• დასავლეთ blot არის ანალიტიკური პროცედურა გამოვლენის კონკრეტული პროტეინები ნიმუში ქსოვილის homogenate ან საკანში ექსტრაქტი.
• დასავლური ბლოტის გასაშვებად ან ფერმენტის აქტივობის შესამცირებლად, ბევრი ასი მოითხოვს უჯრედში მოთავსებულ მასალებს (მაგალითად, ცილები, დნმ, სუბკულარული ფრაგმენტები) წვდომას.
• Sonication არის სანდო და ადვილად გაუმკლავდეს მეთოდი კონტროლირებადი საკანში დარღვევა და lysis.

ულტრაბგერითი უჯრედის დარღვევა

ქსოვილებისა და კულტურული უჯრედების პროტეინის მოპოვებაა პირველი ბიოლოგიური, ბიოქიმიური და ანალიტიკური მეთოდების პირველი ნაბიჯი (გვერდი, დასავლეთის ბლოკირება, ELISA, მასობრივი სპექტრომეტრია და ა.შ.) ან ცილის გამწმენდი. მაღალი ცილის მოსავლის მისაღებად, საკნის მასალა და ქსოვილი უნდა იყოს ეფექტურად ჩაიშალა / იშვიათი. თუ არა მცენარეული საკანში ან ცხოველთა ქსოვილის, sonication არის მეთოდი მომზადება თქვენი საკანში lysate ადვილი და სწრაფი.

Sonication- ის უპირატესობები

• სწრაფი & ეფექტური
• მარტივი ოპერაცია
• მაღალი ცილის სარგებელი
• რეპროდუცირებადი / განმეორებითი
• ზუსტად კონტროლდება
• scalable

Immunoprecipitation ოქმი დასავლეთ Immunoblotting

ა. რეაგენტები

გადაწყვეტილებების მომზადების მიზნით გამოიყენეთ სუფთა წყალი, როგორიცაა Milli-Q.

• 1X ფოსფატის ბუფერირებული Saline (PBS)
• 1 x უჯრედის ლიზინგი ბუფერი: 20 მმ ტუზი (pH 7.5), 150 მმ ნატრიუმი, 1 მმ ეტეტა, 1 მმ ეგტა, 1% ტრიტონის X-100, 2.5 მმ სოდომი პიროფოსფატი, 1 მმ β- გლიცეროფაფატი, 1 მმ Na3VO4, 1 μg / მლ ლეპეპტინი
  მნიშვნელოვანია: დაუყოვნებლივ გამოიყენოთ 1 მმ PMSF.
• 15 μl Protein A + 15 μl Protein G არის საკმარისი IP, მაგრამ ეს დამოკიდებულია თქვენს პირველადი ანტისხეულების და ნიმუშების მოცულობის მიხედვით. ასევე შეგიძლიათ გამოიყენოთ წინასწარ შერეული ცილის A / G აგარაზი (მაგ. პროტეინი A კურდღლის იგგ-ს ქვემოთ და პროტეინი G)
• 3X SDS ნიმუში ბუფერული: 187.5 მმ Tris-HCl (pH 6.8 ზე 25 ° C), 6% w / s SDS, 30% გლიცერინი, 150 მმ DTT, 0.03% w / v ბრომოფონით ლურჯი

ბ) უჯრედის წყლების მომზადება

• საკნების მოსავლელი უჯრედების მოსავლელად პირობების გამოვლენა, მედიის ამოღება და უჯრედების ჩამოყალიბება ერთხელ ცივი ცივი PBS- თან.
• ამოიღეთ PBS და დაამატეთ 0.5 მლ ყინულის ცივი 1X საკანში lysis ბუფერი თითოეულ ფირფიტაზე (10 სმ) და 5 წუთის განმავლობაში ყინულის ფირფიტების ინკუბაცია.
• ფირფიტების ამოღება და მიკროციფრული მილების გადატანა. გააგრძელე ყინული.
• Sonicate- ის ცივი-ცივი იმუნოპრეპირების ბუფერში 10 წამის განმავლობაში (IP ბუფერი: 50 მმ ტრისი- HCl [pH 7.4], 150 მმ ნაკლს, 5 მმ EDTA, 0.1% NP-40 და პროტეაზების ინჰიბიტორი). იყიდება sonication, VialTweeter ან გამოკვლევა ულტრასონისთვის, როგორიცაა UP100H ან Uf200 ः t შესაფერისია.
• ცენტრიფუგა 15 000 გ 10 წუთის განმავლობაში 4 ° C ტემპერატურაზე.
• გადმოსვლა superernantant ახალი მილის. (საჭიროების შემთხვევაში, lysate შეიძლება შენახული -80 ° C.)
• დაამატეთ პირველადი ანტისხეული სუნიანტანს. პირველადი ანტისხეულის ზრდის ტემპერატურა 1 საათის განმავლობაში ინახება სინათლის საწინააღმდეგოდ, 4 ° C- ზე. პირველადი ანტისხეული ჩვეულებრივ დასძენს 10x უფრო კონცენტრირებულ რაოდენობას, ვიდრე ეს გამოიყენება დასავლეთის ბლოკირებაზე. (თქვენ შეიძლება დაიწყოს 100μL თითო 1 გგ.)
• შემდეგ მზერა ინახება პროტეინის A- აგაროზისა და პროტეინის G აგარუსის თანაბარი რაოდენობით 1 თ.
• ვაქცინის აგრეგატი სამჯერ, IP ბუფერით. შემდგომში, ექსტრაქტებით გადადიან SDS-PAGE დატვირთვის ბუფერით, გათბობის გზით 95 ° C- ს 5 წუთის განმავლობაში.

C. იმუნოპრეციტაცია

• მიიღეთ 200 μl საკანში lysate და დაამატოთ პირველადი ანტისხეულების. ინკუბატიანი რბილი ღუმელით ღამისთევა 4 ° C.
• დაამატეთ ცილოვანი ან ანატოლიული აგენტები (20 μl 50% bead slurry). Incubate ერთად ნაზი rocking 1-3 საათი 4 ° C.
• მიკროციფრიგაცია 30 წამში 4 ° C- ზე. სარეცხი ნალექის ხუთჯერ 500 მლ 1X საკანში lysis ბუფერი. შეინახეთ ყინვის დროს.
• აღსანიშნავად pellet 20 μl 3X SDS ნიმუში ბუფერული. Vortex, მაშინ მიკროცენფურია 30 წამი.
• სითბოს ნიმუში 95-100 ° C 2-5 წუთი და მიკროცენტრიფუგა 1 წუთი 14,000 X გ.
• ჩატვირთეთ ნიმუში (15-30 μl) SDS-PAGE ლარიზე (12-15%).
• გაანალიზეთ ნიმუში დასავლური ბლოკით.

Western Blot ანალიზი ულტრაბგერითი UP50H

შემდეგი ოქმი გამოყენებული იქნა კრიშისკის და სხვა ალტერნატივების შესწავლით. (2011):
სულ ცილოვანი იყო იზოლირებული MC3T3-E1 უჯრედების მკურნალობა 1,25 (OH)₂დ₃ (10^-8 M) ან მანქანა. უჯრედები lapsed ერთად ბუფერული შემცველი 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 მმ NaCl (ფიშერი სამეცნიერო); 0.1% ნატრიუმის დოდიცილ სულფატი (SDS) (ფიშერი სამეცნიერო); 1% IGEPAL CA-630 (სიგმა-ალდრიხ) და 0.5% ნატრიუმის დეოქსიოქოლატი (მერკი). საკანში lysate იყო sonicated 2 × 10 s at ციკლი 1 და ამპლიტუდა 80 ერთად UP50H ულტრაბგერითი პროცესორი (Hielscher, ულტრაბგერითი ტექნოლოგია, Teltow, გერმანია). მას შემდეგ, რაც მასალა 14 მილიონზე მეტია, 10 წთ-ის ცენტრიფუგირებული იყო და ზემდგომმა გამოყენებულ იქნა დასავლეთის ბლოკირება. პროტეინის ოცდამეხუთეგვრიანი პროტეინით მოხდა ნიმუშების ბუფერი და შეამცირა აგენტი (ამბიტრია) და შემდგომ განცალკევებულ იქნა SDS-PAGE- ის მიერ 4-12% პოლილიკრილამიდული ლარით (Invitrogen) გამოყენებით და გადაყვანილ იქნა nitrocellulose membrane (GE ჯანდაცვის). მემბრანის ბლოკირება მოხდა 1 საათისთვის TBS- ით (10 მმ-ის Tris-HCl; pH 7.6; 150 მმ NaCl), რომელიც შეიცავს 1% ქეისინს (სიგმა- ალდრიხ) და 1% Tris (1 M). ბლოკირების შემდეგ, მემბრანა ღებულობდა ღამის 4 საათზე ღამისთევა პირველადი ანტისხეულის (კურდღლის საწინააღმდეგო ადამიანის CBS 1/500), რომელიც შემუშავდა პროფესორ რ.ბანერჯის ლაბორატორიაში, ანა არბორში, MI, აშშ). ინკუბაცია ცხენებით შეშუპებით (HPR) - კონიუგირებული საშუალო ანტისხეული (Dako) ოთახის ტემპერატურაზე 1 სთ. ყველა blot მიერ შემუშავებული გაუმჯობესებული chemiluminescence (Perkin Elmer).

ლიტერატურა / ცნობები