ულტრაბგერითი ფილტრის დახმარებით ნიმუშის მომზადება (FASP): პროტეომიკის სამუშაო პროცესების გაუმჯობესება გაფართოებული სონიკაციით

ულტრაბგერითი დამუშავებითა და ფილტრის დახმარებით ნიმუშის მომზადება (FASP) თანამედროვე პროტეომიკაში მაღალეფექტურ და რეპროდუცირებად მეთოდად ყალიბდება. კონტროლირებადი სონიკაციის დამკვიდრებულ FASP სამუშაო პროცესებში ინტეგრირებით, მკვლევარებს შეუძლიათ მნიშვნელოვნად გააუმჯობესონ ცილის ექსტრაქცია, მონელების ეფექტურობა და მონაცემთა საერთო ხარისხი. მაღალი გამტარუნარიანობისა და რეპროდუცირებადი ნიმუშის მომზადების მზარდი მოთხოვნის გათვალისწინებით, ფოკუსირებული სონიკატორები, როგორიცაა მიკროფირფიტების სონიკატორი UIP400MTP, სამეცნიერო და პრაქტიკულ მნიშვნელობას იძენს.

სამეცნიერო კონტექსტი: რატომ არის FASP მნიშვნელოვანი პროტეომიკაში

ფილტრის დახმარებით ნიმუშის მომზადება (FASP) ოქროს სტანდარტად იქცა ქვემოდან ზემოთ მიმართული პროტეომიკის მეთოდში, რადგან მას შეუძლია მოაშოროს დეტერგენტები, მარილები და სხვა დამაბინძურებლები და ამავდროულად უზრუნველყოს ეფექტური ფერმენტული მონელება. თუმცა, კლასიკური FASP პროტოკოლები ხშირად აწყდებიან შეზღუდვებს, რომლებიც დაკავშირებულია არასრულ ლიზისთან, მონელების არაერთგვაროვნებასთან და ნიმუშების ცვალებადობასთან – განსაკუთრებით მაშინ, როდესაც საქმე გვაქვს რთულ ან მდგრად ბიოლოგიურ უჯრედებთან ან ქსოვილებთან.
სწორედ აქ იძლევა ფოკუსირებული ულტრაბგერითი ენერგია (სონიკაცია) გადამწყვეტ უპირატესობას. მექანიკური ძვრის ძალებისა და კავიტაციის წარმოქმნით, სონიკაცია აუმჯობესებს FASP სამუშაო პროცესის მრავალ კრიტიკულ ეტაპს ცილის მთლიანობის დარღვევის გარეშე.

ულტრაბგერით FASP-ში სონიკაციის დადებითი ეფექტები

სონიკაცია წარმოქმნის კონტროლირებად აკუსტიკურ კავიტაციას – მიკროსკოპული ბუშტების წარმოქმნასა და კოლაფსს – რაც წარმოქმნის ლოკალიზებულ ძვრის ძალებსა და მიკრონაკადებს.
სონიკაცია ულტრაბგერით FASP-ში აუმჯობესებს როგორც ალკილირების, ისე მონელების ეტაპებს მასის გადატანის გაუმჯობესებითა და რეაქციის კინეტიკის დაჩქარებით. ულტრაბგერითი ენერგიის გამოყენება წარმოქმნის კავიტაციას, რაც იწვევს ლოკალიზებულ მიკრონაკადებსა და ხანმოკლე ძვრის ძალებს, რომლებიც ხელს უწყობს სწრაფ შერევასა და რეაგენტების ეფექტურ შეღწევას ცილის მატრიცაში ან ფილტრის გარემოში. ალკილირების დროს ეს იწვევს ცისტეინის ნაშთების უფრო ერთგვაროვან და სწრაფ მოდიფიკაციას იოდოაცეტამიდით. მონელების ეტაპზე ულტრაბგერითი დამუშავება ზრდის პროტეოლიზური დაშლის უბნების ხელმისაწვდომობას და აუმჯობესებს ფერმენტსა და სუბსტრატს შორის ურთიერთქმედებას, რითაც აჩქარებს ტრიფსინის მოქმედებას და ზრდის მონელების ეფექტურობას. საერთო ჯამში, ულტრაბგერითი დამუშავება ამცირებს დამუშავების დროს, ამავდროულად ინარჩუნებს ან აუმჯობესებს რეაქციის სისრულესა და რეპროდუცირებადობას.

პროტეომიკისთვის ნიმუშების მომზადებისას ულტრაბგერითი FASP უზრუნველყოფს:

• უჯრედების უფრო ეფექტური დაშლა და ცილის ექსტრაქცია, თუნდაც მყარ ქსოვილებში ან მიკრობულ ნიმუშებში
• ცილების გაუმჯობესებული ხსნად მდგომარეობაში გადაყვანა
• მონელების დროს ფერმენტებისთვის სუბსტრატის ხელმისაწვდომობის გაუმჯობესება
• შემცირებული დამუშავების დრო და გაზრდილი რეპროდუცირებადობა

ჩვეულებრივი მექანიკური ან ქიმიური ლიზისის მეთოდებისგან განსხვავებით, ულტრაბგერითი დამუშავება მაღალკონტროლირებადი და მასშტაბირებადია, რაც მას განსაკუთრებით შესაფერისს ხდის სტანდარტიზებული პროტეომიკის სამუშაო პროცესებისთვის.

ულტრაბგერითი FASP-ის უპირატესობები ტრადიციულ მიდგომებთან შედარებით

FASP პროტოკოლებში სონიკაციის ინტეგრაცია უზრუნველყოფს გაზომვად სარგებელს, რაც პირდაპირ გავლენას ახდენს შემდგომი მას-სპექტრომეტრიული ანალიზის შედეგებზე.
ულტრაბგერითი FASP უზრუნველყოფს ცილის უფრო სრულ გამოყოფას, განსაკუთრებით ისეთი რთული ნიმუშებიდან, როგორიცაა ბოჭკოვანი ქსოვილები ან ბიოფილმები. ენერგიის ერთგვაროვანი განაწილება უზრუნველყოფს განმეორებითი ნიმუშების ერთგვაროვან დამუშავებას, რაც ამცირებს ცვალებადობას – ეს რაოდენობრივი პროტეომიკის აუცილებელი მოთხოვნაა.
გარდა ამისა, ულტრაბგერითი დამუშავება აჩქარებს მონელების კინეტიკას ფერმენტსა და სუბსტრატს შორის ურთიერთქმედების გაუმჯობესებით. ეს ხშირად იწვევს მონელების დროის შემცირებას და პეპტიდების გამოსავლიანობის ზრდას, ამინომჟავური მიმდევრობის დაფარვის შენარჩუნებით.
სამუშაო პროცესის თვალსაზრისით, ულტრაბგერითი სისტემები ამცირებს ხელით ჩარევას და გამორიცხავს აგრესიული ქიმიური დამუშავების საჭიროებას, ინარჩუნებს ნიმუშის მთლიანობას და ამარტივებს პროტოკოლის სტანდარტიზაციას.

ვენის დიაგრამა, რომელიც აჩვენებს ულტრაბგერითი FASP-ით იდენტიფიცირებული ცილების რაოდენობის ზრდას მთელი ღამის განმავლობაში მიმდინარე FASP-თან შედარებით.
სურათი და კვლევა: ©კარვალიო და სხვ., 2020

პროტოკოლი: მაღალი გამტარუნარიანობის ულტრაბგერითი FASP UIP400MTP-ით

ლაბორატორიებისთვის, რომლებიც ნიმუშების დიდ ჯგუფებს ამუშავებენ, მიკროფირფიტების სონიკატორი UIP400MTP უზრუნველყოფს სტანდარტული მრავალფოსოიანი ფირფიტების (მაგ., 96-ფოსოიანი ფირფიტების) ერთდროულ სონიკაციას, რაც მნიშვნელოვნად ზრდის გამტარუნარიანობასა და რეპროდუცირებადობას.
ამ ფორმატში ნიმუშები (როგორც წესი, 50–200 µL თითო ფოსოში) მზადდება პირდაპირ მიკროფირფიტებში, რომლებიც თავსებადია ულტრაფილტრაციასთან ან შემდგომ დამუშავებასთან. ლიზისის ბუფერები მსგავსია სტანდარტულ FASP პროტოკოლებში გამოყენებული ბუფერებისა.

UIP400MTP ყველა ფოსოს ერთგვაროვან ულტრაბგერით ენერგიას აწვდის. ულტრაბგერითი დამუშავება, როგორც წესი, 60–80%-იანი ამპლიტუდით 2–4 წუთის განმავლობაში ხორციელდება, ნიმუშის ტიპის მიხედვით. აკონტროლეთ ტემპერატურა შესაერთებელი ტემპერატურის სენსორის გამოყენებით. გამოიყენეთ იმპულსური სონიკაცია და, სურვილისამებრ, ლაბორატორიული გამაგრილებელი მოწყობილობა.

სამაგალითო პროტოკოლი:

1. ალკილირების ეტაპზე ნიმუშები მუშავდება ულტრაბგერით მიკროფირფიტების სონიკატორის (UIP400MTP) გამოყენებით 40%-იანი ამპლიტუდით 7 ციკლის განმავლობაში (30 წმ ჩართული, 15 წმ გამორთული; ულტრაბგერითი დამუშავების საერთო დრო: 5 წთ 45 წმ).
2. ულტრაბგერითი დამუშავების შემდეგ იოდოაცეტამიდის (IAA) ხსნარი ცენტრიფუგირებით შორდება. ტრიფსინით მონელებამდე ნიმუშები უნდა გაირეცხოს ნარჩენი შარდოვანას მოსაშორებლად, რომელიც ძლიერი ქაოტროპული აგენტია და თრგუნავს ფერმენტულ აქტივობას. ამიტომ ნიმუშები ორჯერ ირეცხება 200 μL 25 mM ამონიუმის ბიკარბონატით (AmBic).
3. შემდგომ ემატება 12.5 mM ამონიუმის ბიკარბონატში მომზადებული ტრიფსინის ხსნარის 100 μL (ფერმენტისა და ცილის თანაფარდობა 1:30). ცილის მონელება შემდეგ ხორციელდება UIP400MTP-ის გამოყენებით იმავე ულტრაბგერითი დამუშავების პირობებში (40% ამპლიტუდა, 7 ციკლი, 30 წმ ჩართვა / 15 წმ გამორთვა; საერთო დრო: 5 წთ 45 წმ).
4. ულტრაბგერითი დამუშავების შემდეგ, ნიმუშები გადადის ფილტრის ფირფიტებზე ან მუშავდება ფირფიტებზე დაფუძნებული FASP სისტემების გამოყენებით. აღდგენისა და ალკილირების ეტაპები ხორციელდება ფირფიტაში, რაც უზრუნველყოფს სამუშაო პროცესის გამარტივებას.
5. ტრიფსინით მონელება ხორციელდება კონტროლირებად პირობებში (მაგ., 37°C, 4–16 საათი), ფერმენტული აქტივობის დასაჩქარებლად და პეპტიდების გამოსავლიანობის გასაუმჯობესებლად ხანმოკლე ულტრაბგერითი სტიმულაციის შესაძლებლობით.
6. პეპტიდები გამოიყოფა ცენტრიფუგირებით და მზად არის LC-MS/MS ანალიზისთვის.

ამ სისტემის მთავარი უპირატესობა მდგომარეობს მის შესაძლებლობაში, უზრუნველყოს დამუშავების იდენტური პირობები ყველა ფოსოში, მინიმუმამდე დაიყვანოს პარტიებს შორის განსხვავებებით გამოწვეული ეფექტები და შესაძლებელი გახადოს საიმედო რაოდენობრივი შედარებების ჩატარება ფართომასშტაბიან პროტეომიკურ კვლევებში.

დიზაინი, წარმოება და კონსულტაცია – ხარისხი დამზადებულია გერმანიაში

Hielscher ულტრაბგერითები ცნობილია მათი უმაღლესი ხარისხისა და დიზაინის სტანდარტებით. გამძლეობა და მარტივი მუშაობა საშუალებას იძლევა ჩვენი ულტრაბგერითი აპარატების გლუვი ინტეგრაცია სამრეწველო ობიექტებში. უხეში პირობები და მომთხოვნი გარემო ადვილად უმკლავდება Hielscher ულტრაბგერითებს.

Hielscher Ultrasonics არის ISO სერთიფიცირებული კომპანია და განსაკუთრებული აქცენტი კეთდება მაღალი ხარისხის ულტრაბგერაზე, რომელიც აღჭურვილია უახლესი ტექნოლოგიით და მომხმარებლის კეთილგანწყობით. რა თქმა უნდა, Hielscher ულტრაბგერითები შეესაბამება CE და აკმაყოფილებს UL, CSA და RoHs მოთხოვნებს.

ლიტერატურა / წყაროები

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).