პროტეომული სამუშაო პროცესები ცილების მაღალი წარმადობის ჰიდროლიზით

პროტეომიკა ბიოლოგიური პროცესებისა და სისტემების გასაგებად აუცილებელი დარგია, სადაც ცილოვანი ჰიდროლიზი მისი პროცესების კრიტიკულ ეტაპს წარმოადგენს. ტრადიციულად, ცილოვანი ჰიდროლიზი ხორციელდება ხსნარში პროტეოლიზური ფერმენტების, როგორიცაა ტრიფსინის, გამოყენებით, რომელიც სპეციფიკურად ჰიდროლიზებს პეპტიდურ ბმებს ლიზინისა და არგინინის ნაშთებში. ეს პროცესი წარმოქმნის პეპტიდებს, რომლებიც კარგად არის შესაფერისი იონიზაციისა და ფრაგმენტაციისთვის მას-სპექტრომეტრიის (MS) გამოყენებებში. თუმცა, ტრადიციული ჰიდროლიზის მეთოდები დასრულებისთვის საჭიროებენ 12–24 საათს, რაც პროტეომულ პროცესებში მნიშვნელოვან „ბოთლის ყელს“ ქმნის.
ულტრაბგერითი დამუშავება წარმოადგენს მძლავრ ალტერნატივას, რომელიც მკვეთრად ამცირებს ჰიდროლიზის დროს საათებიდან სულ რამდენიმე წუთამდე. მოწინავე მრავალნიმუშიან სონიკატორებთან, როგორიცაა Hielscher CupHorn, VialTweeter და 96-ფოსოიანი პლანშეტის სონიკატორი UIP400MTP, კომბინაციაში ულტრაბგერითი დამუშავება უზრუნველყოფს დაჩქარებულ, მაღალი წარმადობის პროტეომიკას. ეს ტექნოლოგიები ამარტივებს სამუშაო პროცესებს, ამცირებს ნიმუშის მომზადების დროს და ზრდის ეფექტურობას გამეორებადობის ან მონაცემთა ხარისხის გაუარესების გარეშე.

ულტრაბგერითი ენერგიის როლი ცილოვან ჰიდროლიზში

ულტრაბგერითი დამუშავება იყენებს ფოკუსირებულ ულტრაბგერით ტალღებს კავიტაციის შესაქმნელად – ამ დროს წარმოიქმნება ლოკალიზებული მიკრობუშტები, რომელთა კოლაფსი ძლიერ ძვრის ძალებს წარმოქმნის. ეს ფენომენი აძლიერებს მასის გადატანას, ხელს უწყობს ფერმენტების შერევას სუბსტრატებთან და შლის ცილების სივრცულ სტრუქტურას, რის შედეგადაც გახლეჩის უბნები ხელმისაწვდომი ხდება პროტეოლიზური ფერმენტებისთვის, როგორიცაა ტრიფსინი.
შედეგი? ჰიდროლიზის დროის მნიშვნელოვანი შემცირება ეფექტურობის ან გამეორებადობის დაკარგვის გარეშე.

ულტრაბგერით გაძლიერებული პროტეოლიზური ჰიდროლიზი: მეთოდოლოგია და შედეგები

დაჩქარებული ჰიდროლიზის პროტოკოლი

ულტრაბგერითი დამუშავებით ხელშეწყობილი ჰიდროლიზი აერთიანებს პროტეოლიზურ ფერმენტებსა და ულტრაბგერით ენერგიას სამუშაო პროცესების დასაჩქარებლად. მაგალითად, Hielscher UP200St-CupHorn-ის (200 W, 26 kHz) გამოყენებით ჰიდროლიზის პროცესი შემდეგნაირად მიმდინარეობს:

1. რედუქცია: ცილოვანი ნიმუშები (0,5 mg/mL, 20 µL) მუშავდება DTT-ით (2 µL, 110 mM) ამონიუმის ბიკარბონატის ბუფერში (12,5 mM). ულტრაბგერითი დამუშავება გამოიყენება 50% ამპლიტუდაზე 5 წუთის განმავლობაში.
2. ალკილირება: IAA-ს (2 µL, 400 mM) დამატების შემდეგ, ულტრაბგერითი დამუშავება მეორდება იმავე პირობებში.
3. ჰიდროლიზი: ნიმუშები განზავდება და ინკუბირდება იმობილიზებულ ტრიფსინის ნანონაწილაკებთან. ულტრაბგერითი დამუშავების საბოლოო რაუნდი (5 წუთი) ასრულებს ჰიდროლიზს. პეპტიდები გამოიყოფა, შრება და ინახება MS ანალიზისთვის.

ეს ულტრაბგერითი მეთოდი ამცირებს მომზადების საერთო დროს 12 საათიდან 30 წუთზე ნაკლებ დრომდე. დაჩქარებული პროცესის მიუხედავად, პეპტიდების გამოსავლიანობა და ხარისხი ტრადიციული, მთელი ღამის განმავლობაში მიმდინარე მეთოდებით მიღებული შედეგების შესაბამისი რჩება.

ულტრაბგერითი ცილოვანი ჰიდროლიზის ეფექტურობა

შედარებით კვლევებში E. coli პროტეომების გამოყენებით:

• ცილოვანი იდენტიფიკაცია: ულტრაბგერით ჰიდროლიზებულ ნიმუშებში 5 წუთში 777 ცილა გამოვლინდა, მაშინ როცა 12-საათიანი ჰიდროლიზით 817 ცილა გამოვლინდა. ორივე მეთოდით იდენტიფიცირებული საერთო ცილების წილი 70%-ს აღემატებოდა.
• გამეორებადობა: განმეორებითმა ანალიზებმა თითოეული მეთოდის ფარგლებში 98%-ზე მაღალი კორელაციის მნიშვნელობები აჩვენა, რაც სანდოობას ადასტურებს.
• სელექციურობა: ზოგიერთი ცილა პრიორიტეტულად ჰიდროლიზდებოდა თითოეული მეთოდით, ულტრაბგერითი ჰიდროლიზი ანიჭებდა უპირატესობას 65 ცილას, ხოლო ღამის ჰიდროლიზი – 54 ცილას. ასეთი ნიუანსური განსხვავებები ხაზს უსვამს ულტრაბგერითი დამუშავების უნიკალურ პოტენციალს კონკრეტული გამოყენებებისთვის.

მარკირების გარეშე ცილების რაოდენობრივი განსაზღვრის შედეგები შვიდი ცილისთვის, რომლებიც დაემატა E. coli
ნიმუშში. შემდეგი ცილები დაემატა ორ სხვადასხვა დონეზე, როგორც მითითებულია
კოლონაში “Theo Ratio”. Theo Ratio არის თეორიული შეფარდება ამ ექსპერიმენტში გამოყენებულ ორ დონეს შორის.
ძროხის შრატის ალბუმინი (ALBU), β-ლაქტოგლობულინი (LACB), α-S1 კაზეინი (CASA1),
α-S2 კაზეინი (CASA2), ციტოქრომი c (CYC), ოვალბუმინი (OVAL) და კარბოანჰიდრაზა 2
(CAH2). შეფარდებები გამოითვლებოდა LFQ ცილოვანი ინტენსივობების გამოყენებით, რომლებიც მიღებული იყო MaxQuant
ანალიზიდან. სტუდენტის t-ტესტი გამოიყენებოდა თითოეული მეთოდით მიღებული მნიშვნელობების შესადარებლად (p>0,01, n=3, t-თეორიული=4,6).
კვლევა და გრაფიკა: © Martins et al., 2019)

ნანონაწილაკებზე იმობილიზებული ტრიფსინი

იმობილიზებული ტრიფსინის ნანონაწილაკების (მაგ., T-FMNPs) ინტეგრაცია ულტრაბგერით დამუშავებასთან კიდევ უფრო აუმჯობესებს პროტეომიკის სამუშაო ნაკადებს. ეს ნანონაწილაკები უზრუნველყოფენ მაღალ ზედაპირულ ფართობს ფერმენტ-სუბსტრატის ურთიერთქმედებისთვის, რაც ზრდის ეფექტურობას. როდესაც გამოიყენება რთულ პროტეომებზე, როგორიცაა E. coli, კომბინირებული მეთოდი აღწევს:

• სისწრაფე: სრული დამუშავება 5 წუთის განმავლობაში.
• სიზუსტე: ცილების რაოდენობრივი ანალიზი ტრადიციულ მეთოდებთან შედარებით თანაბარია (p > 0,01, n=3).
• მასშტაბურობა: მრავალფოსოიან პლატფორმებზე, როგორიცაა UIP400MTP, ადაპტაცია მაღალი წარმადობის დამუშავების საშუალებას იძლევა.

დააწკაპუნეთ აქ ნაბიჯ-ნაბიჯ ინსტრუქციების მქონე დეტალური პროტოკოლისთვის!
(იხ. Martins et al., 2019)

პროტეოლიზური დამუშავება მაღალი სისწრაფით და მაღალი გამტარუნარიანობით Hielscher-ის ულტრაბგერითი დამუშავების სისტემებით

საუკეთესო ულტრაბგერითი დამუშავების მოდელები პროტეომიკისთვის

Hielscher Ultrasonics გთავაზობთ სონიკატორების სხვადასხვა მოდელს მრავალი ნიმუშის ერთდროული მომზადებისთვის, რაც ხელს უწყობს მაღალი წარმადობის სამუშაო პროცესებს. მიუხედავად იმისა, მუშაობთ ფლაკონებთან, სინჯარებთან, მრავალფოსოიან პლანშეტებთან (მაგ. 6-, 24-, 96-ფოსოიანი პლანშეტები) თუ პეტრის ფინჯნებთან – ჩვენ გთავაზობთ იდეალურ სონიკატორებს თქვენი ექსპერიმენტებისთვის.

UIP400MTP მრავალფოსოიანი პლანშეტის ულტრაბგერითი დამუშავების სისტემა

მაქსიმალური წარმადობის მისაღწევად UIP400MTP უზრუნველყოფს 96-ფოსოიანი პლანშეტების ულტრაბგერით დამუშავებას. UIP400MTP თავსებადია ნებისმიერ სტანდარტულ მიკროპლანშეტთან, არ მოითხოვს ძვირადღირებულ, მხოლოდ კონკრეტული მწარმოებლის ერთჯერად სახარჯ მასალებს და გაძლევთ თავისუფლებას, აირჩიოთ საუკეთესო მრავალფოსოიანი პლანშეტი თქვენი კვლევისთვის. პლანშეტზე ენერგიის თანაბარი განაწილებით ის შესაძლებელს ხდის მაქსიმუმ 200 რთული პროტეომის სწრაფ აღდგენას, ალკილირებასა და ჰიდროლიზს სულ რაღაც 1 საათში. ავტომატიზაციისა და ეფექტურობის ეს დონე გადამწყვეტია მაღალი წარმადობის პროტეომიკისა და კლინიკური გამოყენებებისთვის. გაიგეთ მეტი მრავალფოსოიანი პლანშეტის ულტრაბგერითი დამუშავების სისტემის შესახებ!

VialTweeter

VialTweeter შექმნილია ლაბორატორიებისთვის, რომლებსაც სჭირდებათ მაქსიმუმ 10 ფლაკონის ან სინჯარის ერთდროული ულტრაბგერითი დამუშავება. მისი არაინვაზიური მიდგომა აღმოფხვრის ჯვარედინი კონტამინაციის რისკებს და ამავდროულად უზრუნველყოფს ცილების ჰიდროლიზის გამეორებადობას. ეს მოწყობილობა იდეალურია მკვლევრებისთვის, რომლებიც მუშაობენ მცირე მოცულობის ან სხვადასხვა ტიპის ნიმუშებთან.
გაიგეთ მეტი VialTweeter მრავალსინჯარიანი ულტრაბგერითი დამუშავების სისტემის შესახებ!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn ულტრაბგერითი დამუშავების სისტემა არის მძლავრი მოწყობილობა, რომელიც შექმნილია მრავალი ნიმუშის ერთდროული დამუშავებისთვის დახურულ ჭურჭელში. ის უზრუნველყოფს ულტრაბგერითი ენერგიის ერთგვაროვან განაწილებას და ზუსტ ტემპერატურულ კონტროლს. მაქსიმუმ ხუთი ნიმუშის ერთდროული დამუშავების შესაძლებლობა და აღდგენის, ალკილირებისა და ჰიდროლიზის ეტაპების შემცველ სამუშაო პროცესებთან თავსებადობა CupHorn-ს აქცევს საიმედო ინსტრუმენტად MS-ზე დაფუძნებული პროტეომიკისთვის.
გაიგეთ მეტი CupHorn SonoReactor-ის შესახებ!

ნაბიჯ-ნაბიჯ პროტოკოლი ულტრაბგერითი დამუშავებით ხელშეწყობილი პროტეოლიზური ჰიდროლიზისთვის ნანონაწილაკებზე იმობილიზებული ტრიფსინის გამოყენებით

Martins et al. (2019)-ის ეს პროტოკოლი ოპტიმიზებულია ცილების სწრაფი ჰიდროლიზისთვის ულტრაბგერითი ენერგიისა და ნანონაწილაკებზე იმობილიზებული ტრიფსინის (T-FMNPs) გამოყენებით. აღწერილი ნაბიჯები უზრუნველყოფს ეფექტურ აღდგენას, ალკილირებასა და პროტეოლიზს მას-სპექტრომეტრიული (MS) ანალიზისთვის.
პროტოკოლის ნაბიჯები

1. დისულფიდური ბმების აღდგენა
   • დაამატეთ 2 µL DTT ხსნარი (110 mM) 20 µL ცილოვან ნიმუშს (0,5 mg/mL) AmBic ბუფერში.
   • მოათავსეთ ნიმუშის სინჯარა სონორეაქტორ UP200St-CupHorn-ში.
   • ულტრაბგერითი დამუშავება მოახდინეთ ნიმუშზე 2,5 წუთის განმავლობაში 50% ამპლიტუდაზე (200 W, 26 kHz).
   • შეაჩერეთ მოკლე ინტერვალით გასაგრილებლად, შემდეგ კიდევ 2,5 წუთის განმავლობაში მოახდინეთ ულტრაბგერითი დამუშავება იმავე პირობებში.
2. აღდგენილი ცისტეინის ნაშთების ალკილირება
   • დაამატეთ 2 µL IAA ხსნარი (400 mM) აღდგენილ ცილოვან ნიმუშს.
   • მოახდინეთ ულტრაბგერითი დამუშავება 2,5 წუთის განმავლობაში 50% ამპლიტუდაზე ალკილირების ხელშეწყობისთვის.
   • შეაჩერეთ გასაგრილებლად, შემდეგ კიდევ 2,5 წუთის განმავლობაში მოახდინეთ ულტრაბგერითი დამუშავება.

   შენიშვნა: მინიმუმამდე შეამცირეთ ალკილირებულ ნიმუშზე სინათლის ზემოქმედება IAA-ს დეგრადაციის თავიდან ასაცილებლად.

3. ნიმუშის განზავება
   • განზავეთ ალკილირებული ცილოვანი ნიმუში საბოლოო მოცულობამდე 100 µL 25 mM AmBic ბუფერის გამოყენებით, რომელიც შეიცავს 4% აცეტონიტრილს (v/v).
   • კარგად აურიეთ ნაზი პიპეტირებით.
4. პროტეოლიზური ჰიდროლიზი ნანონაწილაკებზე იმობილიზებული ტრიფსინით
   • დაამატეთ 20 µL T-FMNP ხსნარი (3 mg/mL) განზავებულ ცილოვან ნიმუშს.
   • ულტრაბგერითი დამუშავება ჩატარდეს სონორეაქტორში 2,5 წუთის განმავლობაში 50% ამპლიტუდაზე.
   • შეწყვიტეთ გაცივებისთვის, შემდეგ კი კიდევ 2,5 წუთის განმავლობაში ჩაატარეთ ულტრაბგერითი დამუშავება იმავე პირობებში.
5. ტრიფსინის ნანონაწილაკების გამოყოფა
   • გამოიყენეთ მაგნიტი T-FMNPs-ის გამოსაყოფად ჰიდროლიზებული პეპტიდების შემცველი სუპერნატანტიდან.
   • გადაიტანეთ სუპერნატანტი ახალ მიკროცენტრიფუგის სინჯარაში.
6. პეპტიდების მომზადება MS ანალიზისთვის
   • გააშრეთ პეპტიდების შემცველი სუპერნატანტი ვაკუუმურ ცენტრიფუგაში.
   • შეინახეთ გამშრალი პეპტიდები -20°C-ზე მას-სპექტრომეტრიით შემდგომი ანალიზისთვის.