Proteomic Workflows მაღალი გამტარუნარიანობის ცილის მონელებით

პროტეომიკა არის არსებითი სფერო ბიოლოგიური პროცესებისა და სისტემების გასაგებად, პროტეინის მონელება ქმნის კრიტიკულ ნაბიჯს მის სამუშაო პროცესებში. ტრადიციულად, ცილის მონელება ხორციელდება ხსნარში პროტეოლიზური ფერმენტების გამოყენებით, როგორიცაა ტრიპსინი, რომელიც სპეციალურად აჰიდროლიზებს პეპტიდურ ობლიგაციებს ლიზინისა და არგინინის ნარჩენებზე. ეს პროცესი წარმოქმნის პეპტიდებს, რომლებიც კარგად შეეფერება იონიზაციისა და ფრაგმენტაციისთვის მასსპექტრომეტრიის (MS) აპლიკაციებში. თუმცა, ჩვეულებრივი მონელების მეთოდები მოითხოვს 12-24 საათს, რათა მიაღწიოს დასრულებას, რაც ქმნის მნიშვნელოვან შეფერხებებს პროტეომიურ სამუშაო პროცესებში.
ულტრაბგერითი გთავაზობთ ძლიერ ალტერნატივას, რომელიც მკვეთრად ამცირებს საჭმლის მონელების დროს საათებიდან რამდენიმე წუთამდე. როდესაც კომბინირებულია მოწინავე მრავალ სინჯის სონიკატორებთან, როგორიცაა Hielscher CupHorn, VialTweeter და 96-ჭაჭიანი ფირფიტის sonicator UIP400MTP, ულტრაბგერითი დაჩქარებული, მაღალი გამტარუნარიანობის პროტეომის საშუალებას იძლევა. ეს ტექნოლოგიები აუმჯობესებს სამუშაო პროცესებს, ამცირებს ნიმუშის მომზადების დროს და ზრდის ეფექტურობას გამეორებადობის ან მონაცემთა ხარისხის კომპრომისის გარეშე.

ულტრაბგერითი ენერგიის როლი ცილების მონელებაში

ულტრაბგერითი დამუშავება იყენებს ფოკუსირებულ ულტრაბგერითი ტალღებს, რათა შეიქმნას კავიტაცია - ლოკალიზებული მიკრობუშტები, რომლებიც იშლება ძლიერი ათვლის ძალების წარმოქმნით. ეს ფენომენი აძლიერებს მასის გადაცემას, ხელს უწყობს ფერმენტების შერევას სუბსტრატებთან და აყალიბებს ცილის სტრუქტურებს, ავლენს დაშლის ადგილებს პროტეოლიზურ ფერმენტებთან, როგორიცაა ტრიპსინი.
შედეგი? საჭმლის მონელების დროის მნიშვნელოვანი შემცირება ეფექტურობისა და გამრავლების კომპრომისის გარეშე.

ულტრაბგერითი გაძლიერებული პროტეოლიზური მონელება: მეთოდოლოგია და შედეგები

დაჩქარებული მონელების პროტოკოლი

ულტრაბგერითი დახმარებით საჭმლის მონელება აერთიანებს პროტეოლიზურ ფერმენტებს და ულტრაბგერითი ენერგია, რათა დააჩქაროს სამუშაოები. მაგალითად, Hielscher UP200St-CupHorn-ის (200 W, 26 kHz) გამოყენებით, მონელების სამუშაო პროცესი შემდეგნაირად მიმდინარეობს:

1. შემცირება: ცილის ნიმუშები (0.5 მგ/მლ, 20 μL) მუშავდება DTT-ით (2 μL, 110 მმ) ამონიუმის ბიკარბონატის ბუფერში (12.5 მმ). Sonication გამოიყენება 50% ამპლიტუდაზე 5 წუთის განმავლობაში.
2. ალკილაცია: IAA-ს (2 μL, 400 მმ) დამატების შემდეგ, სონიკირება მეორდება იმავე პირობებში.
3. მონელება: ნიმუშები განზავებულია და ინკუბირებულია იმობილიზებული ტრიფსინის ნანონაწილაკებით. სონიკაციის ბოლო რაუნდი (5 წუთი) სრულდება საჭმლის მონელება. პეპტიდები გამოყოფილია, გაშრება და ინახება MS ანალიზისთვის.

ეს ულტრაბგერითი მეთოდი ამცირებს მომზადების მთლიან დროს 12 საათიდან 30 წუთამდე. დაჩქარებული პროცესის მიუხედავად, პეპტიდის მოსავლიანობა და ხარისხი რჩება ტრადიციული ღამის მეთოდებთან შესაბამისობაში.

ულტრაბგერითი პროტეინის მონელების ეფექტურობა

შედარებით კვლევებში E. coli პროტეომების გამოყენებით:

• ცილის იდენტიფიკაცია: ულტრაბგერითი მონელების ნიმუშებმა 5 წუთში გამოავლინა 777 ცილა, 12 საათში 817-თან შედარებით. საერთო ცილის იდენტიფიკაცია 70%-ს აჭარბებდა.
• განმეორებადობა: განმეორებითმა ანალიზებმა აჩვენა კორელაციის მნიშვნელობები 98%-ზე მეტი თითოეული მეთოდის ფარგლებში, რაც ადასტურებს სანდოობას.
• შერჩევითობა: გარკვეული პროტეინები უპირატესად შეიწოვებოდა თითოეული მეთოდით, ულტრაბგერითი მონელება ხელს უწყობს 65 ცილას და ღამით მონელების 54 ცილას. ასეთი ნიუანსური განსხვავებები ხაზს უსვამს ულტრაბგერითი გამოკვლევის უნიკალურ პოტენციალს კონკრეტული აპლიკაციებისთვის.

ეტიკეტების გარეშე ცილის რაოდენობრივი განსაზღვრის შედეგები შვიდი სპიკირებული პროტეინის E. coli-ში
ნიმუში. შემდეგი ცილები დაემატა ორ განსხვავებულ დონეზე, როგორც აღნიშნულია სვეტში
სახელწოდებით "თეო რატიო". Theo Ratio არის თეორიული თანაფარდობა ორ დონეს შორის, რომელიც გამოიყენება ამაში
ექსპერიმენტი. მსხვილფეხა რქოსანი შრატის ალბუმინი (ALBU), β-ლაქტოგლობულინი (LACB), α-S1 კაზეინი (CASA1),
α-S2 კაზეინი (CASA2), ციტოქრომი c (CYC), ოვალბუმინი (OVAL) და კარბოანჰიდრაზა 2
(CAH2). კოეფიციენტები გამოითვლებოდა MaxQuant-დან მიღებული LFQ ცილის ინტენსივობის გამოყენებით
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
შესწავლა და გრაფიკა: © Martins et al., 2019)

ნანონაწილაკებით იმობილიზებული ტრიფსინი

იმობილიზებული ტრიპსინის ნანონაწილაკების (მაგ., T-FMNPs) ინტეგრაცია ულტრაბგერითი გამოკვლევით კიდევ უფრო აძლიერებს პროტეომიკის სამუშაო პროცესებს. ეს ნანონაწილაკები უზრუნველყოფს ფერმენტ-სუბსტრატის ურთიერთქმედების მაღალ ზედაპირს, ზრდის ეფექტურობას. კომპლექსურ პროტეომებზე გამოყენებისას, როგორიცაა E. coli, კომბინირებული მეთოდი აღწევს:

• სიჩქარე: დაასრულეთ საჭმლის მონელება 5 წუთში.
• სიზუსტე: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• მასშტაბურობა: მრავალ ჭაბურღილის პლატფორმებზე ადაპტაცია, როგორიცაა UIP400MTP, იძლევა მაღალი გამტარუნარიანობის დამუშავებას.

დააწკაპუნეთ აქ დეტალური პროტოკოლისთვის ნაბიჯ-ნაბიჯ ინსტრუქციებით!
(შდრ. Martins et al., 2019)

პროტეოლიზური მონელება მაღალი სიჩქარით და მაღალი გამტარიანობით Hielscher-ის სონაქტორებით

საუკეთესო Sonicator მოდელები Proteomics-ისთვის

Hielscher Ultrasonics გვთავაზობს სონიკატორის სხვადასხვა მოდელებს ერთდროულად მრავალ ნიმუშის მოსამზადებლად, რაც ხელს უწყობს მაღალი გამტარუნარიანობის სამუშაო პროცესებს. თუ თქვენ მუშაობთ ფლაკონებთან, საცდელ მილებთან, მრავალ ჭაბურღილიან ფირფიტებთან (მაგ. 6-, 24-, 96-ჭარის ფირფიტებით) თუ პეტრის ჭურჭელთან – ჩვენ გთავაზობთ იდეალურ სონიკატორებს თქვენი ექსპერიმენტებისთვის.

UIP400MTP მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტის სონიკატორი

საბოლოო გამტარუნარიანობისთვის, UIP400MTP უზრუნველყოფს 96 ჭაბურღილის ფირფიტების ულტრაბგერითი დამუშავების შესაძლებლობას. თავსებადია ნებისმიერ სტანდარტულ მიკროფირფიტთან, UIP400MTP არ საჭიროებს ძვირადღირებულ საკუთრებაში არსებულ ერთჯერად ნივთებს და გაძლევთ თავისუფლებას, აირჩიოთ საუკეთესო მრავალჭის ფირფიტა თქვენი კვლევისთვის. თეფშზე ერთიანი ენერგიის მიწოდებით, ის იძლევა 200-მდე რთული პროტეომის სწრაფ შემცირებას, ალკილაციას და მონელებას მხოლოდ 1 საათში. ავტომატიზაციისა და ეფექტურობის ეს დონე გადამწყვეტია მაღალი გამტარუნარიანობის პროტეომიკისა და კლინიკური აპლიკაციებისთვის. შეიტყვეთ მეტი მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტის სონიკატორის შესახებ!

VialTweeter

VialTweeter მორგებულია ლაბორატორიებისთვის, რომლებიც საჭიროებენ 10-მდე ფლაკონის ან საცდელი მილის ერთდროულ გაჟღერებას. მისი არაინვაზიური მიდგომა აღმოფხვრის ჯვარედინი დაბინძურების რისკებს და უზრუნველყოფს ცილების რეპროდუცირებად მონელებას. ეს მოწყობილობა იდეალურია მკვლევარებისთვის, რომლებიც მუშაობენ ნიმუშის შეზღუდული მოცულობით ან სხვადასხვა ტიპის ნიმუშით.
შეიტყვეთ მეტი VialTweeter მრავალ ტუბიანი სონიკატორის შესახებ!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn sonicator არის ძლიერი მოწყობილობა, რომელიც შექმნილია მრავალი ნიმუშის ერთდროული დამუშავებისთვის დალუქულ კონტეინერებში. ის უზრუნველყოფს ულტრაბგერითი ენერგიის ერთგვაროვან განაწილებას და ტემპერატურის ზუსტ კონტროლს. ხუთამდე ნიმუშის ერთდროულად დამუშავების შესაძლებლობა, შემცირებულ, ალკილირებულ და მონელებულ სამუშაო ნაკადებთან მის თავსებადობასთან ერთად, CupHorn-ს აქცევს საიმედო ინსტრუმენტად MS-ზე დაფუძნებული პროტეომიკისთვის.
შეიტყვეთ მეტი CupHorn SonoReactor-ის შესახებ!

ნაბიჯ-ნაბიჯ პროტოკოლი ულტრაბგერითი დახმარებით პროტეოლიზური მონელებისთვის ნანონაწილაკებით იმობილიზებული ტრიფსინის გამოყენებით

ეს პროტოკოლი მარტინსისა და სხვ. (2019) ოპტიმიზებულია ცილების სწრაფი მონელებისთვის ულტრაბგერითი ენერგიისა და ნანონაწილაკებით იმობილიზებული ტრიპსინის (T-FMNPs) გამოყენებით. აღწერილი ნაბიჯები უზრუნველყოფს ეფექტურ შემცირებას, ალკილირებას და პროტეოლიზს, რომელიც შესაფერისია მასის სპექტრომეტრიის (MS) გამოყენებისთვის.
პროტოკოლის ნაბიჯები

1. დისულფიდური ბმების შემცირება
   • დაამატეთ 2 μL DTT ხსნარი (110 მმ) 20 μL ცილის ნიმუშს (0.5 მგ/მლ) AmBic ბუფერში.
   • მოათავსეთ ნიმუშის მილი სონორეაქტორში UP200St-CupHorn.
   • ნიმუშის გაჟონვა 2,5 წუთის განმავლობაში 50% ამპლიტუდაზე (200 W, 26 kHz).
   • გააჩერეთ ხანმოკლე ინტერვალით, რათა გაცივდეს, შემდეგ ჩაატარეთ სონიკი კიდევ 2,5 წუთის განმავლობაში იმავე პირობებში.
2. შემცირებული ცისტეინის ნარჩენების ალკილაცია
   • შემცირებული ცილის ნიმუშს დაამატეთ 2 μL IAA ხსნარი (400 მმ).
   • გაჟღენთეთ 2,5 წუთის განმავლობაში 50% ამპლიტუდაზე, ალკილაციის გასაადვილებლად.
   • გააჩერეთ გაგრილებისთვის, შემდეგ ჩაატარეთ სონიკი დამატებით 2,5 წუთის განმავლობაში.

   შენიშვნა: შეამცირეთ ალკილირებული ნიმუშის სინათლის ზემოქმედება, რათა თავიდან აიცილოთ IAA დეგრადაცია.

3. ნიმუშის განზავება
   • განზავდეს ალკილირებული ცილის ნიმუში საბოლოო მოცულობამდე 100 μL 25 მმ AmBic ბუფერის გამოყენებით, რომელიც შეიცავს 4% აცეტონიტრილს (ვ/ვ).
   • საფუძვლიანად აურიეთ ნაზი პიპეტინგით.
4. პროტეოლიზური მონელება ნანონაწილაკებით იმობილიზებული ტრიფსინით
   • გაზავებულ ცილის ნიმუშს დაამატეთ 20 μL T-FMNP ხსნარი (3 მგ/მლ).
   • ნაზავი გაჟღენთეთ სონორეაქტორში 2,5 წუთის განმავლობაში 50% ამპლიტუდაზე.
   • გააჩერეთ გაგრილებისთვის, შემდეგ ჩაატარეთ სონიკა კიდევ 2,5 წუთის განმავლობაში იმავე პირობებში.
5. ტრიფსინის ნანონაწილაკების გამოყოფა
   • გამოიყენეთ მაგნიტი T-FMNP-ების გამოსაყოფად მონელებული პეპტიდების შემცველი ზენატანისგან.
   • გადაიტანეთ სუპერნატანტი ახალ მიკროცენტრიფუგა მილში.
6. პეპტიდური მომზადება MS ანალიზისთვის
   • პეპტიდების შემცველი სუპერნატანი გააშრეთ ვაკუუმ ცენტრიფუგაში.
   • შეინახეთ გამხმარი პეპტიდები -20°C-ზე მასის სპექტრომეტრიის შემდგომ ანალიზამდე.