგორიცაა UP200St (200W; იხილეთ სურათი მარცხნივ) ან ულტრაბგერითი ნიმუშის მომზადების ერთეული VialTweeter ან UP200ST_TD_CupHorn VialHolder– ით არის საყვარელი მოდელები კვლევით და ანალიტიკურ ლაბორატორიებში. კლასიკური ულტრაბგერითი ზონდი იდეალურია, როდესაც მომზადდება ნაკლები ნიმუშების ლიზირება, მოპოვება ან დაქუცმაცება. ნიმუშის მოსამზადებელი ერთეულები VialTweeter და UP200St_TD_CupHorn საშუალებას გაძლევთ ერთდროულად გაჟღენთილიყო 10 ან 5 ფლაკონი, შესაბამისად.
თუ ნიმუშის მაღალი რიცხვების დამუშავება (მაგ., 96 ჭაბურღილის ფირფიტები, მიკროტიტერის ფირფიტები და ა.შ.) უნდა დამუშავდეს, UIP400MTP არის იდეალური დამუშავება. UIP400MTP ფუნქციონირებს უფრო დიდი კუპონის მსგავსად, რომელიც წყლით არის სავსე და აქვს საკმარისი სივრცე მიკრო-ჭურის ფირფიტების დასაკავებლად. იკვებება 400 ვატიანი ძლიერი ულტრაბგერითი პროცესორით, UIP400MTP აწვდის მრავალ ჭაბურღილის ფირების ძალზე ერთგვაროვან და ინტენსიურ დამუშავებას უჯრედების, ლიზირების ნიმუშების, მარცვლების ხსნარის, ცილების ექსტრაქტის ან დნმ-ის ამოღების მიზნით.

ზუსტი კონტროლი Smart პროგრამის საშუალებით

Hielscher sonication- ის ყველა გადაწყვეტილება 200 ვატიდან ზემოთ აღჭურვილია ციფრული ფერადი სენსორული ეკრანითა და ინტელექტუალური პროგრამით. სმარტ მონაცემთა პროტოკოლირების საშუალებით, ულტრაბგერითი პროცესის ყველა პარამეტრი ავტომატურად ინახება როგორც CSV ფაილი ჩამონტაჟებულ SD ბარათზე, როგორც კი ულტრაბგერითი ამოქმედდება. ეს კვლევას და პროტოკოლის გაფორმებას ბევრად უფრო მოსახერხებელს ხდის. სონიკაციის საცდელების ან ნიმუშის მომზადების შემდეგ შეგიძლიათ უბრალოდ გადახედოთ სონიკაციის თითოეული აწარმოების სონიფიკაციის პარამეტრებს და შეადაროთ ისინი.
ინტუიციური მენიუს საშუალებით, მრავალი პარამეტრი შეიძლება დაყენებული იყოს გაჟღერებამდე: მაგალითად, ნიმუში ტემპერატურის კონტროლისა და მისი თერმული დეგრადაციის თავიდან ასაცილებლად, შესაძლებელია დაყენდეს ნიმუშის ტემპერატურის ზედა ზღვარი. დანამატის ტემპერატურის სენსორი, რომელსაც გააჩნია ულტრაბგერითი აპარატი, იძლევა ულტრაბგერითი პროცესორის უკუკავშირის ზონების რეალურ ტემპერატურაზე. ზედა ტემპერატურის ზღვრის მიღწევისას, ულტრაბგერითი მოწყობილობა შეჩერდება, სანამ isT დაყენებული ქვედა ზღვარი არ მიიღწევა და ავტომატურად იწყებს სიგნალს ისევ.
თუ საჭიროა სპეციფიკური ენერგიის შეყვანა სონიკაციით, შეგიძლიათ წინასწარ განსაზღვროთ სონიფიკაციის გაშვების ულტრაბგერითი ენერგია. რა თქმა უნდა, ულტრაბგერითი პულსაციისა და ციკლის რეჟიმის ინდივიდუალურად დაყენებაც შეიძლება.
თქვენი ყველაზე წარმატებული გამაძლიერებელი პარამეტრების ხელახლა გამოსაყენებლად, შეგიძლიათ შეინახოთ სხვადასხვა გამახმიანების რეჟიმები (მაგ., სონიკაციის დრო, ინტენსივობა, ციკლის რეჟიმი და ა.შ.), როგორც წინასწარ დაყენებული რეჟიმები, რათა ისინი იყოს მარტივი და სწრაფად დაიწყოს თავიდან.
უფრო მოსახერხებელი ფუნქციონირებისთვის, ყველა ციფრული ულტრაბგერითი დანადგარის მართვა შესაძლებელია ბრაუზერის დისტანციური მართვის საშუალებით ნებისმიერ საერთო ბრაუზერში (მაგალითად, InternetExplorer, Safari, Chrome და ა.შ.). LAN კავშირი არის მარტივი დანამატის დაყენება და არ საჭიროებს დამატებით პროგრამულ ინსტალაციას.
Hielscher– ის ჩვენთვის ცნობილია, რომ ბიოლოგიური ნიმუშების წარმატებული გამაგრება მოითხოვს სიზუსტეს და განმეორებადობას. ამიტომ, ჩვენი ულტრაბგერითი მოწყობილობები შევქმენით, როგორც ჭკვიანი მოწყობილობები, ყველა იმ ფუნქციით, რაც საშუალებას მისცემს ეფექტური, საიმედო, განმეორებადი და მოსახერხებელი ნიმუშის მომზადებას.

ქვემოთ მოყვანილი ცხრილი გიჩვენებთ ულტრაბგერითი სისტემების სავარაუდო დამუშავების შესაძლებლობას ულტრაბგერითი მიკრო რჩევებიდან და კლასიკური ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორებიდან დაწყებული MultiSample ულტრაბგერითი დამონტაჟებით, მრავალრიცხოვანი ნიმუშების მოსახერხებელი და საიმედო მოსამზადებლად: