ულტრაბგერითი ნიმუშის მომზადება ELISA ანალიზებისთვის

ანალიზები, როგორიცაა ELISA, ფართოდ გამოიყენება ინ ვიტრო დიაგნოსტიკისთვის, დაავადებასთან დაკავშირებული ცილების გამოვლენისა და ხარისხის კონტროლისთვის (მაგ. საკვების ალერგენების მონიტორინგი). ულტრაბგერითი ნიმუშის მომზადება არის სწრაფი, საიმედო და რეპროდუცირებადი ტექნიკა უჯრედის ლიზისა და უჯრედშიდა ცილების, დნმ, რნმ და ორგანელების იზოლირებისთვის. Hielscher Ultrasonics გთავაზობთ სხვადასხვა ულტრაბგერითი ხსნარებს ერთჯერადი ნიმუშების, მრავალჯერადი ფლაკონების მოსახერხებლად მოსამზადებლად, ასევე მიკროტიტრული ფირფიტებისა და 96 ჭაბურღილების ფირფიტებისთვის.

ELISA – ფერმენტთან დაკავშირებული იმუნოსორბენტული ანალიზი

ELISA ნიშნავს ფერმენტთან დაკავშირებულ იმუნოსორბენტულ ანალიზს და არის ფართოდ გამოყენებული ბიოქიმიური ანალიზის ტექნიკა ლიგანდის დამაკავშირებელი ანალიზის კატეგორიაში. ELISA-ში თხევადი ნიმუში ემატება სტაციონარულ მყარ ფაზას სპეციალური შემაკავშირებელი თვისებებით. ჩვეულებრივ, სტაციონარული მყარი ფაზა გამოიყენება როგორც საფარი ჭაბურღილის ფირფიტაზე ან ELISA ფირფიტაზე. შემდეგ, სხვადასხვა თხევადი რეაგენტები თანმიმდევრულად ემატება, ინკუბაცია და გარეცხვა, ისე, რომ საბოლოოდ ოპტიკური ცვლილება (მაგ. ფერმენტული რეაქციის პროდუქტით ფერის განვითარება) ხდება ჭაბურღილის საბოლოო სითხეში. ოპტიკური ცვლილება საშუალებას იძლევა გავზომოთ ანალიზის რაოდენობა ე.წ “reading”. For the quantitative reading, a spectrophotometer, fluorometer, or luminometer is used to detect and measure the intensity of the transmitted light. The sensitivity of detection is influenced by the amplification of the signal during the analytic reactions. Since enzyme reactions are well investigated and reliable amplification processes, enzymes are used to create the signal. The enzymes are linked to the detection reagents in fixed proportions to allow accurate quantification, which explains also the name “ფერმენტთან დაკავშირებული” immunosorbent assay.
ვინაიდან ELISA ანალიზები ტარდება მიკროტიტრულ ფირფიტებში? 96 ჭაბურღილის ფირფიტებში, იგი ცნობილია, როგორც ფირფიტაზე დაფუძნებული ანალიზის ტექნიკა და გამოიყენება მაგ. კლინიკური ინ ვიტრო დიაგნოსტიკაში, კვლევაში, წამლების შემუშავებაში და ა.შ. ანტისხეულების, პეპტიდების, ცილების გამოვლენისა და რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის, და ჰორმონები.
ELISA ტექნიკა ხშირად გამოიყენება, როგორც დიაგნოსტიკური საშუალება მედიცინაში, ბიოტექნოლოგიაში, მცენარეთა პათოლოგიაში და ასევე წარმოადგენს ხარისხის კონტროლის მნიშვნელოვან საზომს მრავალ ინდუსტრიაში.

ულტრაბგერითი ნიმუშის მომზადება ELISA-მდე

ELISA ანალიზის ჩატარებამდე, ნიმუშები საჭიროებენ მომზადების ეტაპებს, როგორიცაა უჯრედის ლიზისი და უჯრედშიდა ცილების, დნმ, რნმ-ის ექსტრაქცია და ა.შ. უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზისა და ცილის იზოლაციის უპირატესობა არის მისი მაღალი ეფექტურობა, საიმედოობა და რეპროდუქციულობა. ყველა ეს ფაქტორი მნიშვნელოვანია მაღალი ხარისხის დიაგნოსტიკისა და კვლევის შედეგების მისაღებად

პროტოკოლი Pre-ELISA ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზისისთვის

• უჯრედული კულტურებისთვის: ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზამდე, უჯრედების ცენტრიფუგა 5 წუთის განმავლობაში 270 xg მიკროცენტრიფუგაში. ამოიღეთ სუპერნატანტი ასპირაციით და ხელახლა გააჩერეთ უჯრედები 30 – 100 μL RIPA ბუფერში. შემდეგ, უჯრედის მარცვლების ინკუბაცია ყინულზე 30 წუთის განმავლობაში.
• ახლა, უჯრედის ნიმუში მზად არის ულტრაბგერითი ლიზისისთვის:
  გამოიყენეთ ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი (მაგ UP200Ht S26d2 ზონდით) ან ულტრაბგერითი მრავალნიმუშის მოწყობილობა (მაგ. VialTweeter 10-მდე ფლაკონის ერთდროული გაჟღერებისთვის ან UIP400MPT მიკროტიტრული ფირფიტებისთვის? 96 ჭაბურღილის ფირფიტებისთვის) დამოკიდებულია ნიმუშების რაოდენობაზე, რომელიც გჭირდებათ მოსამზადებლად.
  ერთი ნიმუშის ზონდის ტიპის ზონირებისთვის, მოათავსეთ უჯრედები 1,5 მლ მიკროცენტრიფუგა მილებში.
• წინასწარ დააყენეთ თქვენი ულტრაბგერითი ხანგრძლივობა, ჯამური ენერგიის შეყვანა, ციკლის რეჟიმი და/ან ტემპერატურის ლიმიტები ულტრაბგერითი აპარატის ციფრულ მენიუში. ეს უზრუნველყოფს უაღრესად საიმედო ჟღერადობას და განმეორებადობას.
• ჩადეთ სონოტროდი და ჩართეთ ულტრაბგერითი მოწყობილობა. ნაზად გადაიტანეთ ულტრაბგერითი ზონდის მიკრო წვერი ნიმუშის მეშვეობით, რათა ნიმუში ერთგვაროვნად გამოიყურებოდეს.
  უჯრედების უმეტესობისთვის ულტრაბგერითი ლიზისი დასრულდება 2-4 ციკლის 10 წამიანი სონიკაციის შემდეგ.
• სონიკაციის შემდეგ ამოიღეთ სონოტროდი ნიმუშიდან. ნიმუშები უნდა იყოს ინკუბირებული ყინულზე 5 წუთის განმავლობაში. შემდეგ, ცენტრიფუგა 10000 xg-ზე 20 წუთის განმავლობაში ნამსხვრევების დასაფენად. გადაიტანეთ სუპერნატანტები ახალ მიკროცენტრიფუგაში. მონიშნეთ ანალიზები და შეინახეთ -20°C ტემპერატურაზე.
• ულტრაბგერითი სონოტროდი შეიძლება გაიწმინდოს სპირტით სწორად გაწმენდით ან სპირტით სავსე ჭიქაში, მაგ. 70% ეთანოლით. ტიტანისგან დამზადებული ყველა ულტრაბგერითი ზონდი ავტოკლავადია.

• ჩამოიბანეთ ქსოვილი ყინულივით ცივი PBS-ით (0.01 მ, pH=7.4), რათა ზედმეტად ჰემოლიზური სისხლი საფუძვლიანად მოიცილოთ.
• აწონეთ ქსოვილი (თირკმელი, გული, ფილტვები, ელენთა და ა.შ.) და დაასხით პატარა ნაჭრებად, რომლებიც ჰომოგენიზირებულია PBS-ში. საჭირო PBS-ის მოცულობა დაკავშირებულია ქსოვილის წონასთან. როგორც წესი, 1გ ქსოვილს სჭირდება დაახლ. 9 მლ PBS. რეკომენდებულია პროტეაზას ინჰიბიტორის დამატება PBS-ში. (RIPA ან ჰიპოტონური ლიზისის ბუფერი, რომელიც შეიცავს პროტეაზას და ფოსფატაზას ინჰიბიტორ კოქტეილს, შეიძლება გამოყენებულ იქნას ალტერნატიულად.)
• ქსოვილის ზომის მიხედვით, მოკლე მორევით მკურნალობა (დაახლოებით 1-2 წთ. 15 წამის იმპულსში) შეიძლება სასარგებლო იყოს ქსოვილის წინასწარი დამუშავებისთვის.
• დაამონტაჟეთ მიკრო წვერი, მაგ. S26d2, თქვენს ულტრაბგერით. მოათავსეთ ნიმუშის მილი ქსოვილთან ერთად ყინულის აბაზანაში.
• ნიმუშის გაჟღერება თქვენი ულტრაბგერითი აპარატით, მაგ. UP200St (80% ამპლიტუდა) 1 წუთის განმავლობაში. პულსის რეჟიმში (15 წამი ჩართული, 15 წამი პაუზა). შეინახეთ ნიმუში ყინულის აბაზანაში.
• შემდეგ ჰომოგენატები ცენტრიფუგირდება სპეციფიკური აუზების მისაღებად (ციტოზოლური, ბირთვული, მიტოქონდრიული ან ლიზოსომური), რათა გამდიდრდეს ცილები ანალიზისთვის. ნიმუშის ცენტრიფუგირებით 5 წუთის განმავლობაში 5000×გრ-ზე, ზენატანი ამოღებულია.

სანდო ტემპერატურის კონტროლი სონიკაციის დროს

ტემპერატურა გადამწყვეტი პროცესის გავლენის ფაქტორია, რომელიც განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია ბიოლოგიური ნიმუშების დასამუშავებლად, მაგ. ცილების თერმული დეგრადაციის თავიდან ასაცილებლად. როგორც ყველა მექანიკური ნიმუშის მომზადების ტექნიკა, sonication ქმნის სითბოს. თუმცა, ნიმუშების ტემპერატურა კარგად შეიძლება კონტროლდებოდეს Hielscher Ultrasonics მოწყობილობების გამოყენებისას. ჩვენ წარმოგიდგენთ სხვადასხვა ვარიანტს თქვენი ნიმუშების ტემპერატურის მონიტორინგისა და კონტროლისთვის მათი ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი ან VialTweeter წინასწარ ანალიტიკური მომზადებისას.

1. ნიმუშის ტემპერატურის მონიტორინგი: Hielscher-ის ყველა ციფრული ულტრაბგერითი პროცესორი აღჭურვილია ინტელექტუალური პროგრამული უზრუნველყოფით და ჩართვის ტემპერატურის სენსორით. შეაერთეთ ტემპერატურის სენსორი ულტრაბგერით მოწყობილობაში (მაგ. UP200Ht, UP200 ქ, VialTweeter, მრავალ ჭაბურღილის სონიკატორი UIP400MTP) და ჩადეთ ტემპერატურის სენსორის წვერი ნიმუშის ერთ-ერთ მილში. ციფრული ფერადი სენსორული დისპლეის საშუალებით შეგიძლიათ დააყენოთ ულტრაბგერითი პროცესორის მენიუში სპეციფიკური ტემპერატურის დიაპაზონი თქვენი ნიმუშის გაჟონვისთვის. მაქსიმალური ტემპერატურის მიღწევისას ულტრაბგერითი ავტომატურად გაჩერდება და შეჩერდება მანამ, სანამ ნიმუშის ტემპერატურა არ დაიწევს დაყენებული ტემპერატურის Δ დაბალ მნიშვნელობამდე. შემდეგ ხმოვანი გამოსხივება ისევ ავტომატურად იწყება. ეს ჭკვიანი ფუნქცია ხელს უშლის სითბოს გამოწვეულ დეგრადაციას.
2. რაც შეეხება ულტრაბგერითი მრავალნიმუშის ერთეულს VialTweeter, ტიტანის ბლოკი, რომელიც ატარებს სინჯის მილებს, შეიძლება წინასწარ გაცივდეს. ჩადეთ VialTweeter-ის ბლოკი (მხოლოდ სონოტროდი გადამყვანის გარეშე!) მაცივარში ან საყინულეში, რათა წინასწარ გაცივდეს ტიტანის ბლოკი, რაც ხელს უწყობს ნიმუშის ტემპერატურის აწევის გადადებას. თუ შესაძლებელია, თავად ნიმუშიც შეიძლება წინასწარ გაცივდეს.
3. გამოიყენეთ ყინულის აბაზანა ან მშრალი ყინული გაციებისას გაჟონვის დროს. მოათავსეთ თქვენი სინჯის მილი(ები) სონიკაციის დროს ყინულის აბაზანაში. VialTweeter-ისთვის გამოიყენეთ არაღრმა უჯრა, სავსე მშრალი ყინულით და მოათავსეთ VialTweeter მშრალ ყინულზე, რათა სითბო სწრაფად გაიფანტოს.

მომხმარებლები მთელ მსოფლიოში იყენებენ Hielscher-ის ზონდის ტიპის ულტრაბგერით, აგრეთვე მრავალნიმუშიანი სონიკაციის ერთეულებს VialTweeter და UIP400MTP ყოველდღიური ნიმუშის მომზადებისთვის ბიოლოგიურ, ბიოქიმიურ, სამედიცინო და კლინიკურ ლაბორატორიებში. Hielscher-ის პროცესორების ინტელექტუალური პროგრამული უზრუნველყოფა და ტემპერატურის კონტროლი, ტემპერატურა საიმედოდ კონტროლდება და სითბოს გამოწვეული ნიმუშის დეგრადაცია თავიდან აცილებულია. ულტრაბგერითი ნიმუშის მომზადება Hielscher-ის ულტრაბგერითი ხსნარებით იძლევა უაღრესად საიმედო და გამეორებად შედეგებს!
წაიკითხეთ მეტი მაღალი გამტარიანობის სონიკაციის შესახებ მრავალ ჭაბურღილის სონიკატორის UIP400MTP ანალიზისთვის!