პლაზმიდის მომზადება ულტრაბგერითი დამუშავების გამოყენებით

ულტრაბგერითი დამუშავება არის პლაზმიდური დნმ-ის ფრაგმენტაციის საიმედო მეთოდი. ზუსტად მართვადი ამპლიტუდა, პულსაციის რეჟიმი და ტემპერატურული კონტროლი ულტრაბგერითი აპარატის ყველაზე მნიშვნელოვანი მახასიათებლებია პლაზმიდის დაზიანების გარეშე ფრაგმენტაციისთვის. გარდა ამისა, ზოგიერთი აგენტის გამოყენება ხელს უწყობს პლაზმიდის დეგრადაციისგან დაცვას. Hielscher Ultrasonics გთავაზობთ სხვადასხვა გადაწყვეტილებას პლაზმიდის კონტროლირებადი ფრაგმენტაციისთვის ცალკეული ფლაკონებიდან, მრავალი ნიმუშის ერთდროული ულტრაბგერითი დამუშავებიდან, ასევე მრავალბუდიანი პლანშეტებისთვის. გაიგეთ მეტი წარმატებული ულტრაბგერითი პლაზმიდური ფრაგმენტაციის შესახებ!

პლაზმიდის ძვრა ულტრაბგერითი დამუშავების გამოყენებით

როდესაც დნმ-ის ნიმუშები ექვემდებარება ულტრაბგერით ტალღებს, ულტრაბგერითად გენერირებული ვიბრაციები ქმნის აკუსტიკურ კავიტაციას სითხეში, რომელიც ძვრის ან შლის მაღალმოლეკულურ დნმ-ის მოლეკულებს მექანიკური ძალების მეშვეობით. ულტრაბგერითი დამუშავება არის ყველაზე ფართოდ გავრცელებული მეთოდი დნმ-ის მასობრივი ძვრის ექსპერიმენტებისთვის, მათ შორის ისეთი გამოყენებებისთვის, როგორიცაა ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაცია (ChIP), რომლისთვისაც მცირე ფრაგმენტების ზომები აბსოლუტურად გადამწყვეტია მაღალი გარჩევადობის მისაღებად. (იხ. Tseng et al., 2012)
პლაზმიდური დნმ (pDNA) არის დნმ-ის სპეციფიკური ფორმა, რომელიც ხასიათდება რგოლის ფორმით და გვხვდება ბაქტერიებში და ზოგიერთ ეუკარიოტში.
ზედაგახვეული pDNA არის პლაზმიდური დნმ-ის სასურველი ფორმა, რადგან ის აჩვენებს საუკეთესო შედეგებს შემდგომ პროცესებში, როგორიცაა ავტომატიზებული სეკვენირება და ტრანსფექცია. ულტრაბგერითი დამუშავება შესაფერისია pDNA-ის, მათ შორის ზედაგახვეული pDNA-ის წარმატებული ფრაგმენტაციისთვის.
Thompson et al. (2008) აჩვენეს, რომ პლაზმიდის ულტრაბგერითი დამუშავება, რომელიც ცნობილია ზედაგახვეული დნმ-ის ფრაგმენტაციით, არის ეფექტური გზა სეკვენირების phred20 წაკითხვის სიგრძეების გასაუმჯობესებლად ისეთ დონემდე, რომ ისინი მნიშვნელოვნად არ განსხვავდებიან Beckman Coulter-ის საკონტროლო შაბლონის ან ფერმენტულად ლინეარიზებული პლაზმიდებისგან.

პლაზმიდური ვექტორების გამოყენება

პლაზმიდები ხშირად გამოიყენება გენების კლონირების, ტრანსფერისა და მანიპულირების ინსტრუმენტებად. როდესაც პლაზმიდები ექსპერიმენტულად გამოიყენება ამ მიზნებისთვის, მათ ვექტორებს უწოდებენ. დნმ-ის ფრაგმენტები ან გენები შეიძლება ჩაისვას პლაზმიდურ ვექტორში, რითაც იქმნება ე.წ. რეკომბინანტური პლაზმიდი. პლაზმიდური ვექტორები გამოიყენება როგორც მატარებლები რეკომბინანტური დნმ-ის ჰოსტ-უჯრედში შესატანად და წარმოადგენენ მოლეკულური კლონირების მთავარ კომპონენტს.
“არა-ვირუსული ვექტორები ფართოდ იკვლევება მათი პოტენციური გამოყენებისთვის გენური თერაპიაში სხვადასხვა რთული დაავადებების სამკურნალოდ. არა-ვირუსული ვექტორები იცავენ პლაზმიდურ დნმ-ს ფიზიკური, ქიმიური და ფერმენტული დეგრადაციისგან და აწვდიან დნმ-ის მოლეკულას მიზნობრივ ადგილს. მაგალითად, კატიონური ლიპოსომები, ქიტოზანი და სხვა დადებითად დამუხტული ნანონაწილაკები ქმნიან კომპლექსებს პლაზმიდურ დნმ-თან ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედებების მეშვეობით. თუმცა, მარტივად წარმოქმნილი კატიონური ლიპოსომები/პლაზმიდური დნმ-ის კომპლექსები შედარებით დიდია (ანუ, 300–400 nm) და ჰეტეროგენული ბუნების, რაც მათ ფარმაცევტული გამოყენებისთვის რთულს ხდის. დიდი და ჰეტეროგენული პლაზმიდური დნმ/ლიპოსომების, პლაზმიდური დნმ/აეროზოლების და პლაზმიდური დნმ/პეპტიდების კომპლექსები შეიძლება შემცირდეს უფრო მცირე და ჰომოგენურ ნაწილაკებად ულტრაბგერითი დამუშავების გამოყენებით.” (Sarker et al., 2019)
პლაზმიდური ვექტორების გამოყენების თვალსაჩინო მაგალითია CRISPR–Cas9. CRISPR–Cas9 სისტემა ჩვეულებრივ უჯრედებს მიეწოდება როგორც ერთი დიდი პლაზმიდი ან მრავალი უფრო მცირე პლაზმიდი, რომლებიც აკოდირებენ მიზნობრივ თანმიმდევრობას, CRISPR-ის გიდ-RNA-ს და Cas9-ს.

დნმ-ით დატვირთული PLGA ნანონაწილაკების ულტრაბგერითი მომზადება ნანოპრეციპიტაციის გზით

Jo et al. (2020) გამოიყენეს პოლი(რძემჟავა-კო-გლიკოლის მჟავა) (PLGA) ნანონაწილაკების მატარებლის შესაქმნელად მოდელური CRISPR–Cas9 პლაზმიდის მიტანისთვის ძვლის ტვინიდან მიღებულ პირველად მაკროფაგებში. PLGA ნანონაწილაკების ნანოპრეციპიტაციისთვის გამოიყენებოდა PLGA ორი განსხვავებული ბოლო ჯგუფით (ეთერისა და ამინის ჯგუფები) იმ მიზნით, რომ დადებითად დამუხტული ამინის ბოლო ჯგუფები გაზრდიდნენ ინკაფსულაციის ეფექტურობას და დატვირთვას მათ და დნმ-ის უარყოფითად დამუხტულ ძირითად ჯაჭვს შორის მუხტების ურთიერთქმედების გამო. 50 mL პოლიპროპილენის კონუსურ ცენტრიფუგის სინჯარაში, 100 mg Pluronic F127 გაიხსნა 20 mL ავტოკლავირებულ დეიონიზებულ წყალში ვორტექსური შერევით, რასაც მოჰყვა 30 წუთის განმავლობაში ნაზი ულტრაბგერითი დამუშავება ულტრაბგერითი აბაზანის გამოყენებით (იხ. CupHorn). დაემატა ავტოკლავირებული მაგნიტური მორევის ღერო და ხსნარი შეირია 600 RPM სიჩქარით 30 წუთის განმავლობაში, სანამ სხვა ხსნარები მზადდებოდა. მინის ჭურჭლის ნაცვლად მთელი პროცესის განმავლობაში გამოიყენებოდა პლასტმასის ლაბორატორიული ჭურჭელი დნმ-ის არასპეციფიკური ადსორბციის მინიმიზაციისთვის. ცალ-ცალკე მომზადდა PLGA-ს ხსნარი DMF-ში (44,48 mg/ ml) და TIPS პენტაცენის ხსნარი THF-ში (0,667 mg/ml). PLGA დარჩა უძრავად DMF-ში დასასველებლად 30 წუთის განმავლობაში, სანამ 30 წუთის განმავლობაში ულტრაბგერითი დამუშავება მოხდებოდა. (სრული პროტოკოლისთვის იხ. Jo et al., 2020)

პლაზმიდური დნმ-ის დაცვა ულტრაბგერითი დამუშავების დროს

დნმ, მათ შორის პლაზმიდები და სუპერგახვეული პლაზმიდები, ძალიან მგრძნობიარეა დეგრადაციის მიმართ. ყველა ხელმისაწვდომი ფრაგმენტაციის მეთოდი ცნობილია გარკვეული უარყოფითი მხარეებით. ულტრაბგერითი დნმ-ის ფრაგმენტაცია ერთ-ერთი უპირატესი მეთოდია, რადგან კონტროლირებადი ულტრაბგერითი დამუშავება დამცავი ღონისძიებების კომბინაციით საშუალებას იძლევა შემცირდეს დნმ-ის ჯაჭვების ძვრისა და სითბოს მიერ გამოწვეული დაზიანება.
დაბალი ამპლიტუდის პარამეტრების, პულსაციის რეჟიმისა და ტემპერატურის კონტროლის გარდა, ულტრაბგერითი დნმ-ის ძვრის დროს, გარკვეული აგენტების გამოყენებამ აჩვენა მნიშვნელოვანი დამცავი ეფექტი დნმ-ის დეგრადაციის მიმართ. მაგალითად, სხვადასხვა პოლიმერები, პეპტიდები და ლიპიდები იცავენ პლაზმიდურ დნმ-ს ულტრაბგერითი დამუშავების დროს.

პლაზმიდური დნმ-ის და პლაზმიდური დნმ/IL ნანოკომპლექსების სტაბილურობა ულტრაბგერითი ძვრის სტრესის მიმართ შეისწავლეს აგაროზის გელ-ელექტროფორეზის ანალიზის გამოყენებით. როგორც პლაზმიდური დნმ, ისე პლაზმიდური დნმ/IL ნანოკომპლექსები განიცადეს ულტრაბგერითი ძვრის სტრესს სხვადასხვა დროის მონაკვეთებში. პლაზმიდური დნმ განიცადა ულტრაბგერითი ძვრის სტრესს 0, 10, 20, 30 და 40 წუთის განმავლობაში. თუმცა, პლაზმიდური დნმ/IL ნანოკომპლექსები განიცადა ულტრაბგერითი ძვრის სტრესს 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 და 120 წუთის განმავლობაში.
(კვლევა და სურათი: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) აჩვენეს, რომ როდესაც პლაზმიდური დნმ / იონური სითხე (pDNA/IL) ნანოსტრუქტურები განიცადეს ულტრაბგერითი ძვრის სტრესს 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 და 120 წუთის განმავლობაში და კომპლექსში შევიდნენ კომერციულად ხელმისაწვდომ კატიონურ გენების მიტანის აგენტ ლიპოფექტამინთან, ფლუორესცენტულად პოზიტიური უჯრედების პროცენტული რაოდენობა იყო 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% და 50%, შესაბამისად (იხ. ქვემოთ მოცემული დიაგრამა). ფლუორესცენტულად პოზიტიური უჯრედების პროცენტული რაოდენობა გაიზარდა, როდესაც ნანოსტრუქტურები განიცადეს ულტრაბგერითი ძვრის სტრესს 10 და 20 წუთის განმავლობაში, ხოლო შემდეგ ნელა შემცირდა.

იონური სითხის [Bmim][PF6] გავლენა პლაზმიდური დნმ-ის მიტანაზე COS7 უჯრედებში. პლაზმიდური დნმ/IL (იონური სითხე) ნანოკომპლექსები განიცადეს ულტრაბგერითი ძვრის სტრესს 120 წუთამდე და კომპლექსში შევიდნენ LA-სთან COS7 უჯრედებში მიტანამდე. მონაცემები აჩვენებს GFP პოზიტიური HeLa უჯრედების საშუალო რაოდენობას (%) 10 სხვადასხვა მიკროსკოპულ ველში და ექსპერიმენტი ჩატარდა რამდენჯერმე სამ სხვადასხვა დღეს. (კვლევა და დიაგრამა: ©Sarker et al., 2019)

ულტრაბგერითი ლიზატის მომზადება

ულტრაბგერითი უჯრედული ლიზისის პროტოკოლი
დაიწყეთ უჯრედების გამდიდრებული ნიმუშით, რომელიც მომზადდა უჯრედების სეპარაციის მეთოდით (მაგ., იმუნომაგნიტური უჯრედების სეპარაცია, ფლუორესცენციით აქტივირებული უჯრედების სორტირება (FACS), სიმკვრივის გრადიენტული ცენტრიფუგირება, იმუნოსიმკვრივით უჯრედების იზოლაცია).
უჯრედული ნიმუშები უნდა შეიცავდეს ლიზისის ბუფერის ისეთ მოცულობას, რომელიც შესაფერისია ექსპერიმენტული მიზნისა და პრობის ტიპის ულტრაბგერითი აპარატისთვის.
პირველ რიგში რეკომენდებულია ჰიპოტონური ბუფერები, რადგან ისინი აძლიერებენ ულტრაბგერით უჯრედულ ლიზისს. მნიშვნელოვანია, რომ დანამატები და მარილის კონცენტრაცია გამოყენებულ იქნას შესაბამისი გზით.
აირჩიეთ თქვენი ულტრაბგერითი ლიზისის მოწყობილობა: ვიალების ინდირექტული ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის რეკომენდებულია VialTweeter ან CupHorn. მრავალკეთიანი ფირფიტებისთვის UIP400MTP არის იდეალური ულტრაბგერითი აპარატი. ხოლო კლასიკური პრობის ტიპის ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის ყველაზე შესაფერისია ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი, როგორიცაა UP100H ან UP200Ht მიკრო-წვერით.
პროტოკოლი პრობის ტიპის ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის: მოათავსეთ ულტრაბგერითი აპარატის პრობი მიკროცენტრიფუგის სინჯარაში ნიმუშის მოცულობაში და დაამუშავეთ ულტრაბგერით დაახლოებით 10 წამის განმავლობაში. DNA ნიმუშის მიხედვით, ულტრაბგერითი დამუშავება შესაძლოა გამეორდეს კიდევ ერთხელ ან ორჯერ. საჭირო ულტრაბგერითი ენერგიის შეყვანა (Ws/mL) დამოკიდებულია ნიმუშის სიბლანტესა და DNA-ს ტიპზე. გაცივება ყინულის აბაზანის მეშვეობით და ულტრაბგერითი აპარატის პულსაციის რეჟიმის გამოყენება ხელს უშლის ნიმუშის თერმულ დაშლას.
ულტრაბგერითი ლიზისის შემდეგ, ნიმუში ცენტრიფუგირდება ნალექის ნაშთების (შეიცავს არალიზირებულ უჯრედებს, ბირთვებს და არალიზირებულ ორგანელებს) გამოსაყოფად
თუ ნიმუში არ არის დამუშავებული უშუალოდ შემდგომ ეტაპზე, ის შეიძლება შეინახოს შესაბამის ტემპერატურაზე მისი სიცოცხლისუნარიანობის შესანარჩუნებლად.

ულტრაბგერითი აპარატები DNA-ს ფრაგმენტაციისთვის

Hielscher Ultrasonics სთავაზობს ულტრაბგერაზე დაფუძნებულ სხვადასხვა პლატფორმებს DNA-ს, RNA-ს და ქრომატინის ფრაგმენტაციისთვის. ეს სხვადასხვა პლატფორმები მოიცავს ულტრაბგერით პრობებს (სონოტროდებს), ინდირექტული ულტრაბგერითი დამუშავების გადაწყვეტილებებს მრავალი სინჯარის ან მრავალკეთიანი ფირფიტების (მაგ., 96-კეთიანი ფირფიტები, მიკროტიტრული ფირფიტები) ერთდროული ნიმუშების მომზადებისთვის, სონორეაქტორებს და ულტრაბგერით კუპჰორნებს. DNA-ს ძვრისთვის ყველა პლატფორმა იკვებება სიხშირით მორგებული, მაღალი წარმადობის ულტრაბგერითი პროცესორებით, რომლებიც ზუსტად კონტროლირებადია და იძლევა რეპროდუცირებად შედეგებს.

ულტრაბგერითი პროცესორები ნიმუშების ნებისმიერი რაოდენობისა და ზომისთვის

Hielscher-ის მრავალნიმუშიანი ულტრაბგერითი აპარატებით VialTweeter (მაქსიმუმ 10 სინჯარისთვის) და UIP400MTP (მიკროფირფიტებისთვის/მრავალკეთიანი ფირფიტებისთვის) მარტივად ხდება შესაძლებელი ნიმუშების დამუშავების დროის შემცირება ინტენსიური და ზუსტად კონტროლირებადი ულტრაბგერითი დამუშავების გამო, რის შედეგადაც მიიღება სასურველი DNA-ს ფრაგმენტების ზომის განაწილება და გამოსავლიანობა. ულტრაბგერითი DNA-ს ფრაგმენტაცია პლაზმიდის მომზადების ეტაპებს ხდის ეფექტურს, საიმედოს და მასშტაბირებადს. პროტოკოლები შეიძლება ლინეარულად გაიზარდოს ერთიდან მრავალ ნიმუშამდე მუდმივი ულტრაბგერითი პარამეტრების გამოყენებით.
პრობის ულტრაბგერითი აპარატები ერთიდან ხუთამდე „თითით“ იდეალურია მცირე რაოდენობის ნიმუშების მომზადებისთვის. Hielscher-ის ლაბორატორიული ულტრაბგერითი აპარატები ხელმისაწვდომია სხვადასხვა სიმძლავრის დონეებით, რათა აირჩიოთ იდეალური ულტრაბგერითი დისრუპტორი თქვენი DNA-სთან დაკავშირებული გამოყენებისთვის.