ულტრაბგერითი ნიმუშის მომზადება ELISA ანალიზებისთვის

ანალიზები, როგორიცაა ELISA, ფართოდ გამოიყენება in-vitro დიაგნოსტიკისთვის, დაავადებასთან დაკავშირებული ცილების აღმოჩენისა და ხარისხის კონტროლისთვის (მაგ. საკვების ალერგენების მონიტორინგი). ულტრაბგერითი ნიმუშის მომზადება არის სწრაფი, საიმედო და გამეორებადი ტექნიკა უჯრედების ლიზისა და უჯრედშიდა ცილების, დნმ-ის, რნმ-ისა და ორგანელების იზოლაციისთვის. Hielscher Ultrasonics სთავაზობს სხვადასხვა ულტრაბგერით გადაწყვეტილებებს ცალკეული ნიმუშების, მრავალი ვიალის, ასევე მიკროტიტრაციული პლანშეტებისა და 96-ჯიბიანი პლანშეტების მოსახერხებლად მოსამზადებლად.

ELISA – ფერმენტთან დაკავშირებული იმუნოსორბენტული ანალიზი

ELISA ნიშნავს ფერმენტთან დაკავშირებულ იმუნოსორბენტულ ანალიზს და არის ფართოდ გამოყენებადი ბიოქიმიური ანალიზის ტექნიკა ლიგანდთან დაკავშირების ანალიზების კატეგორიიდან. ELISA-ში, თხევადი ნიმუში ემატება სპეციალური დაკავშირების თვისებების მქონე უძრავ მყარ ფაზას. ჩვეულებრივ, უძრავი მყარი ფაზა გამოიყენება როგორც ზედაპირული ფენა პლანშეტის ან ELISA პლანშეტისთვის. შემდეგ, სხვადასხვა თხევადი რეაგენტები თანმიმდევრულად ემატება, ინკუბირდება და ირეცხება, ისე რომ საბოლოოდ ჯიბეში არსებულ საბოლოო სითხეში ხდება ოპტიკური ცვლილება (მაგ., ფერის განვითარება ფერმენტული რეაქციის პროდუქტის მიერ). ოპტიკური ცვლილება საშუალებას იძლევა გაიზომოს ანალიტის რაოდენობა ე.წ. რაოდენობრივი „წაკითხვის“ გზით. რაოდენობრივი წაკითხვისთვის გამოიყენება სპექტროფოტომეტრი, ფლუორომეტრი ან ლუმინომეტრი გამავალი სინათლის ინტენსივობის აღმოსაჩენად და გასაზომად. აღმოჩენის მგრძნობელობაზე გავლენას ახდენს სიგნალის გაძლიერება ანალიტიკური რეაქციების დროს. რადგან ფერმენტული რეაქციები კარგად არის შესწავლილი და საიმედო გაძლიერების პროცესებია, ფერმენტები გამოიყენება სიგნალის შესაქმნელად. ფერმენტები დაკავშირებულია აღმომჩენ რეაგენტებთან ფიქსირებულ პროპორციებში ზუსტი რაოდენობრივი განსაზღვრის შესაძლებლობისთვის, რაც ასევე ხსნის სახელწოდებას „ფერმენტთან დაკავშირებული“ იმუნოსორბენტული ანალიზი.
რადგან ELISA ანალიზები ტარდება მიკროტიტრაციულ პლანშეტებში / 96-ჯიბიან პლანშეტებში, ის ცნობილია, როგორც პლანშეტზე დაფუძნებული ანალიზის ტექნიკა და გამოიყენება, მაგ., კლინიკურ in-vitro დიაგნოსტიკაში, კვლევაში, წამლების შემუშავებაში და ა.შ. ანტისხეულების, პეპტიდების, ცილებისა და ჰორმონების აღმოსაჩენად და რაოდენობრივად დასადგენად.
ELISA ტექნიკა ხშირად გამოიყენება, როგორც დიაგნოსტიკური ინსტრუმენტი მედიცინაში, ბიოტექნოლოგიაში, მცენარეთა პათოლოგიაში და ასევე არის მნიშვნელოვანი ხარისხის კონტროლის ზომა მრავალ ინდუსტრიაში.

ულტრაბგერითი ნიმუშის მომზადება ELISA-ს წინ

სანამ ELISA ანალიზი შესაძლებელი იქნება, ნიმუშებს სჭირდებათ მომზადების ეტაპები, როგორიცაა უჯრედების ლიზი და უჯრედშიდა ცილების, დნმ-ის, რნმ-ის და ა.შ. ექსტრაქცია. ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზისა და ცილების იზოლაციის უპირატესობა არის მისი მაღალი ეფექტურობა, სანდოობა და გამეორებადობა. ყველა ეს ფაქტორი მნიშვნელოვანია მაღალი ხარისხის დიაგნოსტიკური და სამეცნიერო შედეგების მისაღებად

პროტოკოლი ELISA-ს წინა ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზისთვის

• უჯრედული კულტურებისთვის: ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზამდე, ცენტრიფუგირეთ უჯრედები 5 წთ-ის განმავლობაში 270 x g-ზე მიკროცენტრიფუგაში. მოაცილეთ სუპერნატანტი ასპირაციის გზით და ხელახლა სუსპენზირეთ უჯრედები 30 – 100 μL RIPA ბუფერში. შემდეგ, ინკუბირეთ უჯრედული ნალექი ყინულზე 30 წთ.
• ახლა, უჯრედული ნიმუში მზადაა ულტრაბგერითი ლიზისთვის:
  გამოიყენეთ პრობის ტიპის ულტრაბგერითი დამამუშავებელი (მაგ. UP200Ht S26d2 პრობით) ან ულტრაბგერითი მრავალნიმუშიანი მოწყობილობა (მაგ. VialTweeter ერთდროული ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის მაქსიმუმ 10 ვიალში ან UIP400MPT მიკროტიტრაციული პლანშეტებისთვის / 96-ჯიბიანი პლანშეტებისთვის) იმის მიხედვით, თუ რამდენი ნიმუშის მომზადება გჭირდებათ.
  ცალკეული ნიმუშის პრობის ტიპის ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის, მოათავსეთ უჯრედები 1,5 mL მიკროცენტრიფუგის სინჯარებში.
• წინასწარ დააყენეთ თქვენი ულტრაბგერითი ხანგრძლივობა, ჯამური ენერგიის შეყვანა, ციკლის რეჟიმი და/ან ტემპერატურული ზღვრები ულტრაბგერითი დამამუშავებლის ციფრულ მენიუში. ეს უზრუნველყოფს მაღალ სანდოობას ულტრაბგერითი დამუშავებისა და გამეორებადობისთვის.
• ჩასვით სონოტროდი და ჩართეთ ულტრაბგერითი მოწყობილობა. ნაზად გადაათრიეთ ულტრაბგერითი პრობის მიკროწვერი ნიმუშში, რათა ნიმუში ერთგვაროვნად დამუშავდეს ულტრაბგერითი ზემოქმედებით.
  უმეტესი უჯრედებისთვის, ულტრაბგერითი ლიზის დასრულება მოხდება 10 წმ ულტრაბგერითი დამუშავების 2–4 ციკლის შემდეგ.
• ულტრაბგერითი დამუშავების შემდეგ, ამოიღეთ სონოტროდი ნიმუშიდან. ნიმუშები უნდა ინკუბირდეს ყინულზე 5 წთ. შემდეგ, ცენტრიფუგირეთ 10 000 x g-ზე 20 წთ ნატეხების დასანალექად. გადაიტანეთ სუპერნატანტი ახალ მიკროცენტრიფუგის სინჯარაში. მონიშნეთ ანალიტები და შეინახეთ -20°C-ზე.
• ულტრაბგერითი სონოტროდის გასაწმენდად, მისი სათანადოდ გაწმენდა შესაძლებელია ალკოჰოლით ან ულტრაბგერითი დამუშავებით ალკოჰოლით სავსე ჭიქაში, მაგ. 70% ეთანოლით. ყველა ტიტანისგან დამზადებული ულტრაბგერითი პრობი ავტოკლავირებადია.

• სრულად გაამოვლეთ ქსოვილი ყინულივით ცივი PBS-ით (0,01M, pH=7,4) ჰემოლიზური სისხლის ჭარბი რაოდენობის მოსაშორებლად.
• აწონეთ ქსოვილი (თირკმელი, გული, ფილტვი, ელენთა და ა.შ.) და დაფქვით ის მცირე ნაწილებად, რომლებიც ჰომოგენიზდება PBS-ში. საჭირო PBS-ის მოცულობა დაკავშირებულია ქსოვილის წონასთან. ზოგადი წესის თანახმად, 1გ ქსოვილს სჭირდება დაახლოებით 9mL PBS. რეკომენდებულია PBS-ში პროტეაზას ინჰიბიტორის დამატება. (ალტერნატიულად შეიძლება გამოყენებულ იქნას RIPA ან ჰიპოტონური ლიზის ბუფერი, რომელიც შეიცავს პროტეაზისა და ფოსფატაზის ინჰიბიტორების კოქტეილს.)
• ქსოვილის ზომის მიხედვით, მოკლე ვორტექსური დამუშავება (დაახლოებით 1–2 წთ 15 წმ-იანი პულსებით) შეიძლება იყოს სასარგებლო ქსოვილის წინასწარი დამუშავებისთვის.
• დააყენეთ მიკროწვერი, მაგ. S26d2, თქვენს ულტრაბგერით ჰომოგენიზატორზე. მოათავსეთ ქსოვილის მქონე სინჯარა ყინულის აბაზანაში.
• ულტრაბგერითი დამუშავება მოახდინეთ თქვენს ულტრაბგერით ჰომოგენიზატორზე, მაგ. UP200St (80% ამპლიტუდა) 1 წთ პულსურ რეჟიმში (15წმ ჩართული, 15წმ პაუზა). შეინარჩუნეთ ნიმუში ყინულის აბაზანაში.
• ჰომოგენატები შემდეგ ცენტრიფუგირდება სპეციფიკური ფრაქციების (ციტოზოლური, ბირთვული, მიტოქონდრიული ან ლიზოსომური) მისაღებად, ანალიზისთვის ცილის გასამდიდრებლად. ნიმუშის 5 წუთის განმავლობაში 5000×g-ზე ცენტრიფუგირებით, მიიღება სუპერნატანტი.

საიმედო ტემპერატურული კონტროლი ულტრაბგერითი დამუშავების დროს

ტემპერატურა არის პროცესზე მნიშვნელოვანი გავლენის მქონე ფაქტორი, რომელიც განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია ბიოლოგიური ნიმუშების დამუშავებისას, მაგ. ცილების თერმული დეგრადაციის თავიდან ასაცილებლად. როგორც ყველა მექანიკური ნიმუშის მომზადების ტექნიკა, ულტრაბგერითი დამუშავება ქმნის სითბოს. თუმცა, ნიმუშების ტემპერატურა შეიძლება კარგად კონტროლდებოდეს Hielscher Ultrasonics მოწყობილობების გამოყენებისას. ჩვენ გთავაზობთ სხვადასხვა ვარიანტს თქვენი ნიმუშების ტემპერატურის მონიტორინგისა და კონტროლისთვის, პრობის ტიპის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორით ან VialTweeter-ით წინაანალიტიკური მომზადებისას.

1. ნიმუშის ტემპერატურის მონიტორინგი: ყველა Hielscher ციფრული ულტრაბგერითი პროცესორი აღჭურვილია ინტელექტუალური პროგრამული უზრუნველყოფითა და ჩასადები ტემპერატურის სენსორით. ჩასვით ტემპერატურის სენსორი ულტრაბგერით მოწყობილობაში (მაგ., UP200Ht, UP200St, VialTweeter, მრავალჯიბიანი პლანშეტის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი UIP400MTP) და ჩასვით ტემპერატურის სენსორის წვერი ერთ-ერთ ნიმუშის სინჯარაში. ციფრული ფერადი სენსორული ეკრანის მეშვეობით, შეგიძლიათ დააყენოთ ულტრაბგერითი პროცესორის მენიუში კონკრეტული ტემპერატურული დიაპაზონი თქვენი ნიმუშის ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის. ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი ავტომატურად შეწყვეტს მუშაობას მაქსიმალური ტემპერატურის მიღწევისას და შეჩერდება, სანამ ნიმუშის ტემპერატურა არ დაეცემა დაყენებული ტემპერატურის ∆ ქვედა მნიშვნელობამდე. შემდეგ ულტრაბგერითი დამუშავება ავტომატურად ისევ დაიწყება. ეს ჭკვიანი ფუნქცია ხელს უშლის სითბოთი გამოწვეულ დეგრადაციას.
2. რაც შეეხება ულტრაბგერით მრავალნიმუშიან მოწყობილობას VialTweeter, ტიტანის ბლოკი, რომელიც ინახავს ნიმუშის სინჯარებს, შეიძლება წინასწარ გაგრილდეს. მოათავსეთ VialTweeter ბლოკი (მხოლოდ სონოტროდი ტრანსდიუსერის გარეშე!) მაცივარში ან საყინულეში ტიტანის ბლოკის წინასწარი გაგრილებისთვის, რაც ხელს უწყობს ტემპერატურის მატების გადავადებას ნიმუშში. შესაძლებლობის შემთხვევაში, თავად ნიმუშიც შეიძლება წინასწარ გაგრილდეს.
3. გამოიყენეთ ყინულის აბაზანა ან მშრალი ყინული ულტრაბგერითი დამუშავების დროს გასაგრილებლად. ულტრაბგერითი დამუშავების დროს ნიმუშის სინჯარა(ები) მოათავსეთ ყინულის აბაზანაში. VialTweeter-ისთვის გამოიყენეთ მშრალი ყინულით სავსე ფართო ბრტყელი თასი და მოათავსეთ VialTweeter მშრალ ყინულზე ისე, რომ სითბო სწრაფად გაიფანტოს.

მომხმარებლები მთელ მსოფლიოში იყენებენ Hielscher-ის ზონდური ტიპის ულტრაბგერით აპარატებს, ასევე მრავალი ნიმუშის ერთდროული ულტრაბგერითი დამუშავების მოწყობილობებს VialTweeter და UIP400MTP, ბიოლოგიურ, ბიოქიმიურ, სამედიცინო და კლინიკურ ლაბორატორიებში ნიმუშების ყოველდღიური მომზადებისთვის. Hielscher-ის პროცესორების ინტელექტუალური პროგრამული უზრუნველყოფა და ტემპერატურის კონტროლის სისტემა უზრუნველყოფს ტემპერატურის საიმედო კონტროლს და თავიდან აცილებს სითბოთი გამოწვეულ ნიმუშის დეგრადაციას. ნიმუშების მომზადება Hielscher-ის ულტრაბგერითი მოწყობილობებით იძლევა მაღალსაიმედო და განმეორებად შედეგებს!
გაიგეთ მეტი ანალიზებისთვის ნიმუშების მაღალი წარმადობით ულტრაბგერითი დამუშავების შესახებ მრავალფოსოიანი მიკროფირფიტების ულტრაბგერითი აპარატის UIP400MTP-ის გამოყენებით!