ქრომატინის დაშლა ულტრაბგერითი დამუშავებით

ქრომატინის დაშლა კრიტიკული ეტაპია მრავალ ეპიგენეტიკურ და მოლეკულურ-ბიოლოგიურ სამუშაო პროცესში, განსაკუთრებით ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაციის (ChIP), ChIP-seq-ის და მათთან დაკავშირებული ანალიზების დროს. მიზანია ქრომატინის დაშლა რეპროდუცირებად დნმ-ცილა კომპლექსებად, ეპიტოპების მთლიანობის შენარჩუნებითა და ნიმუშის დაკარგვის მინიმიზაციით. არსებული მეთოდებს შორის, ულტრაბგერითი ქრომატინის ფრაგმენტაცია ფართოდ გავრცელებული მიდგომა გახდა, რადგან ის უზრუნველყოფს საიმედო, რეაგენტების გარეშე ფრაგმენტაციას შესანიშნავი რეპროდუცირებადობით.

რა უნდა გავითვალისწინოთ ქრომატინის დაშლისას?

ქრომატინის ეფექტური დაშლა მოითხოვს ექსპერიმენტული პარამეტრების ზედმიწევნით კონტროლს. არასწორი ფრაგმენტაცია შეიძლება შეაფერხოს შემდგომი ChIP ექსპერიმენტები, რადგან წარმოიქმნება ფრაგმენტები, რომლებიც ან ზედმეტად დიდია, ან ზედმეტად დაშლილია, ან ნიმუშებს შორის არათანმიმდევრულია.
ერთ-ერთი ყველაზე მნიშვნელოვანი ფაქტორია სასურველი ფრაგმენტების ზომის განაწილება. უმეტეს ChIP და ChIP-seq გამოყენებებისთვის, ოპტიმალურია 100-დან 600 ფუძე-პარამდე ქრომატინის ფრაგმენტები. ეს ზომის დიაპაზონი უზრუნველყოფს ეფექტურ იმუნოპრეციპიტაციას და საკმარის რეზოლუციას გენომის დასამაპინგად.

მეორე მნიშვნელოვანი ფაქტორია ჯვარედინი შეკავშირების ეფექტურობა ულტრაბგერით დამუშავებამდე. უმეტეს ChIP სამუშაო პროცესებში ცილა-დნმ ურთიერთქმედებების სტაბილიზაციისთვის გამოიყენება ფორმალდეჰიდური ფიქსაცია. თუმცა, ზედმეტი ჯვარედინი შეკავშირება ქრომატინს ფრაგმენტაციის მიმართ უფრო მდგრადს ხდის, რაც მოითხოვს ულტრაბგერითი დამუშავების უფრო გრძელ დროს და შესაძლოა გაზარდოს სითბური ზემოქმედება.
ტემპერატურის კონტროლიც მნიშვნელოვანია. ულტრაბგერითი დამუშავება წარმოქმნის ლოკალიზებულ ენერგიას, რომელსაც შეუძლია გაზარდოს ნიმუშის ტემპერატურა. მაღალი ტემპერატურა შეიძლება დააზიანოს დნმ-ს ან დენატურირება გაუკეთოს ცილებს, რაც ChIP-ის დროს ანტისხეულების ამოცნობაზე იმოქმედებს. ამიტომ, ბევრი მკვლევარი იყენებს იმპულსურ ულტრაბგერით ციკლებს გაგრილების ინტერვალებთან ერთად, რათა შეინარჩუნოს ნიმუშის სტაბილურობა.
ნიმუშის კონცენტრაცია და მოცულობაც აისახება ფრაგმენტაციის ეფექტურობაზე. მაღალკონცენტრირებული ქრომატინის სუსპენზიები შესაძლოა მოითხოვდეს ულტრაბგერითი დამუშავების უფრო გრძელ დროს, ხოლო მცირე მოცულობის ნიმუშები მოითხოვს ენერგიის ზუსტ მიწოდებას ზედმეტი დამუშავების თავიდან ასაცილებლად.
დაბოლოს, ულტრაბგერითი მოწყობილობის არჩევანი ძლიერ აისახება ექსპერიმენტულ რეპროდუცირებადობაზე. ქრომატინის დაშლისთვის განკუთვნილი მოწყობილობები, როგორც წესი, უზრუნველყოფენ კონტროლირებად ულტრაბგერით ენერგიას და სტანდარტიზებულ ნიმუშების მართვას, რაც საშუალებას იძლევა მიღწეულ იქნას მდგრადი ფრაგმენტაცია მრავალი ნიმუშისთვის.

რომელი ულტრაბგერითი გენერატორი უნდა ავირჩიოთ ქრომატინის დაშლისთვის?

სხვადასხვა ლაბორატორიული სამუშაო პროცესები სხვადასხვა ულტრაბგერით კონფიგურაციას მოითხოვს. ოპტიმალური სისტემა ძირითადად დამოკიდებულია ნიმუშების გამტარუნარიანობაზე, მოცულობასა და ექსპერიმენტულ ფორმატზე.

პრობის ტიპის ულტრაბგერითი გენერატორი

პრობის ტიპის ულტრაბგერითი გენერატორი ულტრაბგერით ენერგიას პირდაპირ აწვდის ნიმუშს ტიტანის პრობის საშუალებით. ეს კონფიგურაცია უზრუნველყოფს ძალიან მაღალ ენერგეტიკულ სიმკვრივეს და ამიტომ შესაფერისია ცალკეული ნიმუშების ქრომატინის მყარი დისრუფციისთვის.

პრობის ულტრაბგერითი გენერატორები განსაკუთრებით სასარგებლოა:

• მცირე და საშუალო რაოდენობის ნიმუშებისთვის
• რთულად დასაშლელი ქრომატინისთვის
• მოქნილი ექსპერიმენტული პროტოკოლებისთვის

მრავალსაცინტავიანი ულტრაბგერითი გენერატორი – VialTweeter

ლაბორატორიებისთვის, რომლებიც მუშაობენ მრავალ ნიმუშზე პარალელურად, VialTweeter მრავალსაცინტავიანი ულტრაბგერითი გენერატორი უზრუნველყოფს მაღალ რეპროდუცირებად გადაწყვეტილებას. სისტემა ულტრაბგერით ენერგიას ირიბად გადასცემს საცინტავების დამჭერის საშუალებით, რაც საშუალებას იძლევა რამდენიმე დახურული საცინტავი დაიშალოს იდენტურ პირობებში.

ეს კონფიგურაცია მნიშვნელოვან უპირატესობებს გთავაზობთ:

• მრავალი ნიმუშის პარალელური ქრომატინის დაშლა
• პრობის კონტამინაციის აღმოფხვრა
• მაღალი რეპროდუცირებადობა საცინტავებს შორის
• ChIP ნიმუშების მომზადების გამარტივებული სამუშაო პროცესი

ასეთი მრავალსაცინტავიანი სისტემები შესაფერისია ჩვეულებრივი ChIP ექსპერიმენტებისა და საშუალო გამტარუნარიანობის კვლევებისთვის.
 

მიკროპლატის ულტრაბგერითი გენერატორი – UIP400MTP

მაღალი გამტარუნარიანობის ეპიგენეტიკური კვლევები სულ უფრო მეტად ეყრდნობა მიკროპლატებზე დაფუძნებულ ნიმუშების დამუშავებას. მიკროპლატის ულტრაბგერითი გენერატორი UIP400MTP განკუთვნილია ქრომატინის უშუალოდ სტანდარტულ მიკროპლატებში დასაშლელად ნიმუშების გადატანის გარეშე.

ეს მიდგომა იძლევა შესაძლებლობას:

• ათეული ან ასეული ნიმუშის პარალელური დამუშავება
• ავტომატიზაციისთვის მოსახერხებელი სამუშაო პროცესები
• ულტრაბგერითი ენერგიის ერთგვაროვანი განაწილება ჩაღრმავებებში
• ნიმუშის დამუშავების ეტაპების მნიშვნელოვანი შემცირება

დიდი ChIP-seq სკრინინგის პროექტებისთვის ან მაღალი გამტარუნარიანობის ეპიგენეტიკური კვლევებისთვის, მიკროპლატის ულტრაბგერითი დამუშავება უზრუნველყოფს გამორჩეულ მასშტაბირებადობასა და ეფექტურობას. მრავალჩაღრმავებიანი პლატის ულტრაბგერითი გენერატორი UIP400MTP შესანიშნავად ერგება სითხის დამუშავების სისტემებში ინტეგრაციას და ავტომატიზებულ ლაბორატორიულ სამუშაო პროცესებს.
 

რატომ უნდა აირჩიოთ ულტრაბგერითი დამუშავება ქრომატინის დასაფშვნი სხვა ტექნიკებთან შედარებით?

ფერმენტულ მიდგომებთან შედარებით, ChIP-ისთვის ულტრაბგერითი დამუშავება უზრუნველყოფს მიუკერძოებელ ფრაგმენტაციას, რადგან პროცესი არ არის დამოკიდებული სეკვენს-სპეციფიკურ ფერმენტულ აქტივობაზე. ეს განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია გენომის მასშტაბის ეპიგენეტიკური კვლევებისთვის, სადაც ერთგვაროვანი დაფარვა აუცილებელია.
კიდევ ერთი მთავარი უპირატესობა მასშტაბირებადობაა. ულტრაბგერითი სისტემები შეუძლიათ მიიღონ ცალკეული ნიმუშები, მრავალი სინჯარა ან მთლიანი მიკროპლატები, რაც ლაბორატორიებს საშუალებას აძლევს, აირჩიონ ყველაზე შესაფერისი კონფიგურაცია მათი ექსპერიმენტული გამტარუნარიანობისთვის.
დაბოლოს, ულტრაბგერითი დამუშავება უზრუნველყოფს ფრაგმენტაციის პარამეტრების შესანიშნავ კონტროლს. პულსაციის ციკლების, ხანგრძლივობისა და სიმძლავრის დონეების კორექტირებით, მკვლევრებს შეუძლიათ საიმედოდ მიაღწიონ სასურველ ფრაგმენტების ზომის განაწილებას.

როგორ გავაზომო და შევაფასო ქრომატინის წარმოება ულტრაბგერითი ფრაგმენტაციის შემდეგ?

ChIP-ისთვის ულტრაბგერითი დამუშავების შემდეგ, მკვლევრებმა უნდა შეაფასონ ფრაგმენტირებული ქრომატინის როგორც რაოდენობა, ისე ხარისხი. ეს დადასტურების ეტაპი უზრუნველყოფს, რომ ქრომატინის ფრაგმენტაცია აკმაყოფილებს შემდგომი გამოყენების მოთხოვნებს, როგორიცაა ChIP-qPCR ან ChIP-seq.
რაოდენობრივი ანალიზი ჩვეულებრივ იწყება დნმ-ის კონცენტრაციის გაზომვით. სპექტროფოტომეტრიული მეთოდები, როგორიცაა Nanodrop ანალიზი, ან ფლუორომეტრული ტესტები, როგორიცაა Qubit დნმ-ის რაოდენობრივი ანალიზი, უზრუნველყოფენ ქრომატინის წარმოების საიმედო შეფასებებს დე-ჯვარება და გაწმენდის შემდეგ.
თუმცა, დნმ-ის კონცენტრაცია მარტო არ აჩვენებს, წარმატებული იყო თუ არა ფრაგმენტაცია. ამიტომ, მკვლევრები აფასებენ ფრაგმენტების ზომის განაწილებას ელექტროფორეზული ტექნიკების გამოყენებით. აგაროზის გელის ელექტროფორეზი რჩება ხშირად გამოყენებად მიდგომად დნმ-ის ფრაგმენტების ვიზუალიზაციისა და იმის დასადასტურებლად, რომ უმეტესობა მოხვდება სამიზნე ზომის დიაპაზონში.
უფრო პროგრესული ლაბორატორიები ხშირად იყენებენ კაპილარული ელექტროფორეზის სისტემებს, როგორიცაა Agilent Bioanalyzer ან TapeStation. ეს პლატფორმები უზრუნველყოფენ ზუსტ ზომის განაწილების პროფილებს და საშუალებას აძლევს მკვლევრებს, აღმოაჩინონ ზედმეტი ფრაგმენტაცია ან არასრული დაფშვნა.

როდესაც ულტრაბგერითი ფრაგმენტაციის შემდეგ ქრომატინის ხარისხს აფასებენ, მკვლევრები ჩვეულებრივ ადასტურებენ:

• დნმ-ის ფრაგმენტების უმეტესობა მოხვდება 100–600 bp დიაპაზონში
• ფრაგმენტების განაწილება თანმიმდევრულია განმეორებით ნიმუშებში
• დნმ-ის დეგრადაცია მინიმალურია
• ქრომატინის ჯამური გამოსავალი საკმარისია დაგეგმილი ChIP ანალიზისთვის

ხარისხის სწორი კონტროლი უზრუნველყოფს, რომ ქრომატინის ულტრაბგერითი ფრაგმენტაციის ეტაპი იძლევა გამეორებად და ბიოლოგიურად მნიშვნელოვან შედეგებს.

დასკვნა: ქრომატინის ულტრაბგერითი ფრაგმენტაცია სანდო კვლევისთვის

სანდო ქრომატინის ფრაგმენტაცია ფუნდამენტურია წარმატებული ChIP და ეპიგენეტიკური კვლევებისთვის. ულტრაბგერითი ფრაგმენტაცია სთავაზობს მძლავრ გადაწყვეტას, რადგან ის შესაძლებელს ხდის ზუსტ, გამეორებად და რეაგენტების გარეშე ქრომატინის დანგრევას ფართო ექსპერიმენტული ფორმატების დიაპაზონში.
ულტრაბგერითი დამუშავების პარამეტრების ფრთხილი ოპტიმიზაციით, ფრაგმენტების ზომის განაწილების ვერიფიკაციით და შესაბამისი ულტრაბგერითი სისტემის შერჩევით – იქნება ეს პრობის ტიპის სონიკატორი, მრავალმილური VialTweeter, თუ მაღალი გამტარუნარიანობის UIP400MTP მიკროპლატის სონიკატორი – მკვლევრებს შეუძლიათ მიაღწიონ ქრომატინის თანაბარ ფრაგმენტაციას, რომელიც უზრუნველყოფს მაღალი ხარისხის ChIP და ChIP-seq შედეგებს.
რადგან ეპიგენეტიკური კვლევები გრძელდება უფრო მაღალი გამტარუნარიანობისა და ექსპერიმენტული გამეორებადობისკენ, ქრომატინის ულტრაბგერითი ფრაგმენტაცია რჩება ერთ-ერთ ყველაზე მრავალმხრივ და სანდო მეთოდად, რომელიც ხელმისაწვდომია თანამედროვე მოლეკულური ბიოლოგიის ლაბორატორიებისთვის.

დამუშავება, წარმოება და კონსულტირება – ხარისხი დამზადებულია გერმანიაში

Hielscher ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები ცნობილია თავიანთი უმაღლესი ხარისხისა და დიზაინის სტანდარტებით. მდგრადობა და მარტივი ექსპლუატაცია საშუალებას იძლევა ჩვენი ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები შეუფერხებლად ინტეგრირდეს ინდუსტრიულ ობიექტებში. მძიმე პირობებსა და მოთხოვნად გარემოს Hielscher ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები მარტივად უმკლავდებიან.

Hielscher Ultrasonics არის ISO სერტიფიცირებული კომპანია და განსაკუთრებულ მნიშვნელობას ანიჭებს მაღალი წარმადობის ულტრაბგერით ჰომოგენიზატორებს, რომლებიც მუშაობენ თანამედროვე ტექნოლოგიებით და მომხმარებლისთვის მოსახერხებელია. რა თქმა უნდა, Hielscher ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები შეესაბამება CE სტანდარტებს და აკმაყოფილებენ UL, CSA და RoHs მოთხოვნებს.

ლიტერატურა / რეფერენსები

• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
• Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
• José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
• Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)