Drosophila melanogaster-ის ნიმუშების ულტრაბგერითი ლიზისი

Drosophila melanogaster ფართოდ გამოიყენება ლაბორატორიებში როგორც მოდელური ორგანიზმი. ამიტომ, წინა-ანალიტიკური მომზადების ეტაპები, როგორიცაა ლიზისი, უჯრედების დისრუფცია, ცილების ექსტრაქცია და Drosophila melanogaster-ის ნიმუშების დნმ-ის ძვრა, ხშირად უნდა განხორციელდეს. ულტრაბგერითი დისმემბრატორები საიმედო და ეფექტურია და შეიძლება გამოყენებულ იქნას სხვადასხვა ამოცანის შესასრულებლად, როგორიცაა ლიზისი, ცილების ექსტრაქცია ან დნმ-ის ფრაგმენტაცია მარტივად, მხოლოდ ულტრაბგერითი პროცესის პარამეტრების კორექტირებით. ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები ამრიგად, არის მოქნილი ინსტრუმენტები გამოყენების ფართო სპექტრით.

ულტრაბგერითი ლიზისი და ცილების ექსტრაქცია

ლიზისი, უჯრედების სოლიბილიზაცია, ქსოვილების ჰომოგენიზაცია და ცილების ექსტრაქცია არის ტიპური ამოცანები ულტრაბგერითი დისმემბრატორებისთვის ბიოლოგიურ ლაბორატორიებში. ულტრაბგერითი დისმემბრატორები და უჯრედების დისრუპტორები კარგად არის შესაფერისი ცხოველური ქსოვილების, მწერების (მაგ., Drosophila melanogaster, C. elegans) ან მცენარეული ეგზემპლარების ჰომოგენიზაციისთვის. ულტრაბგერითი დამუშავების შემდგომი გამოყენებებია უჯრედული სუსპენზიებისა და პელეტების ლიზისი, ასევე უჯრედშიდა ცილების ექსტრაქცია.
ულტრაბგერითი ლიზისი და ცილების ექსტრაქცია არის მაღალსაიმედო და რეპროდუქციული პროცესები, რომლებიც შეიძლება განხორციელდეს დამტკიცებული პროტოკოლების საფუძველზე. რადგან ულტრაბგერითი პროცესის ინტენსივობა ზუსტად შეიძლება კორექტირდეს ულტრაბგერითი დამუშავების პარამეტრების მეშვეობით, როგორიცაა ამპლიტუდა, ციკლური / იმპულსური რეჟიმი, ტემპერატურა და ნიმუშის მოცულობა, ერთხელ დამტკიცებული პროტოკოლები შეიძლება განმეორდეს იგივე შედეგით მრავალჯერ.

ულტრაბგერითი დნმ-ის და რნმ-ის ფრაგმენტაცია

უჯრედული ლიზისისა და ცილების ექსტრაქციის შემდეგ, ნიმუშის მომზადების ხშირად საჭირო ეტაპია დნმ-ის, რნმ-ის და ქრომატინის ძვრა და ფრაგმენტაცია, მაგ. ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაციის (ChIP) წინ. დნმ-ის და რნმ-ის ფრაგმენტაცია შეიძლება საიმედოდ მიღწეულ იქნას დნმ-ს ერთად მაკავშირებელი კოვალენტური ბმების გაწყვეტით ფიზიკური ძალების მეშვეობით. ფიზიკური ძვრის გამოყენებით, როგორიცაა ულტრაბგერითი დამუშავება, თავდაპირველად დნმ-ის ჯაჭვები წყდება, შემდეგ კი დნმ ფრაგმენტირდება უფრო მცირე ნაწილებად.
ულტრაბგერითი დნმ-ის ფრაგმენტაცია საიმედო და ეფექტურია დნმ-ის მიზნობრივ სიგრძემდე დასაძვრად, მაგ. 500bp (ფუძეთა წყვილი). ულტრაბგერითი დნმ-ის ფრაგმენტაციის მთავარი უპირატესობები მოიცავს ულტრაბგერითი პროცესის პარამეტრებისა და ინტენსივობის ზუსტ კონტროლს. ულტრაბგერითი პროცესის პარამეტრები შეიძლება კორექტირდეს ულტრაბგერითი დამუშავების ინტენსივობის, ციკლების და დროის ზუსტი რეგულირებით. ეს საშუალებას იძლევა შეიქმნას სასურველი დნმ-ის ზომები და მიზნობრივი დნმ-ის სიგრძე შეიძლება საიმედოდ მიღწეულ იქნას, ასევე რეპროდუცირებულ იქნას. ულტრაბგერითი დნმ-ის ძვრა ასევე იდეალურია მაღალმოლეკულური დნმ-ის ფრაგმენტების შესაქმნელად.

პროტოკოლები Drosophila melanogaster-ის ულტრაბგერითი ლიზისისთვის

ქვემოთ თქვენ შეგიძლიათ იპოვოთ სხვადასხვა პროტოკოლი Drosophila-ს ნიმუშების ულტრაბგერითი თანხლებით ლიზისისთვის, ცილების ექსტრაქციისთვის და დნმ-ის ან ქრომატინის ფრაგმენტაციისთვის.

ულტრაბგერითი ლიზისი ჯვარედინი ბმის იმუნოპრეციპიტაციის (CLIP) ანალიზისთვის

CLIP ანალიზი ჩატარდა ადრე აღწერილი მეთოდით, ზოგიერთი ცვლილებით. დაახლოებით 20 mg საკვერცხეები 0-დან 1 დღემდე ასაკის ველური ტიპის მდედრებიდან იყო UV-ით ჯვარედინად დაკავშირებული (3 × 2000 μJ/cm2), ჰომოგენიზებული იყო ყინულზე 1 mL RCB ბუფერში (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM სუკროზა, 1 mM DTT, 1× EDTA-თავისუფალი სრული პროტეაზის ინჰიბიტორები, 1 mM PMSF), დამატებული 300 U RNAseOUT და დატოვებული იყო ყინულზე 30 min-ის განმავლობაში. ჰომოგენატი იყო ულტრაბგერითად დამუშავებული ყინულზე, 80% სიმძლავრეზე, ხუთჯერ 20 s იმპულსებით, 60 s შესვენებით შუალედში, Hielscher-ის ულტრაბგერითი პროცესორის გამოყენებით UP100H (100 W, 30 kHz) და ცენტრიფუგირდება (16 000 × g, 5 წთ, 4°C). ხსნადი ექსტრაქტი წინასწარ გაიწმინდა 20 μl Protein-G dynabeads-ით 20 წთ, 4°C-ზე. იმუნობლოტინგისა და RNA შესვლის რაოდენობის დადგენისთვის (1%) ნიმუშების ამოღების შემდეგ, HP1 იმუნოპრეციპიტირდა 450 μl წინასწარ გაწმენდილი ექსტრაქტიდან anti-HP1 9A9 ანტისხეულის გამოყენებით, ინკუბაციით 4 სთ, 50 μl Protein-G dynabeads-თან. იმუნოპრეციპიტატები 4-ჯერ გაირეცხა RCB-ით. იმუნოპრეციპიტირებული RNAs-ის ელუციისთვის, დანალექი მარცვლები 100 μL UltraPure DEPC-დამუშავებულ წყალში 5 წთ-ის განმავლობაში ადუღდა. 900 μL Qiazol Reagent დაემატა ზედა ფენას (supernatant), რომელიც მიღებული იქნა RNA-ს მოსამზადებლად. გაწმენდილი RNA გამოყენებული იქნა როგორც მატრიცა cDNA-ს სინთეზისთვის oligo dT-ის, შემთხვევითი ჰექსამერების და SuperScript reverse transcriptase III-ის გამოყენებით, მწარმოებლის პროტოკოლის შესაბამისად.
(Cassale et al. 2019)

ულტრაბგერითი ლიზის ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაციის ანალიზისთვის

ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაცია ჩატარდა Menet-ის მიერ აღწერილი მეთოდის შესაბამისად, მცირე ცვლილებებით. დაახლოებით 20 mg საკვერცხეები 0-დან 1 დღემდე ასაკის ველური ტიპის მდედრებიდან ჰომოგენიზირდება 1 mL NEB ბუფერში (10 mM HEPES-Na pH 8,0-ზე, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na pH 8-ზე, 0,5 mM EDTA-Na pH 8-ზე, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM სპერმიდინი, 0,15 mM სპერმინი, 1× EDTA-თავისუფალი Complete Protease Inhibitors) ჰომოგენიზატორით / ჩაძირვადი დისპერგატორით 1 წთ (3000 rpm-ზე). ჰომოგენატი გადაიტანება წინასწარ გაცივებულ მინის dounce-ში და 15 სრული მოძრაობა შესრულდება მჭიდრო პესტლით. თავისუფალი ბირთვები შემდეგ ცენტრიფუგირდება 6000xg-ზე 10 წთ, 4°C-ზე. ბირთვების შემცველი ნალექები ხელახლა განიხსნება 1 mL NEB-ში და ცენტრიფუგირდება 20 000 × g-ზე 20 წთ საქაროზის გრადიენტზე (0,65 mL 1,6 M საქაროზა NEB-ში, 0,35 mL 0,8 M საქაროზა NEB-ში). ნალექი ხელახლა განიხსნება 1 mL NEB-ში და ფორმალდეჰიდში საბოლოო კონცენტრაციამდე 1%. ბირთვები დაჯვარედინდება 10 წთ ოთახის ტემპერატურაზე და შეჩერდება 1/10 მოცულობის 1,375 M გლიცინის დამატებით. ბირთვები მოიპოვება ცენტრიფუგირებით 6000 × g-ზე 5 წთ. ბირთვები ორჯერ გაირეცხება 1 mL NEB-ში და ხელახლა განიხსნება 1 mL ლიზის ბუფერში (15 mM HEPES-Na pH 7,6-ზე, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pH 8-ზე, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine და 1× EDTA-თავისუფალი Complete Protease Inhibitors). ბირთვები ულტრაბგერითად დამუშავდება Hielscher Ultrasonic Processor-ის გამოყენებით UP100H (100 W, 30 kHz) ექვსჯერ 20 წმ ჩართულ მდგომარეობაში და 1 წთ ყინულზე. ულტრაბგერითად დამუშავებული ბირთვები ცენტრიფუგირდება 13 000 × g-ზე 4 წთ, 4°C-ზე. ულტრაბგერითად დამუშავებული ქრომატინის უმეტესობა 500-დან 1000 ფუძე-წყვილამდე (bp) სიგრძის იყო. თითოეული იმუნოპრეციპიტაციისთვის, 15 μg ქრომატინი ინკუბირდება 10 μg HP1 9A9 მონოკლონური ანტისხეულის თანაობისას (3 სთ, 4°C-ზე მბრუნავ ბორბალზე). შემდეგ, 50 μl dynabeads protein G დაემატა და ინკუბაცია გაგრძელდა ღამით 4°C-ზე. ზედა ფენები (supernatants) გადაიღვარა და ნიმუშები ორჯერ გაირეცხა ლიზის ბუფერში (თითოეული რეცხვა 15 წთ, 4 °C-ზე) და ორჯერ TE ბუფერში (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pH 8-ზე). ქრომატინი ელუირდება მარცვლებიდან ორ ეტაპად; ჯერ 100 μl Eluition Buffer 1-ში (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pH 8-ზე) 65°C-ზე 15 წთ, შემდეგ ცენტრიფუგირება და ზედა ფენის მიღება. მარცვლების მასალა ხელახლა ექსტრაქციას ექვემდებარება 100 μl TE + 0,67% SDS-ში. გაერთიანებული ელუატი (200 μl) ინკუბირდება ღამით 65°C-ზე ჯვარედინი ბმების გასაუქმებლად და მუშავდება 50 μg/ml RNaseA-ით 15 წთ 65°C-ზე და 500 μg/ml Proteinase K-ით 3 სთ 65°C-ზე. ნიმუშები ფენოლ–ქლოროფორმით ექსტრაქციას ექვემდებარება და ეთანოლით პრეციპიტაციას. DNA ხელახლა განიხსნება 25 μl წყალში. იმუნოპრეციპიტირებული DNA-ს მოლეკულური ანალიზის მაქსიმიზაციისთვის, კანდიდატი გენები ამპლიფიცირდება წყვილებში ოპტიმიზებული duplex-PCR პროტოკოლის გამოყენებით, ორი განსხვავებული პრაიმერების ნაკრების გამოყენებით, რომლებსაც აქვთ მსგავსი დნობის ტემპერატურები ერთ რეაქციაში.
(Casale et al. 2019)

მაღალი წარმადობის ულტრაბგერითი უჯრედების დისრუპტორები ბიოლოგიური ნიმუშებისთვის

Hielscher Ultrasonics არის თქვენი მრავალწლიანი გამოცდილების მქონე პარტნიორი მაღალი წარმადობის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების სფეროში, რომლებიც გამოიყენება უჯრედების დისრუპციის, ლიზის, ცილების ექსტრაქციის, დნმ-ის, რნმ-ის და ქრომატინის ფრაგმენტაციის, ასევე სხვა წინა-ანალიტიკური ნიმუშების მომზადების ეტაპებისთვის. ულტრაბგერითი ლაბორატორიული ჰომოგენიზატორებისა და ნიმუშების მომზადების ერთეულების სრული პორტფოლიოს წყალობით, Hielscher-ს აქვს იდეალური ულტრაბგერითი მოწყობილობა თქვენი ბიოლოგიური გამოყენებისა და მოთხოვნებისთვის.
კლასიკური პრობის ტიპის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი მიკრო-წვერით, როგორიცაა UP200St (200W; იხ. სურათი მარცხნივ) ან ულტრაბგერითი ნიმუშების მომზადების ერთეულებიდან ერთ-ერთი VialTweeter ან UP200ST_TD_CupHorn VialHolder-ით, არის პოპულარული მოდელები სამეცნიერო და ანალიტიკურ ლაბორატორიებში. კლასიკური ულტრაბგერითი პრობი იდეალურია, როდესაც მცირე რაოდენობის ნიმუშები უნდა ლიზირდეს, ექსტრაქცია გაუკეთდეს ან ფრაგმენტაცია მოხდეს. ნიმუშების მომზადების ერთეულები VialTweeter და UP200St_TD_CupHorn საშუალებას იძლევა შესაბამისად, მაქსიმუმ 10 ან 5 ვიალი ერთდროულად დამუშავდეს ულტრაბგერით.
თუ საჭიროა მაღალი რაოდენობის ნიმუშების (მაგ. 96-კაროიანი თეფშები, მიკროტიტრაციული თეფშები და ა.შ.) დამუშავება, UIP400MTP არის იდეალური ულტრაბგერითი დამუშავების სისტემა. UIP400MTP ფუნქციონირებს როგორც უფრო დიდი ზომის cuphorn, რომელიც ივსება წყლით და აქვს საკმარისი სივრცე მიკრო-კაროიანი თეფშებისთვის. 400 ვატიანი მძლავრი ულტრაბგერითი პროცესორით აღჭურვილი UIP400MTP უზრუნველყოფს მრავალკაროიანი თეფშების ძალიან თანაბარ და ინტენსიურ ულტრაბგერით დამუშავებას, რათა მოხდეს უჯრედების დისრუპცია, ნიმუშების ლიზისი, ნალექის გახსნა, ცილების ექსტრაქცია ან დნმ-ის ფრაგმენტაცია.

ზუსტი კონტროლი ინტელექტუალური პროგრამული უზრუნველყოფის საშუალებით

ყველა Hielscher-ის ულტრაბგერითი დამუშავების სისტემა 200 ვატიდან ზევით აღჭურვილია ციფრული ფერადი სენსორული ეკრანითა და ინტელექტუალური პროგრამული უზრუნველყოფით. ინტელექტუალური მონაცემთა პროტოკოლირების საშუალებით, ყველა ულტრაბგერითი პროცესის პარამეტრი ავტომატურად ინახება CSV ფაილში ჩაშენებულ SD-ბარათზე ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორის ჩართვისთანავე. ეს მნიშვნელოვნად აადვილებს კვლევას და პროტოკოლირებას. ულტრაბგერითი დამუშავების ცდების ან ნიმუშების მომზადების შემდეგ, თქვენ შეგიძლიათ მარტივად გადახედოთ და შეადაროთ თითოეული ულტრაბგერითი დამუშავების ციკლის პარამეტრები.
ინტუიციური მენიუს საშუალებით, ულტრაბგერითი დამუშავების წინ შეიძლება წინასწარ დაინიშნოს მრავალი პარამეტრი: მაგალითად, ნიმუშში ტემპერატურის კონტროლისა და მისი თერმული დეგრადაციის თავიდან ასაცილებლად, შესაძლებელია ნიმუშის ტემპერატურის ზედა ზღვრის დაყენება. ჩასმვადი ტემპერატურის სენსორი, რომელიც მოდის ულტრაბგერით ერთეულთან ერთად, ულტრაბგერით პროცესორს აწვდის ინფორმაციას რეალური ულტრაბგერითი დამუშავების ტემპერატურის შესახებ. როდესაც ზედა ტემპერატურული ზღვარი მიიღწევა, ულტრაბგერითი მოწყობილობა წყვეტს მუშაობას, სანამ დაყენებული ∆T-ის ქვედა ზღვარი არ მიიღწევა, და შემდეგ ავტომატურად იწყებს ულტრაბგერით დამუშავებას.
თუ საჭიროა ულტრაბგერითი დამუშავება კონკრეტული ენერგიის შეტანით, თქვენ შეგიძლიათ წინასწარ დაინიშნოთ ულტრაბგერითი დამუშავების ციკლის საბოლოო ენერგია. რა თქმა უნდა, ულტრაბგერითი პულსაცია და ციკლური რეჟიმიც შესაძლებელია ინდივიდუალურად დაინიშნოს.
იმისათვის, რომ ხელახლა გამოიყენოთ თქვენს მიერ ყველაზე წარმატებული ულტრაბგერითი დამუშავების პარამეტრები, თქვენ შეგიძლიათ შეინახოთ სხვადასხვა ულტრაბგერითი დამუშავების რეჟიმები (მაგ. დამუშავების დრო, ინტენსივობა, ციკლური რეჟიმი და ა.შ.) როგორც წინასწარ დაყენებული რეჟიმები, რათა ისინი მარტივად და სწრაფად ხელახლა გააქტიურდეს.
უფრო მეტი ოპერაციული მოსახერხებლობისთვის, ყველა ციფრული ულტრაბგერითი ერთეული შეიძლება მართვად იყოს ბრაუზერის დისტანციური მართვის საშუალებით ნებისმიერ ჩვეულებრივ ბრაუზერში (მაგ., InternetExplorer, Safari, Chrome და ა.შ.). LAN კავშირი არის მარტივი plug-n-play კონფიგურაცია და არ საჭიროებს დამატებითი პროგრამული უზრუნველყოფის ინსტალირებას.
ჩვენ, Hielscher-ში, ვიცით, რომ ბიოლოგიური ნიმუშების წარმატებული ულტრაბგერითი დამუშავება მოითხოვს სიზუსტეს და გამეორებადობას. ამიტომ, ჩვენ შევქმენით ჩვენი ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები როგორც ინტელექტუალური მოწყობილობები ყველა ისეთი ფუნქციით, რომელიც უზრუნველყოფს ეფექტურ, საიმედო, გამეორებად და მოსახერხებელ ნიმუშების მომზადებას.

ქვემოთ მოცემული ცხრილი გაჩვენებთ ჩვენი ულტრაბგერითი სისტემების მიახლოებითი დამუშავების სიმძლავრის შესახებ, ულტრაბგერითი მიკრო-წვერებიდან და კლასიკური ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორებიდან დაწყებული, MultiSample ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორებით დამთავრებული, მრავალი ნიმუშის მოსახერხებელი და საიმედო მომზადებისთვის: