ულტრაბგერითი ნიმუშის მომზადება ELISA ანალიზებისთვის
ანალიზები, როგორიცაა ELISA, ფართოდ გამოიყენება ინ ვიტრო დიაგნოსტიკისთვის, დაავადებასთან დაკავშირებული ცილების გამოვლენისა და ხარისხის კონტროლისთვის (მაგ. საკვების ალერგენების მონიტორინგი). ულტრაბგერითი ნიმუშის მომზადება არის სწრაფი, საიმედო და რეპროდუცირებადი ტექნიკა უჯრედის ლიზისა და უჯრედშიდა ცილების, დნმ, რნმ და ორგანელების იზოლირებისთვის. Hielscher Ultrasonics გთავაზობთ სხვადასხვა ულტრაბგერითი ხსნარებს ერთჯერადი ნიმუშების, მრავალჯერადი ფლაკონების მოსახერხებლად მოსამზადებლად, ასევე მიკროტიტრული ფირფიტებისა და 96 ჭაბურღილების ფირფიტებისთვის.
ELISA – ფერმენტთან დაკავშირებული იმუნოსორბენტული ანალიზი
ELISA ნიშნავს ფერმენტთან დაკავშირებულ იმუნოსორბენტულ ანალიზს და არის ფართოდ გამოყენებული ბიოქიმიური ანალიზის ტექნიკა ლიგანდის დამაკავშირებელი ანალიზის კატეგორიაში. ELISA-ში თხევადი ნიმუში ემატება სტაციონარულ მყარ ფაზას სპეციალური შემაკავშირებელი თვისებებით. ჩვეულებრივ, სტაციონარული მყარი ფაზა გამოიყენება როგორც საფარი ჭაბურღილის ფირფიტაზე ან ELISA ფირფიტაზე. შემდეგ, სხვადასხვა თხევადი რეაგენტები თანმიმდევრულად ემატება, ინკუბაცია და გარეცხვა, ისე, რომ საბოლოოდ ოპტიკური ცვლილება (მაგ. ფერმენტული რეაქციის პროდუქტით ფერის განვითარება) ხდება ჭაბურღილის საბოლოო სითხეში. ოპტიკური ცვლილება საშუალებას იძლევა გავზომოთ ანალიზის რაოდენობა ე.წ “reading”. For the quantitative reading, a spectrophotometer, fluorometer, or luminometer is used to detect and measure the intensity of the transmitted light. The sensitivity of detection is influenced by the amplification of the signal during the analytic reactions. Since enzyme reactions are well investigated and reliable amplification processes, enzymes are used to create the signal. The enzymes are linked to the detection reagents in fixed proportions to allow accurate quantification, which explains also the name “ფერმენტთან დაკავშირებული” immunosorbent assay.
ვინაიდან ELISA ანალიზები ტარდება მიკროტიტრულ ფირფიტებში? 96 ჭაბურღილის ფირფიტებში, იგი ცნობილია, როგორც ფირფიტაზე დაფუძნებული ანალიზის ტექნიკა და გამოიყენება მაგ. კლინიკური ინ ვიტრო დიაგნოსტიკაში, კვლევაში, წამლების შემუშავებაში და ა.შ. ანტისხეულების, პეპტიდების, ცილების გამოვლენისა და რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის, და ჰორმონები.
ELISA ტექნიკა ხშირად გამოიყენება, როგორც დიაგნოსტიკური საშუალება მედიცინაში, ბიოტექნოლოგიაში, მცენარეთა პათოლოგიაში და ასევე წარმოადგენს ხარისხის კონტროლის მნიშვნელოვან საზომს მრავალ ინდუსტრიაში.

ულტრაბგერითი ნიმუშის მოსამზადებელი განყოფილება VialTweeter გამოიყენება უჯრედების ლიზისისა და ცილების ექსტრაქციისთვის ELISA ანალიზამდე
ულტრაბგერითი ნიმუშის მომზადება ELISA-მდე
ELISA ანალიზის ჩატარებამდე, ნიმუშები საჭიროებენ მომზადების ეტაპებს, როგორიცაა უჯრედის ლიზისი და უჯრედშიდა ცილების, დნმ, რნმ-ის ექსტრაქცია და ა.შ. უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზისა და ცილის იზოლაციის უპირატესობა არის მისი მაღალი ეფექტურობა, საიმედოობა და რეპროდუქციულობა. ყველა ეს ფაქტორი მნიშვნელოვანია მაღალი ხარისხის დიაგნოსტიკისა და კვლევის შედეგების მისაღებად
- ჰომოგენური ნიმუშის მკურნალობა
- სრული ლიზისი
- ცილის სრული ექსტრაქცია (მაგ. ანტისხეულები, დნმ)
- ოპტიმალური ადაპტაცია უჯრედის ტიპთან
- ნებისმიერი ნიმუშის ზომისთვის
- გამრავლებადი
- ტემპერატურის კონტროლირებადი
- მონაცემთა ავტომატური პროტოკოლირება SD ბარათზე
პროტოკოლი Pre-ELISA ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზისისთვის
- უჯრედული კულტურებისთვის: ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზამდე, უჯრედების ცენტრიფუგა 5 წუთის განმავლობაში 270 xg მიკროცენტრიფუგაში. ამოიღეთ სუპერნატანტი ასპირაციით და ხელახლა გააჩერეთ უჯრედები 30 – 100 μL RIPA ბუფერში. შემდეგ, უჯრედის მარცვლების ინკუბაცია ყინულზე 30 წუთის განმავლობაში.
- ახლა, უჯრედის ნიმუში მზად არის ულტრაბგერითი ლიზისისთვის:
გამოიყენეთ ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი (მაგ UP200Ht S26d2 ზონდით) ან ულტრაბგერითი მრავალნიმუშის მოწყობილობა (მაგ. VialTweeter 10-მდე ფლაკონის ერთდროული გაჟღერებისთვის ან UIP400MPT მიკროტიტრული ფირფიტებისთვის? 96 ჭაბურღილის ფირფიტებისთვის) დამოკიდებულია ნიმუშების რაოდენობაზე, რომელიც გჭირდებათ მოსამზადებლად.
ერთი ნიმუშის ზონდის ტიპის ზონირებისთვის, მოათავსეთ უჯრედები 1,5 მლ მიკროცენტრიფუგა მილებში. - წინასწარ დააყენეთ თქვენი ულტრაბგერითი ხანგრძლივობა, ჯამური ენერგიის შეყვანა, ციკლის რეჟიმი და/ან ტემპერატურის ლიმიტები ულტრაბგერითი აპარატის ციფრულ მენიუში. ეს უზრუნველყოფს უაღრესად საიმედო ჟღერადობას და განმეორებადობას.
- ჩადეთ სონოტროდი და ჩართეთ ულტრაბგერითი მოწყობილობა. ნაზად გადაიტანეთ ულტრაბგერითი ზონდის მიკრო წვერი ნიმუშის მეშვეობით, რათა ნიმუში ერთგვაროვნად გამოიყურებოდეს.
უჯრედების უმეტესობისთვის ულტრაბგერითი ლიზისი დასრულდება 2-4 ციკლის 10 წამიანი სონიკაციის შემდეგ. - სონიკაციის შემდეგ ამოიღეთ სონოტროდი ნიმუშიდან. ნიმუშები უნდა იყოს ინკუბირებული ყინულზე 5 წუთის განმავლობაში. შემდეგ, ცენტრიფუგა 10000 xg-ზე 20 წუთის განმავლობაში ნამსხვრევების დასაფენად. გადაიტანეთ სუპერნატანტები ახალ მიკროცენტრიფუგაში. მონიშნეთ ანალიზები და შეინახეთ -20°C ტემპერატურაზე.
- ულტრაბგერითი სონოტროდი შეიძლება გაიწმინდოს სპირტით სწორად გაწმენდით ან სპირტით სავსე ჭიქაში, მაგ. 70% ეთანოლით. ტიტანისგან დამზადებული ყველა ულტრაბგერითი ზონდი ავტოკლავადია.

ცილის ექსტრაქცია E.coli უჯრედებიდან ულტრაბგერითი ზონდი UP200St
- ჩამოიბანეთ ქსოვილი ყინულივით ცივი PBS-ით (0.01 მ, pH=7.4), რათა ზედმეტად ჰემოლიზური სისხლი საფუძვლიანად მოიცილოთ.
- აწონეთ ქსოვილი (თირკმელი, გული, ფილტვები, ელენთა და ა.შ.) და დაასხით პატარა ნაჭრებად, რომლებიც ჰომოგენიზირებულია PBS-ში. საჭირო PBS-ის მოცულობა დაკავშირებულია ქსოვილის წონასთან. როგორც წესი, 1გ ქსოვილს სჭირდება დაახლ. 9 მლ PBS. რეკომენდებულია პროტეაზას ინჰიბიტორის დამატება PBS-ში. (RIPA ან ჰიპოტონური ლიზისის ბუფერი, რომელიც შეიცავს პროტეაზას და ფოსფატაზას ინჰიბიტორ კოქტეილს, შეიძლება გამოყენებულ იქნას ალტერნატიულად.)
- ქსოვილის ზომის მიხედვით, მოკლე მორევით მკურნალობა (დაახლოებით 1-2 წთ. 15 წამის იმპულსში) შეიძლება სასარგებლო იყოს ქსოვილის წინასწარი დამუშავებისთვის.
- დაამონტაჟეთ მიკრო წვერი, მაგ. S26d2, თქვენს ულტრაბგერით. მოათავსეთ ნიმუშის მილი ქსოვილთან ერთად ყინულის აბაზანაში.
- ნიმუშის გაჟღერება თქვენი ულტრაბგერითი აპარატით, მაგ. UP200St (80% ამპლიტუდა) 1 წუთის განმავლობაში. პულსის რეჟიმში (15 წამი ჩართული, 15 წამი პაუზა). შეინახეთ ნიმუში ყინულის აბაზანაში.
- შემდეგ ჰომოგენატები ცენტრიფუგირდება სპეციფიკური აუზების მისაღებად (ციტოზოლური, ბირთვული, მიტოქონდრიული ან ლიზოსომური), რათა გამდიდრდეს ცილები ანალიზისთვის. ნიმუშის ცენტრიფუგირებით 5 წუთის განმავლობაში 5000×გრ-ზე, ზენატანი ამოღებულია.
სანდო ტემპერატურის კონტროლი სონიკაციის დროს
ტემპერატურა გადამწყვეტი პროცესის გავლენის ფაქტორია, რომელიც განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია ბიოლოგიური ნიმუშების დასამუშავებლად, მაგ. ცილების თერმული დეგრადაციის თავიდან ასაცილებლად. როგორც ყველა მექანიკური ნიმუშის მომზადების ტექნიკა, sonication ქმნის სითბოს. თუმცა, ნიმუშების ტემპერატურა კარგად შეიძლება კონტროლდებოდეს Hielscher Ultrasonics მოწყობილობების გამოყენებისას. ჩვენ წარმოგიდგენთ სხვადასხვა ვარიანტს თქვენი ნიმუშების ტემპერატურის მონიტორინგისა და კონტროლისთვის მათი ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი ან VialTweeter წინასწარ ანალიტიკური მომზადებისას.
- ნიმუშის ტემპერატურის მონიტორინგი: Hielscher-ის ყველა ციფრული ულტრაბგერითი პროცესორი აღჭურვილია ინტელექტუალური პროგრამული უზრუნველყოფით და ჩართვის ტემპერატურის სენსორით. შეაერთეთ ტემპერატურის სენსორი ულტრაბგერით მოწყობილობაში (მაგ. UP200Ht, UP200 ქ, VialTweeter, მრავალ ჭაბურღილის სონიკატორი UIP400MTP) და ჩადეთ ტემპერატურის სენსორის წვერი ნიმუშის ერთ-ერთ მილში. ციფრული ფერადი სენსორული დისპლეის საშუალებით შეგიძლიათ დააყენოთ ულტრაბგერითი პროცესორის მენიუში სპეციფიკური ტემპერატურის დიაპაზონი თქვენი ნიმუშის გაჟონვისთვის. მაქსიმალური ტემპერატურის მიღწევისას ულტრაბგერითი ავტომატურად გაჩერდება და შეჩერდება მანამ, სანამ ნიმუშის ტემპერატურა არ დაიწევს დაყენებული ტემპერატურის Δ დაბალ მნიშვნელობამდე. შემდეგ ხმოვანი გამოსხივება ისევ ავტომატურად იწყება. ეს ჭკვიანი ფუნქცია ხელს უშლის სითბოს გამოწვეულ დეგრადაციას.
- რაც შეეხება ულტრაბგერითი მრავალნიმუშის ერთეულს VialTweeter, ტიტანის ბლოკი, რომელიც ატარებს სინჯის მილებს, შეიძლება წინასწარ გაცივდეს. ჩადეთ VialTweeter-ის ბლოკი (მხოლოდ სონოტროდი გადამყვანის გარეშე!) მაცივარში ან საყინულეში, რათა წინასწარ გაცივდეს ტიტანის ბლოკი, რაც ხელს უწყობს ნიმუშის ტემპერატურის აწევის გადადებას. თუ შესაძლებელია, თავად ნიმუშიც შეიძლება წინასწარ გაცივდეს.
- გამოიყენეთ ყინულის აბაზანა ან მშრალი ყინული გაციებისას გაჟონვის დროს. მოათავსეთ თქვენი სინჯის მილი(ები) სონიკაციის დროს ყინულის აბაზანაში. VialTweeter-ისთვის გამოიყენეთ არაღრმა უჯრა, სავსე მშრალი ყინულით და მოათავსეთ VialTweeter მშრალ ყინულზე, რათა სითბო სწრაფად გაიფანტოს.
მომხმარებლები მთელ მსოფლიოში იყენებენ Hielscher-ის ზონდის ტიპის ულტრაბგერით, აგრეთვე მრავალნიმუშიანი სონიკაციის ერთეულებს VialTweeter და UIP400MTP ყოველდღიური ნიმუშის მომზადებისთვის ბიოლოგიურ, ბიოქიმიურ, სამედიცინო და კლინიკურ ლაბორატორიებში. Hielscher-ის პროცესორების ინტელექტუალური პროგრამული უზრუნველყოფა და ტემპერატურის კონტროლი, ტემპერატურა საიმედოდ კონტროლდება და სითბოს გამოწვეული ნიმუშის დეგრადაცია თავიდან აცილებულია. ულტრაბგერითი ნიმუშის მომზადება Hielscher-ის ულტრაბგერითი ხსნარებით იძლევა უაღრესად საიმედო და გამეორებად შედეგებს!
წაიკითხეთ მეტი მაღალი გამტარიანობის სონიკაციის შესახებ მრავალ ჭაბურღილის სონიკატორის UIP400MTP ანალიზისთვის!
Დაგვიკავშირდით!? Გვკითხე ჩვენ!
ლიტერატურა? ლიტერატურა
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
ფაქტები, რომელთა ცოდნაც ღირს
რა სახის ELISA არსებობს?
არსებობს ELISA-ს რამდენიმე სახეობა, რომლებიც გამოირჩევიან ფუნქციონირების პრინციპით. ისინი ცნობილია როგორც პირდაპირი ELISA, არაპირდაპირი ELISA, სენდვიჩ ELISA, კონკურენტული ELISA და საპირისპირო ELISA. ქვემოთ წარმოგიდგენთ ELISA-ს სხვადასხვა ტიპების მიმოხილვას და მათ ძირითად მახასიათებლებსა და განსხვავებებს.
ELISA შეიძლება ჩატარდეს ხარისხობრივ ან რაოდენობრივ ფორმატში. ხარისხობრივი შედეგები იძლევა მარტივ დადებით ან უარყოფით შედეგს, ხოლო რაოდენობრივი ELISA-ში ნიმუშის ოპტიკური სიმკვრივე (OD) შედარებულია სტანდარტულ მრუდთან, რომელიც, როგორც წესი, წარმოადგენს სამიზნე მოლეკულის ცნობილი კონცენტრაციის ხსნარის სერიულ განზავებას.
პირდაპირი ELISA
პირდაპირი ELISA არის Elisa-ს ყველაზე მარტივი გამოსაკვლევი ფორმა, სადაც გამოიყენება მხოლოდ ფერმენტებით მონიშნული პირველადი ანტისხეული და არ არის საჭირო მეორადი ანტისხეულები. ფერმენტით მარკირებული პირველადი ანტისხეული პირდაპირ უკავშირდება სამიზნეს, ანუ ანტიგენს. ბუფერული ანტიგენის ხსნარი ემატება მიკროტიტრული ფირფიტის თითოეულ ჭაბურღილს (ჩვეულებრივ, 96 ჭაბურღილიანი ფირფიტები, ELISA- ფირფიტები), სადაც მუხტის ურთიერთქმედების შედეგად ეკვრის პლასტმასის ზედაპირს. როდესაც პირველად ანტისხეულთან დაკავშირებული ფერმენტი რეაგირებს მის სუბსტრატთან, ის წარმოქმნის ხილულ სიგნალს, რომლის გაზომვა შესაძლებელია სპექტროფოტომეტრის, ფლუორომეტრის ან ლუმინომეტრის საშუალებით.
არაპირდაპირი ELISA
არაპირდაპირი ELISA ტესტისთვის საჭიროა როგორც პირველადი, ასევე მეორადი ანტისხეული. თუმცა, პირდაპირი ELISA-ს საწინააღმდეგოდ, არა პირველადი ანტისხეული, არამედ მეორადი ანტისხეული იწერება ფერმენტით. ანტიგენი იმობილირდება ჭაბურღილის ფირფიტასთან და უკავშირდება პირველადი ანტისხეულს. შემდგომში, ფერმენტით მონიშნული მეორადი ანტისხეული უერთდება პირველად ანტისხეულს. დაბოლოს, მეორად ანტისხეულთან დაკავშირებული ფერმენტი რეაგირებს მის სუბსტრატთან და წარმოქმნის ხილულ სიგნალს, რომლის აღმოჩენაც შესაძლებელია.
სენდვიჩი ELISA
მაშინ როცა პირდაპირი და არაპირდაპირი ELISA ტესტების დროს ანტიგენი იმობილიზებულია და დაფარულია ჭაბურღილის ფირფიტის ზედაპირზე, სენდვიჩის ELISA-ში ანტისხეული იმობილირდება ELISA ფირფიტის პლასტიკურ ზედაპირზე. იმობილიზებული ანტისხეულები სენდვიჩის ELISA-ში ცნობილია, როგორც დაჭერის ანტისხეულები. დაჭერის ანტისხეულების გარდა, სენდვიჩში ELISA ასევე საჭიროა ე.წ. დეტექციური ანტისხეულები მოიცავს არალეგალურ პირველადი გამოვლენის ანტისხეულს და ფერმენტით მონიშნულ მეორად გამოვლენის ანტისხეულს.
ეტაპობრივად, საინტერესო ანტიგენი აკავშირებს ფირფიტაზე იმობილირებულ ანტისხეულს. შემდეგ, პირველადი გამოვლენის ანტისხეული აკავშირებს ანტიგენს. ამის შემდეგ, მეორადი გამოვლენის ანტისხეული უკავშირდება პირველადი გამოვლენის ანტისხეულს. რეაქციის საბოლოო ეტაპზე, ფერმენტი რეაგირებს თავის სუბსტრატთან, რათა წარმოქმნას ხილული სიგნალი, რომელიც შეიძლება გამოვლინდეს ოპტიკურად.
კონკურენტული ELISA
კონკურენტული ELISA, ასევე ცნობილი როგორც ინჰიბიციური ELISA, არის ყველაზე რთული ELISA ტიპი, რადგან ის მოიცავს ინჰიბიტორული ანტიგენის გამოყენებას. სამი ფორმატიდან თითოეული, პირდაპირი, არაპირდაპირი და სენდვიჩური ELISA, შეიძლება მოერგოს კონკურენტულ ELISA ფორმატს. კონკურენტული ELISA-ში, ინჰიბიტორი ანტიგენი და ინტერესის ანტიგენი კონკურენციას უწევენ პირველად ანტისხეულთან შეკავშირებას.
კონკურენტული ELISA-სთვის არალეგირებული ანტისხეული ინკუბირებულია მისი ანტიგენის, ანუ ნიმუშის თანდასწრებით. ეს შეკრული ანტისხეული/ანტიგენის კომპლექსები შემდეგ ემატება ანტიგენით დაფარულ ჭას.
ფირფიტა გარეცხილია ისე, რომ ამოღებული ანტისხეულები ამოღებულია. კონკურენტულ ELISA-ს აქვს თავისი სახელი იმის გამო, რომ რაც უფრო მეტი ანტიგენია ნიმუშში, მით მეტი ანტიგენ-ანტისხეულის კომპლექსი იქმნება. ეს ნიშნავს, რომ ჭაბურღილში არსებული ანტიგენთან შესაერთებლად ნაკლები შეუკავშირებელი ანტისხეულებია ხელმისაწვდომი და ანტიგენები კონკურენციას უწევენ ხელმისაწვდომი ანტისხეულისთვის. ემატება მეორადი ანტისხეული, რომელიც ემთხვევა პირველად ანტისხეულს. ეს მეორე ანტისხეული დაკავშირებულია ფერმენტთან. როდესაც სუბსტრატს ემატება, დარჩენილი ფერმენტები წარმოქმნის ქრომოგენურ ან ფლუორესცენტურ სიგნალს.
ამ დროს რეაქცია ჩერდება სიგნალის საბოლოო გაჯერების თავიდან ასაცილებლად.
ზოგიერთი კონკურენტული ELISA ნაკრები შეიცავს ფერმენტთან დაკავშირებულ ანტიგენს ფერმენტთან დაკავშირებული ანტისხეულების ნაცვლად. ეტიკეტირებული ანტიგენი კონკურენციას უწევს ანტისხეულების შემაკავშირებელ პირველად ადგილებს სინჯის ანტიგენთან (არა მარკირებული). რაც უფრო ნაკლები ანტიგენია ნიმუშში, მით უფრო ეტიკეტირებული ანტიგენი ინახება ჭაში და მით უფრო ძლიერია სიგნალი.
საპირისპირო ELISA
საპირისპირო ELISA არ იყენებს ჭაბურღილის ფირფიტებს, მაგრამ ტოვებს ანტიგენებს შეჩერებულ სატესტო სითხეში. საპირისპირო ELISA ტესტი ზომავს შეკრული ანტისხეულების რაოდენობას ანტიგენის საშუალებით. ის სპეციალურად შეიქმნა დასავლეთ ნილოსის ვირუსის პროტეინის აღმოსაჩენად და გამოსაკვლევად და იმის შესასწავლად, თუ როგორ შეუძლია მას ვირუსის სპეციფიკური ანტისხეულების პოვნა.
რომელი ფერმენტული მარკერები გამოიყენება ELISA-სთვის?
ქვემოთ მოცემულ სიაში მოცემულია ყველაზე გავრცელებული ფერმენტული მარკერები, რომლებიც გამოიყენება ELISA ანალიზებში, რომლებიც საშუალებას იძლევა შეფასდეს ანალიზის შედეგების დასრულების შემდეგ.
- OPD (ო-ფენილენდიამინის დიჰიდროქლორიდი) იქცევა ქარვისფერად HRP-ის (ცხენის პეროქსიდაზას) გამოსავლენად, რომელსაც ხშირად იყენებენ როგორც კონიუგირებულ ცილას.
- TMB (3,3′,5,5′-ტეტრამეთილბენზიდინი) ლურჯდება HRP-ის გამოვლენისას და ყვითლდება გოგირდის ან ფოსფორმჟავას დამატების შემდეგ.
- ABTS (2,2′-აზინობის [3-ეთილბენზოთიაზოლინ-6-სულფონის მჟავა]-დიამონიუმის მარილი) მწვანედება HRP-ის გამოვლენისას.
- PNPP (p-ნიტროფენილ ფოსფატი, დინატრიუმის მარილი) ყვითლდება ტუტე ფოსფატაზის გამოვლენისას.