პლაზმიდის მომზადება ულტრაბგერითი გამოყენებით

ულტრაბგერითი პლაზმური დნმ-ის ფრაგმენტაციის საიმედო ტექნიკაა. ზუსტად კონტროლირებადი ამპლიტუდა, პულსაციის რეჟიმი და ტემპერატურის კონტროლი არის ულტრაბგერითი აპარატის ყველაზე მნიშვნელოვანი მახასიათებელი პლაზმიდის ფრაგმენტაციის უვნებლობისთვის. გარდა ამისა, გარკვეული აგენტების გამოყენება ხელს უწყობს პლაზმიდის დეგრადაციისგან დაცვას. Hielscher Ultrasonics გთავაზობთ სხვადასხვა გადაწყვეტილებებს ერთი ფლაკონებიდან კონტროლირებადი პლაზმიდის ფრაგმენტაციისთვის, მრავალი ნიმუშის და ასევე მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტების ერთდროულად გაჟღერებისთვის. შეიტყვეთ მეტი წარმატებული ულტრაბგერითი პლაზმიდის ფრაგმენტაციის შესახებ!

პლაზმიდის გახეხვა ულტრაბგერითი გამოყენებით

როდესაც დნმ-ის ნიმუშები ექვემდებარება ულტრაბგერითი ტალღებს, ულტრაბგერითი წარმოქმნილი ვიბრაციები ქმნიან აკუსტიკური კავიტაციას სითხეში, რომელიც ჭრის ან არღვევს მაღალი მოლეკულური წონის დნმ-ის მოლეკულებს მექანიკური ძალების მეშვეობით. Sonication არის ყველაზე ფართოდ გამოყენებული მეთოდი დნმ-ის მოცულობითი შეკუმშვის ექსპერიმენტებისთვის, აპლიკაციების ჩათვლით, როგორიცაა ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაცია (ChIP), რისთვისაც მცირე ფრაგმენტების ზომა აბსოლუტურად მნიშვნელოვანია მაღალი გარჩევადობის მისაღებად. (შდრ. Tseng et al., 2012)
პლაზმიდური დნმ (pDNA) არის დნმ-ის სპეციფიკური ფორმა, რომელიც ხასიათდება რგოლის ფორმით და გვხვდება ბაქტერიებსა და ზოგიერთ ევკარიოტში.
Supercoiled pDNA არის პლაზმიდური დნმ-ის სასურველი ფორმა, რადგან ის აჩვენებს საუკეთესო შედეგებს ქვედა ნაკადის პროცესებში, როგორიცაა ავტომატური თანმიმდევრობა და ტრანსფექცია. ულტრაბგერითი დამუშავება შესაფერისია დნმ-ის ფრაგმენტაციისთვის, მათ შორის სუპერკოილირებული pDNA-ს წარმატებით.
Thompson et al. (2008) demonstrated that plasmid sonication, which is known to fragment supercoiled DNA, is an effective way to improve sequence phred20 read lengths to the point that they are not significantly different from Beckman Coulter’s control template or enzymatically linearized plasmids.

პლაზმიდური ვექტორების გამოყენება

პლაზმიდები ხშირად გამოიყენება როგორც გენების კლონირების, გადაცემის და მანიპულირების იარაღები. როდესაც პლაზმიდები ექსპერიმენტულად გამოიყენება ამ მიზნებისათვის, მათ უწოდებენ ვექტორებს. დნმ-ის ფრაგმენტები ან გენები შეიძლება შევიდეს პლაზმიდურ ვექტორში, რაც ქმნის ე.წ. რეკომბინანტულ პლაზმიდს. პლაზმიდური ვექტორები გამოიყენება როგორც სატრანსპორტო საშუალებები რეკომბინანტული დნმ-ის მასპინძელ უჯრედში გადასაყვანად და წარმოადგენს მოლეკულური კლონირების ძირითად კომპონენტს.
“არავირუსული ვექტორები ფართოდ არის შესწავლილი მათი პოტენციური გამოყენებისთვის გენურ თერაპიაში სხვადასხვა გართულებული დაავადებების სამკურნალოდ. არავირუსული ვექტორები იცავს პლაზმიდურ დნმ-ს ფიზიკური, ქიმიური და ფერმენტული დეგრადაციისგან და აწვდის დნმ-ის მოლეკულას სამიზნე ადგილზე. მაგალითად, კათიონური ლიპოსომები, ქიტოზანი და სხვა დადებითად დამუხტული ნანონაწილაკები ქმნიან კომპლექსებს პლაზმიდურ დნმ-თან ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედების გზით. თუმცა, ადვილად წარმოქმნილი კათიონური ლიპოსომები/პლაზმიდური დნმ-ის კომპლექსები შედარებით დიდია (ანუ, 300-400 ნმ) და ბუნებით ჰეტეროგენული, რაც ართულებს მათ გამოყენებას ფარმაცევტულ პროგრამებში. დიდი და ჰეტეროგენული პლაზმური დნმ/ლიპოსომები, პლაზმიდური დნმ/აეროზოლები და პლაზმიდური დნმ/პეპტიდების კომპლექსები შეიძლება შემცირდეს პატარა და ერთგვაროვან ნაწილაკებამდე ულტრაბგერითი გამოკვლევის გამოყენებით.” (სარკერი და სხვები, 2019)
პლაზმიდური ვექტორების გამოყენების თვალსაჩინო მაგალითია CRISPR–Cas9. CRISPR–Cas9 სისტემა, როგორც წესი, მიეწოდება უჯრედებს, როგორც ერთი დიდი პლაზმიდი ან მრავალი პატარა პლაზმიდი, რომელიც კოდირებს სამიზნე თანმიმდევრობას, CRISPR სახელმძღვანელოს და Cas9.

დნმ-ით დატვირთული PLGA ნანონაწილაკების ულტრაბგერითი მომზადება ნანოპრეციპიტაციით

ჯო და სხვ. (2020) გამოიყენა პოლი(ლაქტურ-კო-გლიკოლის მჟავა) (PLGA) ნანონაწილაკების გადამზიდველის შესაქმნელად მოდელის CRISPR-Cas9 პლაზმიდის მიწოდებისთვის ძვლის ტვინის პირველადი მაკროფაგებში. PLGA ნანონაწილაკების ნანონალექისთვის გამოიყენეს PLGA ორი განსხვავებული ბოლო ჯგუფით (ესტერი და ამინ ჯგუფები) იმ მიზნით, რომ დადებითად დამუხტული ამინის ბოლო ქუდები გაზარდონ კაფსულაციის ეფექტურობა და დატვირთვა მასსა და უარყოფითად დამუხტულ ხერხემალს შორის მუხტის ურთიერთქმედების გამო. დნმ. 50 მლ პოლიპროპილენის კონუსურ ცენტრიფუგა მილში, 100 მგ Pluronic F127 იხსნება 20 მლ ავტოკლავირებულ DI წყალში მორევის შერევით, რასაც მოჰყვა 30 წუთი ნაზი ხმოვანი გამოსხივება ულტრაბგერითი აბაზანის გამოყენებით (იხილეთ CupHorn). დაემატა ავტოკლავირებული მაგნიტური ამრევი ზოლი და ხსნარი შერეული იყო 600 RPM-ზე 30 წუთის განმავლობაში, სანამ სხვა ხსნარები მზადდებოდა. დნმ-ის არასპეციფიკური ადსორბციის შესამცირებლად მინის ნაწარმის ნაცვლად პლასტიკური ლაბორატორია გამოიყენებოდა. DMF-ში გახსნილი PLGA-ს (44,48 მგ/მლ) და THF-ში გახსნილი TIPS პენტაცენის (0,667 მგ/მლ) ხსნარები დამზადდა ცალკე. PLGA დარჩა მშვიდად, რათა დასველდეს DMF-ში 30 წუთის განმავლობაში, სანამ 30 წუთის განმავლობაში გაჟღერდა. (სრული პროტოკოლისთვის იხილეთ Jo et al., 2020)

პლაზმური დნმ-ის დაცვა სონიკაციის დროს

დნმ, მათ შორის პლაზმიდები და ზეგადახვეული პლაზმიდები, ძალიან მგრძნობიარე დეგრადაციაა. ფრაგმენტაციის ყველა ხელმისაწვდომი მეთოდი ცნობილია გარკვეული უარყოფითი მხარეებით. ულტრაბგერითი დნმ-ის ფრაგმენტაცია ერთ-ერთი სასურველი მეთოდია, ვინაიდან კონტროლირებადი სონიკა დამცავ ზომებთან ერთად საშუალებას იძლევა შემცირდეს დნმ-ის ჯაჭვების თერმით გამოწვეული დაზიანება.
დაბალი ამპლიტუდის პარამეტრების, პულსაციის რეჟიმისა და ტემპერატურის კონტროლის გარდა, დნმ-ის ულტრაბგერითი შეკუმშვის დროს, გარკვეული აგენტების გამოყენებამ აჩვენა მნიშვნელოვანი დამცავი ეფექტი დნმ-ის დეგრადაციისგან. მაგალითად, სხვადასხვა პოლიმერები, პეპტიდები და ლიპიდები იცავს პლაზმიდურ დნმ-ს ულტრაბგერითი გამოკვლევისას.

პლაზმური დნმ-ის და პლაზმიდური დნმ/IL ნანოკომპლექსების სტაბილურობა ულტრაბგერითი ათვლის სტრესის მიმართ გამოკვლეული იყო აგაროზის გელის ელექტროფორეზის ანალიზის გამოყენებით. ორივე პლაზმური დნმ და პლაზმიდური დნმ/IL ნანოკომპლექსები ექვემდებარებოდნენ ულტრაბგერითი ათვლის სტრესს სხვადასხვა დროის განმავლობაში. პლაზმური დნმ ექვემდებარებოდა ულტრაბგერითი ათვლის სტრესს 0, 10, 20, 30 და 40 წუთის განმავლობაში. თუმცა, პლაზმიდური დნმ/IL ნანოკომპლექსები ექვემდებარებოდა ულტრაბგერითი ათვლის სტრესს 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 და 120 წუთის განმავლობაში.(შესწავლა და სურათი: ©Sarker et al., 2019)

სარკერი და სხვ. (2019) აჩვენა, რომ როდესაც პლაზმიდური დნმ/იონური სითხე (pDNA/IL) ნანოსტრუქტურები ექვემდებარებოდა ულტრაბგერითი ათვლის სტრესს 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 და 120 წუთის განმავლობაში და კომერციულად ხელმისაწვდომ კათიონურ გენთან კომპლექსური იყო. მიწოდების აგენტი lipofectamine, ფლუორესცენტური დადებითი უჯრედების პროცენტული მაჩვენებელი იყო 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% და 50%, შესაბამისად (იხ. დიაგრამა ქვემოთ). ფლუორესცენტური დადებითი უჯრედების პროცენტული მაჩვენებელი გაიზარდა, როდესაც ნანოსტრუქტურები ექვემდებარებოდნენ ულტრაბგერითი ათვლის სტრესს 10 და 20 წუთის განმავლობაში, შემდეგ კი ნელა შემცირდა.

იონური სითხის [Bmim][PF6] გავლენა პლაზმიდური დნმ-ის მიწოდებაზე COS7 უჯრედებისთვის. პლაზმური დნმ/IL (იონური თხევადი) ნანოკომპლექსები დაექვემდებარა ულტრაბგერითი ათვლის სტრესს 120 წუთამდე და კომპლექსური LA-სთან COS7 უჯრედებში მიწოდებამდე. მონაცემები აჩვენებს GFP დადებითი HeLa უჯრედების საშუალო რაოდენობას (%) დათვლილი 10 სხვადასხვა მიკროსკოპულ ველში და ექსპერიმენტი ჩატარდა რამდენჯერმე სამ სხვადასხვა დღეს. (კვლევა და სქემა: ©Sarker et al., 2019)

ულტრაბგერითი ლიზატის მომზადება

ულტრაბგერითი უჯრედის ლიზის პროტოკოლი
დაიწყეთ უჯრედების გამდიდრებული ნიმუშით, რომელიც მომზადდა უჯრედების გამოყოფის მეთოდით (მაგ., იმუნომაგნიტური უჯრედების გამოყოფა, ფლუორესცენტით გააქტიურებული უჯრედების დახარისხება (FACS), სიმკვრივის გრადიენტური ცენტრიფუგაცია, იმუნოდენტურ უჯრედების იზოლაცია).
უჯრედის ნიმუშებმა უნდა აჩვენონ ლიზისის ბუფერის მოცულობა, რომელიც შეესაბამება ექსპერიმენტული მიზნისა და ზონდის ტიპის ულტრაბგერით.
უპირატესობა ენიჭება ჰიპოტონურ ბუფერებს, რადგან ისინი აძლიერებენ უჯრედების ულტრაბგერით ლიზას. მნიშვნელოვანია, რომ დანამატები და მარილის კონცენტრაცია სათანადოდ იქნას გამოყენებული.
აირჩიეთ თქვენი ულტრაბგერითი ლიზის მოწყობილობა: ფლაკონების არაპირდაპირი გაჟღერებისთვის რეკომენდებულია VialTweeter ან CupHorn. მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტებისთვის, UIP400MTP იდეალური ულტრაბგერითია. და კლასიკური ზონდის ტიპის sonication, ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი, როგორც UP100H ან UP200Ht მიკრო წვერით ყველაზე შესაფერისია.
პროტოკოლი ზონდის ტიპის სონიკაციისთვის: მოათავსეთ ულტრაბგერითი ზონდი ნიმუშის მოცულობაში მიკროცენტრიფუგის მილში და დაახლ. 10 წამი. დნმ-ის ნიმუშიდან გამომდინარე, სონიკა შეიძლება განმეორდეს კიდევ ერთხელ ან ორჯერ. საჭირო ულტრაბგერითი ენერგიის შეყვანა (Ws/mL) დამოკიდებულია ნიმუშის სიბლანტეზე და დნმ-ის ტიპზე. გაგრილება ყინულის აბაზანით და ულტრაბგერითი პულსაციის რეჟიმით ხელს უშლის ნიმუშის თერმულად დეგრადაციას.
ულტრაბგერითი ლიზისის შემდეგ, ნიმუში ცენტრიფუგირდება მარცვლების ნარჩენების გამოსაყოფად (შეიცავს არალიზირებულ უჯრედებს, ბირთვებს და გაუანალიზებელ ორგანელებს)
თუ ნიმუში დაუყოვნებლივ არ იქნა დამუშავებული, მისი შენახვა შესაძლებელია შესაბამის ტემპერატურაზე მისი სიცოცხლისუნარიანობის შესანარჩუნებლად.

ულტრაბგერითი დნმ-ის ფრაგმენტაციისთვის

Hielscher Ultrasonics გთავაზობთ ულტრაბგერით დაფუძნებულ სხვადასხვა პლატფორმებს დნმ-ის, რნმ-ისა და ქრომატინის ფრაგმენტაციისთვის. ეს სხვადასხვა პლატფორმები მოიცავს ულტრაბგერითი ზონდებს (სონოტროდები), არაპირდაპირი სონიკაციის ხსნარებს მრავალი მილის ან მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტების ერთდროული ნიმუშის მოსამზადებლად (მაგ., 96 ჭაბურღილის ფირფიტები, მიკროტიტრული ფირფიტები), სონორეაქტორები და ულტრაბგერითი თასების რქები. დნმ-ის ჭრის ყველა პლატფორმა იკვებება სიხშირით მორგებული, მაღალი ხარისხის ულტრაბგერითი პროცესორებით, რომლებიც ზუსტად კონტროლირებადია და იძლევა გამეორებად შედეგებს.

ულტრაბგერითი პროცესორები ნებისმიერი ნიმუშის რაოდენობისა და ზომისთვის

With Hielscher’s multi-sample ultrasonicators VialTweeter (for up to 10 test tubes) and UIP400MTP (for microplates/ multiwell plates) it becomes easily possible to reduce sample processing time due to intense and precisely controllable ultrasonication whilst obtaining the desired DNA fragment size distribution and yield. Ultrasonic DNA fragmentation makes plasmid preparation steps efficient, reliable and scalable. Protocols can be linearly scaled from one to numerous samples by applying constant ultrasound parameters.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.