ულტრაბგერითი ლიზისი ვესტერნ ბლოტინგისთვის

• ვესტერნ ბლოტი არის ანალიზური პროცედურა, რომელიც გამოიყენება სპეციფიკური ცილების აღმოსაჩენად ქსოვილის ჰომოგენატის ან უჯრედული ექსტრაქტის ნიმუშში.
• ვესტერნ ბლოტის ჩასატარებლად ან ფერმენტული აქტივობის გასაზომად, ბევრი ანალიზი მოითხოვს უჯრედში ჩაკეტილი მასალების (მაგ. ცილები, დნმ, უჯრედშინა ფრაგმენტები) მიწოდებას.
• ულტრაბგერითი დამუშავება არის საიმედო და მარტივად მართვადი მეთოდი უჯრედების კონტროლირებადი დესტრუქციისა და ლიზისისთვის.

ულტრაბგერითი უჯრედული დესტრუქცია

ცილების ექსტრაქცია ქსოვილებიდან და კულტივირებული უჯრედებიდან არის პირველი ნაბიჯი ბევრი ბიოლოგიური, ბიოქიმიური და ანალიზური ტექნიკისთვის (PAGE, ვესტერნ ბლოტინგი, ELISA, მას-სპექტრომეტრია და ა.შ.) ან ცილების გასუფთავებისთვის. მაღალი ცილოვანი გამოსავლიანობის მისაღებად, უჯრედული მასალა და ქსოვილი უნდა იყოს ეფექტურად დესტრუქციული/ლიზირებული. იქნება ეს მცენარეული უჯრედი თუ ცხოველური ქსოვილი, ულტრაბგერითი დამუშავება არის მეთოდი თქვენი უჯრედული ლიზატის მარტივად და სწრაფად მოსამზადებლად.

ულტრაბგერითი დამუშავების უპირატესობები

• სწრაფი და ეფექტური
• მარტივი ექსპლუატაცია
• მაღალი ცილოვანი გამოსავლიანობა
• რეპროდუცირებადი/განმეორებადი
• ზუსტად კონტროლირებადი
• მასშტაბირებადი

იმუნოპრეციპიტაციის პროტოკოლი ვესტერნ იმუნობლოტინგისთვის

A. რეაგენტები

ხსნარების მოსამზადებლად გამოიყენეთ გაწმენდილი წყალი, როგორიცაა Milli-Q.

• 1X ფოსფატით ბუფერული მარილიანი ხსნარი (PBS)
• 1X უჯრედული ლიზისის ბუფერი: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM ნატრიუმის პიროფოსფატი, 1 mM β-გლიცეროფოსფატი, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml ლეუპეპტინი
  მნიშვნელოვანია: დაამატეთ 1 mM PMSF პირდაპირ გამოყენების წინ.
• 15 μl ცილა A + 15 μl ცილა G საკმარისია IP-სთვის, მაგრამ ეს შეიძლება დამოკიდებული იყოს თქვენს პირველად ანტისხეულზე და ნიმუშის მოცულობაზე. თქვენ ასევე შეგიძლიათ გამოიყენოთ წინასწარ შერეული ცილა A/G აგაროზა (მაგ. ცილა A კურდღლის IgG-ის ჩამოშლისთვის და ცილა G თაგვის IgG-ის ჩამოშლისთვის)
• 3X SDS ნიმუშის ბუფერი: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 25°C-ზე), 6% w/v SDS, 30% გლიცერინი, 150 mM DTT, 0,03% w/v ბრომოფენოლის ლურჯი

B. უჯრედული ლიზატების მომზადება

• მოაგროვეთ უჯრედები. უჯრედების არადენატურირებელ პირობებში მოსაგროვებლად, მოაცილეთ საკვები არე და ერთხელ გაავლეთ უჯრედები ყინულივით ცივი PBS-ით.
• მოაცილეთ PBS და დაამატეთ 0,5 ml ყინულივით ცივი 1X უჯრედული ლიზისის ბუფერი თითოეულ ფირფიტას (10 cm) და ინკუბირეთ ფირფიტები ყინულზე 5 წუთის განმავლობაში.
• ჩამოაცალეთ უჯრედები ფირფიტებიდან და გადაიტანეთ მიკროცენტრიფუგის მილებში. შეინახეთ ყინულზე.
• ულტრაბგერითი დამუშავება ორჯერ 10 წამის განმავლობაში ყინულის ცივ იმუნოპრეციპიტაციის ბუფერში (IP ბუფერი: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 და პროტეაზის ინჰიბიტორების ნარევი). ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის, ყველაზე შესაფერისია VialTweeter ან პრობულიანი ულტრაბგერითი სონიკატორი, როგორიცაა UP100H ან UP200Ht .
• ცენტრიფუგირეთ ლიზატები 15 000 g-ზე 10 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე.
• გადაიტანეთ ზედა ფენა (სუპერნატანტი) ახალ ლულაში. (საჭიროების შემთხვევაში, ლიზატი შეიძლება შეინახოთ –80°C-ზე.)
• დაამატეთ პირველადი ანტისხეული ზედა ფენას. ზედა ფენა პირველადი ანტისხეულით ინკუბირდება 1 სთ 4°C-ზე მსუბუქი აღრევის პირობებში. პირველადი ანტისხეული ტიპურად ემატება ისეთი რაოდენობით, რომელიც 10-ჯერ უფრო კონცენტრირებულია, ვიდრე ვესტერნ ბლოტინგისთვის გამოიყენება. (თქვენ შეგიძლიათ დაიწყოთ 1μg თითო 100μL-ზე.)
• ზედა ფენა შემდეგ ინკუბირდება თანაბარი რაოდენობის ცილა A-აგაროზის (Invitrogen) და ცილა G აგაროზის ნარევთან ერთად კიდევ 1 სთ.
• გარეცხეთ აგაროზის ნალექი სამჯერ IP ბუფერით. შემდეგ, ექსტრაჰირეთ დაკავშირებული ცილები SDS-PAGE დატვირთვის ბუფერით 95°C-ზე 5 წუთის განმავლობაში გაცხელებით.

C. იმუნოპრეციპიტაცია

• აიღეთ 200 μl უჯრედული ლიზატი და დაამატეთ პირველადი ანტისხეული. ინკუბირეთ მსუბუქი მოძრაობით ღამის განმავლობაში 4°C-ზე.
• დაამატეთ ან ცილა A, ან G აგაროზის მარცვლები (20 μl 50% მარცვლების სუსპენზია). ინკუბირეთ მსუბუქი მოძრაობით 1–3 საათის განმავლობაში 4°C-ზე.
• მიკროცენტრიფუგირეთ 30 წამის განმავლობაში 4°C-ზე. გაავლეთ ნალექი ხუთჯერ 500 µl 1X უჯრედული ლიზისის ბუფერით. შეინახეთ ყინულზე გასარეცხი დროს.
• ხელახლა შეაგროვეთ ნალექი 20 μl 3X SDS ნიმუშის ბუფერში. ვორტექსირეთ, შემდეგ მიკროცენტრიფუგირეთ 30 წამის განმავლობაში.
• გააცხელეთ ნიმუში 95–100°C-მდე 2–5 წუთის განმავლობაში და მიკროცენტრიფუგირეთ 1 წუთის განმავლობაში 14 000 X g-ზე.
• დატვირთეთ ნიმუში (15–30 μl) SDS-PAGE გელზე (12–15%).
• ანალიზეთ ნიმუში ვესტერნ ბლოტინგით.

ვესტერნ ბლოტ ანალიზი სონიკატორით UP50H

შემდეგი პროტოკოლი, რომელიც იყენებს პრობულიანი ტიპის სონიკატორს UP50H, გამოიყენებოდა Kriebisch et al. (2011) კვლევაში:
მთლიანი ცილა იზოლირებული იყო MC3T3-E1 უჯრედებიდან, რომლებიც დამუშავებული იყო 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) ან მატარებელი ხსნარით. უჯრედები ლიზირებული იყო ბუფერით, რომელიც შეიცავდა 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% ნატრიუმის დოდეცილსულფატი (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) და 0,5% ნატრიუმის დეოქსიქოლატი (Merck). უჯრედული ლიზატი ულტრაბგერითი დამუშავებას ექვემდებარებოდა 2 × 10 წამის განმავლობაში ციკლი 1-ზე და ამპლიტუდა 80-ზე UP50H ულტრაბგერითი პროცესორით (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Germany). შემდეგ, მასალა ცენტრიფუგირებული იყო 10 წუთის განმავლობაში 14 000 rpm-ზე და ზედა ფენა გამოიყენებოდა ვესტერნ ბლოტინგისთვის. ოცდახუთი μg ცილა მოხარშული იყო ნიმუშის ბუფერში და აღმდგენ აგენტში (Invitrogen) და შემდეგ დაყოფილი იყო SDS-PAGE-ით 4–12% პოლიაკრილამიდის გელების გამოყენებით (Invitrogen) და გადატანილი იყო ნიტროცელულოზის მემბრანაზე (GE health care). მემბრანა დაბლოკილი იყო 1 სთ TBS-ით (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl), რომელიც შეიცავდა 1% კაზეინს (Sigma-Aldrich) და 1% Tris-ს (1 M). დაბლოკვის შემდეგ, მემბრანა ინკუბირებული იყო მსუბუქი აღრევით ღამის განმავლობაში 4°C-ზე პირველადი ანტისხეულით (კურდღლის ანტი-ადამიანური CBS 1/500, შემუშავებული პროფ. R. Banerjee-ის ლაბორატორიაში, Ann Arbor, MI, USA). ინკუბაცია ცხენის ისლის პეროქსიდაზასთან (HPR) კონიუგირებულ მეორეულ ანტისხეულთან (Dako) შესრულდა 1 სთ ოთახის ტემპერატურაზე. ყველა ბლოტი ვიზუალიზებული იყო გაძლიერებული ქიმიოლუმინესცენციით (Perkin Elmer).

დააწკაპუნეთ აქ, რათა მეტი გაიგოთ ულტრაბგერითი უჯრედული ლიზისისა და ექსტრაქციის, ლიზატის მომზადებისა და პროცესის გაუმჯობესების რეკომენდაციების საუკეთესო პრაქტიკის შესახებ!

ქვემოთ მოცემული ცხრილი გაძლევთ წარმოდგენას ჩვენი ლაბორატორიული ზომის ულტრაბგერითი სონიკატორების დაახლოებითი დამუშავების შესაძლებლობებზე:

ლიტერატურა / რეფერენციები

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.