ულტრაბგერითი ლიზისი Western Blotting-ისთვის

• ვესტერნ ბლოტი არის ანალიტიკური პროცედურა ქსოვილის ჰომოგენატის ან უჯრედული ექსტრაქტის ნიმუშში სპეციფიკური ცილების გამოსავლენად.
• Western blot-ის გასატარებლად ან ფერმენტის აქტივობის გასაზომად, ბევრი ანალიზი მოითხოვს უჯრედში ჩარჩენილ მასალებს (მაგ. ცილებს, დნმ, უჯრედულ ფრაგმენტებს).
• Sonication არის საიმედო და ადვილად დასამუშავებელი მეთოდი უჯრედების კონტროლირებადი რღვევისა და ლიზისისთვის.

ულტრაბგერითი უჯრედების დარღვევა

პროტეინის ექსტრაქცია ქსოვილებიდან და კულტივირებული უჯრედებიდან არის პირველი ნაბიჯი მრავალი ბიოლოგიური, ბიოქიმიური და ანალიტიკური ტექნიკისთვის (PAGE, Western blotting, ELISA, მასის სპექტრომეტრია და ა.შ.) ან ცილების გაწმენდისთვის. ცილის მაღალი მოსავლიანობის მისაღებად, უჯრედული მასალა და ქსოვილი ეფექტურად უნდა დაირღვეს/ლიზიზდეს. იქნება ეს მცენარეული უჯრედი თუ ცხოველური ქსოვილი, სონიკა არის მეთოდი თქვენი უჯრედის ლიზატის მოსამზადებლად მარტივად და სწრაფად.

Sonication-ის უპირატესობები

• Სწრაფი & ეფექტური
• მარტივი ოპერაცია
• ცილის მაღალი მოსავლიანობა
• გამეორებადი/გამეორებადი
• ზუსტად კონტროლდება
• მასშტაბირებადი

იმუნოპრეციპიტაციის პროტოკოლი Western Immunoblotting-ისთვის

A. რეაგენტები

ხსნარების მოსამზადებლად გამოიყენეთ გაწმენდილი წყალი, როგორიცაა Milli-Q.

• 1X ფოსფატის ბუფერული ფიზიოლოგიური ხსნარი (PBS)
• 1X უჯრედის ლიზისის ბუფერი: 20 მმ ტრისი (pH 7,5), 150 მმ NaCl, 1 მმ EDTA, 1 მმ EGTA, 1% ტრიტონ X-100, 2,5 მმ ნატრიუმის პიროფოსფატი, 1 მმ β-გლიცეროფოსფატი, 1 მმოლ NaCl/O3 მლ ლეუპეპტინი
  მნიშვნელოვანია: დაუმატეთ 1 მმ PMSF გამოყენებამდე.
• 15 μl პროტეინი A+15 μl პროტეინი G საკმარისია IP-სთვის, მაგრამ ეს შეიძლება დამოკიდებული იყოს თქვენს პირველად ანტისხეულზე და ნიმუშის მოცულობაზე. თქვენ ასევე შეგიძლიათ გამოიყენოთ წინასწარ შერეული ცილა A/G აგაროზა (მაგ. პროტეინი A კურდღლის IgG ჩამოსაშლელისთვის და პროტეინი G თაგვის IgG ჩამოსაშლელისთვის)
• 3X SDS ნიმუშის ბუფერი: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 25°C-ზე), 6% w/v SDS, 30% გლიცეროლი, 150 mM DTT, 0.03% w/v ბრომფენოლი ლურჯი

ბ. უჯრედის ლიზატების მომზადება

• ამოიღეთ უჯრედები. უჯრედების მოსავლისთვის არადენატურაციის პირობებში, ამოიღეთ მედია და ჩამოიბანეთ უჯრედები ერთხელ ყინულივით ცივი PBS-ით.
• ამოიღეთ PBS და დაამატეთ 0,5 მლ ყინულივით ცივი 1X უჯრედის ლიზისის ბუფერი თითოეულ ფირფიტაზე (10 სმ) და ჩადეთ ფირფიტები ყინულზე 5 წუთის განმავლობაში.
• ამოიღეთ უჯრედები ფირფიტებიდან და გადაიტანეთ მიკროცენტრიფუგის მილებში. შეინახეთ ყინულზე.
• გაჟღენთეთ ორჯერ 10 წამის განმავლობაში ყინულივით ცივი იმუნოპრეციპიტაციის ბუფერში (IP ბუფერი: 50 მმ Tris-HCl [pH 7.4], 150 მმ NaCl, 5 მმ EDTA, 0.1% NP-40 და პროტეაზას ინჰიბიტორის ნაზავი). გახმოვანებისთვის, VialTweeter ან ზონდის ულტრაბგერითი, როგორიცაა UP100H ან UP200Ht ყველაზე შესაფერისია.
• ლიზატების ცენტრიფუგირება 15000 გ-ზე 10 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე.
• გადაიტანეთ სუპერნატანტი ახალ მილში. (საჭიროების შემთხვევაში, ლიზატის შენახვა შესაძლებელია -80°C ტემპერატურაზე.)
• დაამატეთ პირველადი ანტისხეული ზედაპირს. პირველადი ანტისხეულის ზენატანი ინკუბირებულია 1 სთ-ის განმავლობაში 4°C-ზე მსუბუქი აგიტაციით. პირველადი ანტისხეულები, როგორც წესი, ემატება 10-ჯერ მეტი კონცენტრირებული რაოდენობით, ვიდრე გამოიყენება Western blotting-ისთვის. (შეგიძლიათ დაიწყოთ 1 მკგ 100 მლ-ზე.)
• სუპერნატანი შემდგომ ინკუბირებულია პროტეინ A-აგაროზის (ინვიტროგენი) და პროტეინ G აგაროზის თანაბარი რაოდენობით ნარევით კიდევ 1 საათის განმავლობაში.
• გარეცხეთ აგაროზის მარცვლები სამჯერ IP ბუფერით. ამის შემდეგ, ამოიღეთ შეკრული ცილები SDS-PAGE დატვირთვის ბუფერით 95°C-ზე გაცხელებით 5 წუთის განმავლობაში.

გ. იმუნოპრეციპიტაცია

• მიიღეთ 200 მკლ უჯრედის ლიზატი და დაამატეთ პირველადი ანტისხეული. ინკუბაცია ნაზი რხევით ღამით 4°C-ზე.
• დაამატეთ პროტეინი A ან G აგაროზის მარცვლები (20 მკლ 50% მძივის ხსნარი). ინკუბაცია ნაზი ქანქარით 1-3 საათის განმავლობაში 4°C-ზე.
• მიკროცენტრიფუგა 30 წამის განმავლობაში 4°C-ზე. გარეცხეთ მარცვლები ხუთჯერ 500 μl 1X უჯრედის ლიზისის ბუფერით. შეინახეთ ყინულზე დაბანის დროს.
• შეაჩერეთ მარცვლები 20 μl 3X SDS ნიმუშის ბუფერით. მორევა, შემდეგ მიკროცენტრიფუგა 30 წამის განმავლობაში.
• გააცხელეთ ნიმუში 95-100°C-მდე 2-5 წუთის განმავლობაში და მიკროცენტრიფუგა 1 წუთის განმავლობაში 14000 X გ-ზე.
• ჩატვირთეთ ნიმუში (15–30 μl) SDS-PAGE გელზე (12–15%).
• ნიმუშის ანალიზი Western blotting-ით.

Western Blot ანალიზი Sonicator UP50H-ით

Kriebisch et al-ის კვლევაში გამოყენებული იქნა პრობ-ტიპის სონიკატორის გამოყენებით შემდეგი პროტოკოლი UP50H. (2011):
მთლიანი ცილა იზოლირებული იყო MC3T3-E1 უჯრედებიდან დამუშავებული 1,25(OH)₂დ₃ (10⁻⁸ მ) ან სატრანსპორტო საშუალება. უჯრედები ლიზირებული იყო ბუფერით, რომელიც შეიცავს 50 მმ Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 მმ NaCl (Fisher Scientific); 0,1% ნატრიუმის დოდეცილ სულფატი (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) და 0.5% ნატრიუმის დეოქსიქოლატი (Merck). უჯრედის ლიზატი 2 × 10 წმ. UP50H ულტრაბგერითი პროცესორი (Hielscher, ულტრაბგერითი ტექნოლოგია, Teltow, გერმანია). ამის შემდეგ მასალა ცენტრიფუგირებული იყო 10 წუთის განმავლობაში 14000 rpm-ზე და სუპერნატანტი გამოიყენებოდა Western blotting-ისთვის. ოცდახუთი მკგ ცილა მოხარშული იქნა ნიმუშის ბუფერში და შემცირების აგენტში (Invitrogen) და შემდგომ გამოეყო SDS-PAGE-ით 4-12% პოლიაკრილამიდის გელების (Invitrogen) გამოყენებით და გადატანილი იქნა ნიტროცელულოზის მემბრანაში (GE Health care). მემბრანა დაიბლოკა 1 საათის განმავლობაში TBS-ით (10 მმ ტრის-HCl; pH 7.6; 150 მმ NaCl), რომელიც შეიცავდა 1% კაზეინს (სიგმა-ოლდრიჩი) და 1% ტრის (1 მ). დაბლოკვის შემდეგ, მემბრანა ინკუბირებული იყო მცირე აჟიოტაჟით ღამით 4°C-ზე პირველადი ანტისხეულით (კურდღლის ანტიადამიანის CBS 1/500, შემუშავებული პროფ. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, აშშ) ლაბორატორიაში. რძის პეროქსიდაზას (HPR) კონიუგირებული მეორადი ანტისხეულით (Dako) ინკუბაცია ჩატარდა 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. ყველა ბლოტი განვითარდა გაძლიერებული ქიმილუმინესცენციით (პერკინ ელმერი).
 

დააწკაპუნეთ აქ, რომ წაიკითხოთ მეტი ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზისისა და ექსტრაქციის საუკეთესო პრაქტიკის, ლიზატის მომზადებისა და პროცესის გაუმჯობესების რეკომენდაციების შესახებ!
 
ქვემოთ მოყვანილი ცხრილი გაძლევთ მითითებას ჩვენი ლაბორატორიის ზომის ულტრაბგერითი აპარატების სავარაუდო დამუშავების შესაძლებლობის შესახებ:

ლიტერატურა / ლიტერატურა