ულტრაბგერითი ფილტრით დახმარებული ნიმუშის მომზადება (FASP): პროტეომიკის სამუშაო პროცესების გაუმჯობესება გაუმჯობესებული სონიკაციით
ულტრაბგერითი ფილტრით დამხმარე ნიმუშის მომზადება (FASP) თანამედროვე პროტეომიკაში მაღალეფექტური და რეპროდუცირებადი მეთოდის სახით ვითარდება. კონტროლირებადი სონიკაციის დამკვიდრებულ FASP სამუშაო პროცესებში ინტეგრირებით, მკვლევარებს შეუძლიათ მნიშვნელოვნად გააუმჯობესონ ცილის ექსტრაქცია, მონელების ეფექტურობა და მონაცემთა საერთო ხარისხი. მაღალი გამტარუნარიანობისა და რეპროდუცირებადი ნიმუშის მომზადების მზარდი მოთხოვნის გათვალისწინებით, ფოკუსირებული სონიკატორები, როგორიცაა მიკროფირფიტების სონიკატორი UIP400MTP, სამეცნიერო და პრაქტიკულ მნიშვნელობას იძენს.
სამეცნიერო კონტექსტი: რატომ არის FASP მნიშვნელოვანი პროტეომიკაში
ფილტრით დამხმარე ნიმუშის მომზადება (FASP) ოქროს სტანდარტად იქცა ქვემოდან ზემოთ მიმართული პროტეომიკის მეთოდში, რადგან მას შეუძლია მოაშოროს სარეცხი საშუალებები, მარილები და სხვა დამაბინძურებლები და ამავდროულად უზრუნველყოს ეფექტური ფერმენტული მონელება. თუმცა, კლასიკური FASP პროტოკოლები ხშირად აწყდებიან შეზღუდვებს, რომლებიც დაკავშირებულია არასრულ ლიზისთან, არათანმიმდევრულ მონელებასთან და ნიმუშის ცვალებადობასთან. – განსაკუთრებით მაშინ, როდესაც საქმე გვაქვს რთულ ან მდგრად ბიოლოგიურ უჯრედებთან ან ქსოვილებთან.
სწორედ აქ არის ფოკუსირებული ულტრაბგერითი ენერგია (სონიკაცია) გადამწყვეტი უპირატესობა. მექანიკური ძვრის ძალებისა და კავიტაციის შემოღებით, სონიკაცია აძლიერებს FASP სამუშაო პროცესში მრავალ კრიტიკულ ეტაპს ცილის მთლიანობის დარღვევის გარეშე.
მრავალ ჭაბურღილის სონიკატორი UIP400MTP ხელს უწყობს ფილტრით დახმარებული ნიმუშის მომზადებას (FASP)
ულტრაბგერითი FASP-ში სონიკაციის დადებითი ეფექტები
სონიკაცია წარმოგვიდგენს კონტროლირებად აკუსტიკურ კავიტაციას – მიკროსკოპული ბუშტების ფორმირება და კოლაფსი – რაც წარმოქმნის ლოკალიზებულ ძვრის ძალებს და მიკრონაკადებს.
ულტრაბგერითი FASP-ში ულტრაბგერითი ალკილირებისა და მონელების საფეხურების გაძლიერება მასის გადაცემის გაუმჯობესებით და რეაქციის კინეტიკის დაჩქარებით. ულტრაბგერითი ენერგიის გამოყენება წარმოქმნის კავიტაციას, რაც იწვევს ლოკალიზებულ მიკრონაკადებს და გარდამავალ ძვრის ძალებს, რაც ხელს უწყობს რეაგენტების სწრაფ შერევას და ეფექტურ შეღწევას ცილის მატრიცაში ან ფილტრის გარემოში. ალკილირების დროს, ეს იწვევს ცისტეინის ნარჩენების უფრო ერთგვაროვან და სწრაფ მოდიფიკაციას იოდოაცეტამიდით. მონელების საფეხურზე, ულტრაბგერითი დამუშავება ზრდის პროტეოლიზური დაშლის ადგილების ხელმისაწვდომობას და აუმჯობესებს ფერმენტ-სუბსტრატის ურთიერთქმედებას, რითაც აჩქარებს ტრიფსინის აქტივობას და ზრდის მონელების ეფექტურობას. საერთო ჯამში, ულტრაბგერითი დამუშავება ამცირებს დამუშავების დროს, ამავდროულად ინარჩუნებს ან აუმჯობესებს რეაქციის სისრულეს და რეპროდუცირებადობას.
პროტეომიკის ნიმუშის მომზადებისას, ულტრაბგერითი FASP ითარგმნება როგორც:
- უჯრედების უფრო ეფექტური დაშლა და ცილის ექსტრაქცია, თუნდაც მყარ ქსოვილებში ან მიკრობულ ნიმუშებში
- ცილების გაძლიერებული ხსნადობა
- გაუმჯობესებული ფერმენტების ხელმისაწვდომობა მონელების დროს
- შემცირებული დამუშავების დრო და გაზრდილი რეპროდუცირებადობა
ჩვეულებრივი მექანიკური ან ქიმიური ლიზისის მეთოდებისგან განსხვავებით, ულტრაბგერითი დამუშავება მაღალკონტროლირებადი და მასშტაბირებადია, რაც მას განსაკუთრებით შესაფერისს ხდის სტანდარტიზებული პროტეომიკის სამუშაო პროცესებისთვის.
UIP400MTP არ არის ულტრაბგერითი აბაზანა. ეს არის მაღალი ინტენსივობის ჭიქის რქა ფოკუსირებული სონიკაციისთვის. ეს მძლავრი უკონტაქტო ბგერითი აწვდის ერთგვაროვან ჟღერადობას თქვენი სტანდარტული ჭაბურღილის ყველა ჭაში. თქვენ გაქვთ ზუსტი კონტროლი ამპლიტუდაზე, ძალასა და პულსირებაზე. ჩაშენებული ტაიმერი და ტემპერატურის ზონდი უზრუნველყოფს თანმიმდევრულ შედეგებს. UIP400MTP ფირფიტის სონიკატორი ნიმუშებს წყლის აბაზანით აცივლებს (გარე ჩილერი სურვილისამებრ).
ულტრაბგერითი FASP-ის უპირატესობები ტრადიციულ მიდგომებთან შედარებით
FASP პროტოკოლებში sonication-ის ინტეგრაცია უზრუნველყოფს გაზომვად სარგებელს, რაც პირდაპირ გავლენას ახდენს მას-სპექტრომეტრიის შედეგებზე.
ულტრაბგერითი FASP უზრუნველყოფს ცილის უფრო სრულ აღდგენას, განსაკუთრებით ისეთი რთული ნიმუშებიდან, როგორიცაა ბოჭკოვანი ქსოვილები ან ბიოფილმები. ენერგიის ერთგვაროვანი განაწილება უზრუნველყოფს თანმიმდევრულ დამუშავებას რეპლიკაციებს შორის, რაც ამცირებს ცვალებადობას. – რაოდენობრივი პროტეომიკის აუცილებელი მოთხოვნა.
გარდა ამისა, ულტრაბგერითი დამუშავება აჩქარებს მონელების კინეტიკას ფერმენტ-სუბსტრატის ურთიერთქმედების გაუმჯობესებით. ეს ხშირად იწვევს მონელების დროის შემცირებას და პეპტიდების უფრო მაღალ მოსავლიანობას, თანმიმდევრობის დაფარვის შენარჩუნებისას.
სამუშაო პროცესის პერსპექტივიდან, ულტრაბგერითი სისტემები ამცირებენ ხელით ჩარევას და გამორიცხავენ აგრესიული ქიმიური დამუშავების საჭიროებას, ინარჩუნებენ ნიმუშის მთლიანობას და ამარტივებს პროტოკოლის სტანდარტიზაციას.
ვენის დიაგრამა, რომელიც აჩვენებს ულტრაბგერითი FASP-ით იდენტიფიცირებული ცილების რაოდენობის ზრდას ღამის FASP-თან შედარებით.
სურათი და კვლევა: ©კარვალიო და სხვ., 2020
მრავალჭაბურღილიანი ფირფიტის სონიკატორი UIP400MTP ფილტრით დამუშავებული ნიმუშის მომზადებისთვის (FASP)
პროტოკოლი: მაღალი გამტარუნარიანობის ულტრაბგერითი FASP UIP400MTP-ით
დიდი ნიმუშის კოჰორტების დამუშავების ლაბორატორიებისთვის, UIP400MTP მიკროპლატე სონიკატორი საშუალებას იძლევა სტანდარტული მრავალჭაბურღილის ფირფიტების (მაგ., 96-ჭაბურღილის ფირფიტების) ერთდროული სონიკაცია, რაც მნიშვნელოვნად ზრდის გამტარუნარიანობას და რეპროდუცირებადობას.
ამ ფორმატში, ნიმუშები (როგორც წესი, 50–200 µლ თითო ჭაში) მზადდება პირდაპირ მიკროფირფიტებში, რომლებიც თავსებადია ულტრაფილტრაციასთან ან შემდგომი დამუშავებასთან. ლიზისის ბუფერები მსგავსია სტანდარტულ FASP პროტოკოლებში გამოყენებულისა.
UIP400MTP ყველა ჭაში ერთგვაროვან ულტრაბგერით ენერგიას იყენებს. ულტრაბგერითი გამოსხივება, როგორც წესი, 60–80%-იანი ამპლიტუდით 2–4 წუთის განმავლობაში ხორციელდება, ნიმუშის ტიპის მიხედვით. ტემპერატურის მონიტორინგი შესაძლებელია შესაერთებელი ტემპერატურის სენსორის გამოყენებით. პულსირებული ულტრაბგერითი გამოსხივების გამოყენება და სურვილისამებრ ლაბორატორიული გამაგრილებელი მოწყობილობის გამოყენება.
სამაგალითო პროტოკოლი:
- ალკილირების საფეხურისთვის, ნიმუშები ულტრაიისფერი დამუშავებით კონტროლდება მიკროპლატების ულტრაიისფერი დამუშავების აპარატის (UIP400MTP) გამოყენებით 40%-იანი ამპლიტუდით 7 ციკლის განმავლობაში (30 წმ ჩართული, 15 წმ გამორთული; ულტრაიისფერი დამუშავების საერთო დრო: 5 წთ 45 წმ).
- ულტრაბგერითი დამუშავების შემდეგ, იოდოაცეტამიდის (IAA) ხსნარი ცენტრიფუგირებით შორდება. ტრიპსინის დაშლამდე, ნიმუშები უნდა გაირეცხოს ნარჩენი შარდოვანას მოსაშორებლად, რომელიც ძლიერი ქაოტროპული აგენტია და თრგუნავს ფერმენტულ აქტივობას. ამიტომ, ნიმუშები ორჯერ ირეცხება 200 μL 25 mM ამონიუმის ბიკარბონატით (AmBic).
- შემდგომში, ემატება 12.5 მმ ამონიუმის ბიკარბონატში მომზადებული ტრიფსინის ხსნარის 100 μL (ფერმენტისა და ცილის თანაფარდობა 1:30). ცილის მონელება შემდეგ ხორციელდება UIP400MTP-ის გამოყენებით იმავე ულტრაბგერითი დამუშავების პირობებში (40% ამპლიტუდა, 7 ციკლი, 30 წმ ჩართვა / 15 წმ გამორთვა; საერთო დრო: 5 წთ 45 წმ).
- ულტრაბგერითი დამუშავების შემდეგ, ნიმუშები გადადის ფილტრის ფირფიტებზე ან მუშავდება ფირფიტებზე დაფუძნებული FASP სისტემების გამოყენებით. აღდგენისა და ალკილირების ეტაპები ხორციელდება ფირფიტაში, რაც უზრუნველყოფს სამუშაო პროცესის გამარტივებას.
- ტრიფსინის მონელება ხორციელდება კონტროლირებად პირობებში (მაგ., 37°C, 4–16 საათი), ფერმენტული აქტივობის დასაჩქარებლად და პეპტიდების მოსავლიანობის გასაუმჯობესებლად ხანმოკლე ულტრაბგერითი სტიმულაციის შესაძლებლობით.
- პეპტიდები აღდგება ცენტრიფუგირებით და მზად არის LC-MS/MS ანალიზისთვის.
ამ სისტემის მთავარი უპირატესობა მდგომარეობს მის შესაძლებლობაში, უზრუნველყოს იდენტური დამუშავების პირობები ყველა ჭაბურღილში, მინიმუმამდე დაიყვანოს პარტიული ეფექტები და შესაძლებელს გახდის საიმედო რაოდენობრივი შედარებების ჩატარებას ფართომასშტაბიან პროტეომიკურ კვლევებში.
VialTweeter-ის მრავალმილაკიანი სონიკატორი აჩქარებს და აუმჯობესებს ფილტრით დახმარებული ნიმუშის მომზადებას (FASP) პროტეომიკაში
სამეცნიერო შესაბამისობა
FASP სამუშაო პროცესებში sonication-ის ინტეგრაცია მხოლოდ ტექნიკური დახვეწა არ არის. – ეს წარმოადგენს პროტეომიკის ნიმუშების მომზადების მეთოდოლოგიურ წინსვლას. რადგან სფერო უფრო მაღალი გამტარუნარიანობის, ავტომატიზაციისა და რეპროდუცირებისკენ მიიწევს, ულტრაბგერითი ტექნოლოგიები ნიმუშების დამუშავების ფუნდამენტურ შეფერხებებს აგვარებს.
ბოლოდროინდელი კვლევები სულ უფრო მეტად უსვამს ხაზს ნიმუშის თანმიმდევრული მომზადების მნიშვნელობას ბიომარკერების საიმედო აღმოჩენისა და რაოდენობრივი პროტეომიკისთვის. ულტრაბგერითი FASP პირდაპირ უწყობს ხელს ამ მიზნის მიღწევას ექსტრაქციის ეფექტურობის, მონელების თანმიმდევრულობისა და სამუშაო პროცესის საერთო სიმტკიცის გაუმჯობესებით.
გარდა ამისა, ულტრაბგერითი სისტემების მასშტაბირება – ინდივიდუალური ფლაკონებიდან VialTweeter-ით სრულ მიკროფირფიტებამდე UIP400MTP-ით – შეესაბამება როგორც კვლევითი, ასევე დიდი კოჰორტული პროტეომიკის კვლევების მზარდ მოთხოვნას.
შეიძინეთ სონიკატორი თქვენი FASP სამუშაო პროცესის გასაადვილებლად!
ულტრაბგერითი ფილტრით დახმარებული ნიმუშის მომზადება აერთიანებს FASP-ის დადასტურებულ ძლიერ მხარეებს ულტრაბგერითი დამუშავების ფიზიკურ უპირატესობებთან. ლიზისის გაძლიერებით, მონელების გაუმჯობესებით და სამუშაო პროცესების სტანდარტიზაციით, ულტრაბგერითი სისტემები თანამედროვე პროტეომიკის ძლიერ გადაწყვეტას გვთავაზობს.
მრავალმილის სონიკატორი VialTweeter და მიკროპლატე სონიკატორი UIP400MTP მაგალითს იძლევა, თუ როგორ შეუძლია ფოკუსირებულ ულტრაბგერით ენერგიას გარდაქმნას რუტინული ნიმუშის მომზადება უფრო ეფექტურ, რეპროდუცირებად და სამეცნიეროდ მყარ პროცესად. – საბოლოო ჯამში, რაც უფრო მაღალი ხარისხის პროტეომიკურ მონაცემებსა და უფრო ღრმა ბიოლოგიურ ხედვამდე მიგვიყვანს.
აირჩიეთ ყველაზე შესაფერისი სონიკატორი თქვენი ფილტრის დახმარებით ნიმუშის მოსამზადებლად
| სონიკატორის მოდელი | FASP-ის უპირატესობები | საუკეთესო გამოყენება |
| UIP400MTP მიკროპლატის სონიკატორი | ერთგვაროვანი ულტრაბგერითი გამოსხივება მთელ მიკროფირფიტებზე; ენერგიის მაღალი რეპროდუცირებადობა; ალკილირებისა და ფერმენტული მონელების სიჩქარის აჩქარება მაღალი გამტარუნარიანობის სამუშაო პროცესებში; თავსებადია ავტომატური ნიმუშების მომზადებასთან. | მაღალი გამტარუნარიანობის FASP სამუშაო პროცესები 96-ჭაბურღილის ან მსგავსი ფირფიტის ფორმატებში, მათ შორის პროტეომიკის სკრინინგის აპლიკაციებში. |
| VialTweeter Multi-Tube Sonicator | რამდენიმე დახურული მილის ერთდროული, ერთგვაროვანი ულტრაბგერითი დამუშავება; მინიმუმამდე ამცირებს ჯვარედინი დაბინძურებას და ნიმუშის დაკარგვას; აძლიერებს რეაგენტების შეღწევადობას და შერევას, აუმჯობესებს ალკილირებას და მონელების ეფექტურობას. | მრავალი FASP ნიმუშის პარალელური დამუშავება საშუალო გამტარუნარიანობით და მაღალი რეპროდუცირებადობით. |
| ჭიქის რქა (არაპირდაპირი სონიკაცია “მაღალი ინტენსივობის აბაზანა” დალუქული მილებისთვის) | მაღალი ინტენსივობის არაპირდაპირი ულტრაბგერითი დამუშავება დალუქული ჭურჭლებისთვის; შესანიშნავი ტემპერატურის კონტროლი და დაბინძურებისგან თავისუფალი დამუშავება; ხელს უწყობს მასის ეფექტურ გადაცემას ზონდთან პირდაპირი კონტაქტის გარეშე. | ნიმუშის დამუშავება სხვადასხვა ნიმუშის კონტეინერებში / მგრძნობიარე ან სახიფათო ნიმუშებში, რაც მოითხოვს დახურულ კონტეინერებს და ენერგიის თანმიმდევრულ განაწილებას. |
| ლაბორატორიული ზონდის ტიპის სონიკატორები (პირდაპირი სონიკაცია) | მაქსიმალური ულტრაბგერითი ინტენსივობა და ენერგიის გადაცემა; სწრაფი დარღვევა და რეაქციის აჩქარება; ეფექტურია ძნელად მოსანელებელი ან მაღალკომპლექსური ცილის ნიმუშებისთვის. | ერთი ნიმუშის დამუშავება, უფრო დიდი ნიმუშები ან რთული მატრიცები, სადაც საჭიროა მაქსიმალური სიმძლავრე და სიჩქარე. |
დიზაინი, წარმოება და კონსულტაცია – ხარისხი დამზადებულია გერმანიაში
Hielscher ულტრაბგერითები ცნობილია მათი უმაღლესი ხარისხისა და დიზაინის სტანდარტებით. გამძლეობა და მარტივი მუშაობა საშუალებას იძლევა ჩვენი ულტრაბგერითი აპარატების გლუვი ინტეგრაცია სამრეწველო ობიექტებში. უხეში პირობები და მომთხოვნი გარემო ადვილად უმკლავდება Hielscher ულტრაბგერითებს.
Hielscher Ultrasonics არის ISO სერთიფიცირებული კომპანია და განსაკუთრებული აქცენტი კეთდება მაღალი ხარისხის ულტრაბგერაზე, რომელიც აღჭურვილია უახლესი ტექნოლოგიით და მომხმარებლის კეთილგანწყობით. რა თქმა უნდა, Hielscher ულტრაბგერითები შეესაბამება CE და აკმაყოფილებს UL, CSA და RoHs მოთხოვნებს.
ხშირად დასმული შეკითხვები
რისთვის გამოიყენება ფილტრით დახმარებული ნიმუშის მომზადება?
ფილტრით დამხმარე ნიმუშის მომზადება (FASP) გამოიყენება მას-სპექტრომეტრიაზე დაფუძნებული პროტეომიკური ანალიზისთვის ცილის ნიმუშების მოსამზადებლად. ის საშუალებას იძლევა ეფექტურად მოშორდეს სარეცხი საშუალებები, მარილები და სხვა დაბალი მოლეკულური წონის დამაბინძურებლები, ამავდროულად ცილები შენარჩუნდება მოლეკულური წონის გამყოფ ფილტრზე, სადაც მათი დენატურაცია, აღდგენა, ალკილირება და ფერმენტულად დაშლა LC–MS/MS ანალიზისთვის შესაფერის პეპტიდებად.
რა არის FASP-ის უპირატესობები პროტეომიკაში?
პროტეომიკაში FASP-ის მთავარი უპირატესობაა მისი უნარი, დაამუშაოს რთული და სარეცხი საშუალებებით მდიდარი ნიმუშები, ამავდროულად წარმოქმნას მას-სპექტრომეტრიასთან თავსებადი მაღალსისუფთავის პეპტიდური ნარევები. ის აუმჯობესებს მონელების ეფექტურობას და რეპროდუცირებადობას რეაქციების შეზღუდულ ფილტრის გარემოში შესრულებით, ამცირებს ნიმუშის დანაკარგს ნალექზე დაფუძნებულ მეთოდებთან შედარებით და უზრუნველყოფს ბუფერული გაცვლის ეფექტურ საშუალებას. საერთო ჯამში, FASP აუმჯობესებს პეპტიდების აღდგენას, მონაცემთა ხარისხს და პროტეომის დაფარვას, რაც მას მძლავრ და ფართოდ გავრცელებულ სამუშაო პროცესად აქცევს ქვემოდან ზემოთ პროტეომიკაში.
ლიტერატურა / ლიტერატურა
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
- Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
- Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).
უკონტაქტო სონიკატორი UIP400MTP ხელს უწყობს FASP-ს 96-ჭაბურღილის ფირფიტებში
Hielscher Ultrasonics აწარმოებს მაღალი ხარისხის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორებისგან ლაბორატორია რომ სამრეწველო ზომა.