Tecnologia ad ultrasuoni Hielscher

Lisi dell'ecografia: Interruzione delle cellule & estrazione

La disintegrazione o lisi cellulare è una parte comune della preparazione quotidiana dei campioni nei laboratori biotecnologici. L'obiettivo della lisi è quello di distruggere parti della parete cellulare o l'intera cellula per rilasciare molecole biologiche. Il cosiddetto lisato può consistere, ad esempio, in plasmidi, analisi dei recettori, proteine, DNA, RNA ecc. Le fasi successive della lisi sono il frazionamento, l'isolamento degli organelli e/o l'estrazione e la purificazione delle proteine. Il materiale estratto (= lisato) deve essere separato ed è soggetto ad ulteriori indagini o applicazioni, ad esempio per la ricerca proteomica. Gli omogeneizzatori ad ultrasuoni sono uno strumento comune per la lisi cellulare di successo. Poiché l'intensità ultrasonica può essere livellata regolando i parametri di processo, l'intensità ottimale di sonicazione da molto morbida a molto dura può essere impostata individualmente per ogni sostanza e mezzo per soddisfare i requisiti specifici dell'applicazione.

Struttura delle celle

Le cellule sono protette da una membrana plasmatica semipermeabile che consiste in un doppio strato fosfo-lipidico (anch'esso doppio strato proteico-lipidico; formato da lipidi idrofobi e molecole di fosforo idrofilo con molecole proteiche incorporate) e crea una barriera tra l'interno delle cellule (citoplasma) e l'ambiente extracellulare. Le cellule vegetali e le cellule procariotiche sono circondate da una parete cellulare. A causa degli strati multipli di cellulosa, le cellule vegetali sono più difficili da lisare rispetto alle cellule animali. L'interno delle cellule, come organelli, nucleo, mitocondrio, è stabilizzato dal citoscheletro.
Attraverso la lisi delle cellule, ha lo scopo di estrarre e separare gli organelli, le proteine, il DNA, l'mRNA o altre biomolecole.

L'sonicazione è comunemente usata per la preparazione del campione di materiale cellulare.

Fig. 1: Estrazione ultrasonica dalle cellule: la sezione trasversale microscopica (TS) dello stelo apicale della menta (Mentha piperita) mostra il meccanismo delle azioni durante l'estrazione ultrasonica dalle cellule (ingrandimento 2000x) [risorsa: Vilkhu et al. 2011].

Metodi

Esistono diversi metodi per lisare le cellule, che possono essere suddivisi in metodi meccanici e chimici, che includono l'uso di detergenti o solventi, l'applicazione di alta pressione, o l'uso di un mulino a sfere o di una pressa francese. Lo svantaggio più problematico di questi metodi è il difficile controllo e l'adeguamento dei parametri di processo e quindi l'impatto.
I principali svantaggi dei metodi di lisi comuni:

Diverse tecniche di lisi

Tavolo: I metodi convenzionali di lisi cellulare presentano notevoli svantaggi

Al contrario, la sonicazione è uno strumento molto efficiente e affidabile per la disintegrazione delle cellule che permette un controllo completo dei parametri di sonicazione. Ciò garantisce un'elevata selettività sul rilascio dei materiali e sulla purezza del prodotto. [Balasundaram et al. 2009] È adatto a tutti i tipi di cellule e facilmente applicabile su piccola e grande scala. Gli ultrasuoni sono facili da pulire. Un omogeneizzatore ad ultrasuoni è sempre dotato di funzione clean-in-place (CIP) e sterilizzazione sul posto (SIP). Il sonotrodo è costituito da un massiccio corno di titanio che può essere pulito o lavato in acqua o in solvente (a seconda del mezzo di lavoro). La manutenzione degli ultrasuoni è dovuta alla loro robustezza quasi trascurabile.

lisi

La lisi è un processo sensibile. Durante la lisi viene distrutta la protezione della membrana cellulare, ma è necessario impedire l'inattivazione, la denaturazione e la degradazione delle proteine estratte da parte di un ambiente non fisiologico (deviazione dal valore pH). Pertanto, in generale, la lisi viene effettuata in una soluzione tampone. La maggior parte delle difficoltà derivano da una perturbazione incontrollata delle cellule, con conseguente rilascio non mirato di tutto il materiale intracellulare e/o la denaturazione del prodotto bersaglio.

La lisi cellulare ad ultrasuoni può essere utilizzata per la preparazione dei campioni in laboratorio e per la produzione di grandi volumi. Clicca per ingrandire!

Fig. 1: potente omogeneizzatore ad ultrasuoni da 200 watt UP200Ht con controllo digitale e registrazione automatica dei dati per una lisi cellulare affidabile e riproducibile.

Lisi ad ultrasuoni

Generalmente, la lisi dei campioni in laboratorio richiede tra i 15 secondi e i 2 minuti. Poiché l'intensità della sonicazione è molto facile da regolare impostando l'ampiezza del tempo di sonicazione e scegliendo l'attrezzatura giusta, è possibile interrompere le membrane cellulari molto delicatamente o molto bruscamente, a seconda della struttura cellulare e dello scopo della lisi (ad esempio, l'estrazione del DNA richiede una sonicazione più morbida, l'estrazione completa delle proteine dei batteri richiede un trattamento ecografico più intenso). La temperatura durante il processo può essere monitorata da un sensore di temperatura integrato e può essere facilmente controllata mediante raffreddamento (bagno di ghiaccio o celle a flusso con camicie di raffreddamento) o mediante sonicazione in modalità pulsata. Durante la sonicazione a impulsi, brevi cicli di scoppio di sonicazione della durata di 1-15 secondi consentono la dissipazione del calore e il raffreddamento durante i periodi intermittenti più lunghi.
Tutti i processi a ultrasuoni sono completamente riproducibili e linearmente scalabili.

Omogeneizzatore ad ultrasuoni VialTweeter per la preparazione simultanea di un massimo di 10 provette. (Clicca per ingrandire!)

Il dispositivo a ultrasuoni VialTweeter consente la preparazione simultanea del campione fino a 10 cuvette nelle stesse condizioni di processo.

Omogeneizzatori ad ultrasuoni

Vari tipi di Dispositivi a ultrasuoni consentono di raggiungere l'obiettivo di preparazione del campione e di assicurare facilità d'uso e comfort operativo. Gli ultrasuoni a sonda sono i dispositivi più comuni in laboratorio. Sono più adatti per la preparazione di campioni di piccole e medie dimensioni con volumi da 0.1mL fino a 1000mL. Diverse potenze e sonotrodi permettono di adattare l'ultrasuoni al volume del campione e al contenitore per ottenere risultati sonori più efficaci ed efficienti. La sonda ad ultrasuoni è la scelta migliore quando si devono preparare campioni singoli.

Se è necessario preparare più campioni, ad esempio 8 fiale di soluzione cellulare, dispositivi come il VialTweeter o un cuphorn ad ultrasuoni sono l'omogeneizzatore più adatto per la lisi. Diverse fiale sono sonicate contemporaneamente, con la stessa intensità. Questo non solo fa risparmiare tempo, ma assicura anche lo stesso trattamento di tutti i campioni, rendendo i risultati tra i campioni affidabili e comparabili. Inoltre, viene evitata la contaminazione incrociata attraverso l'immersione del sonotrodo ad ultrasuoni (noto anche come sonda ad ultrasuoni, corno, punta o dito). Poiché vengono utilizzate fiale, si omettono le lunghe operazioni di pulizia e la perdita di campione dovuta alla decantazione dei recipienti.
Per volumi superiori, ad esempio per la produzione commerciale di estratti cellulari, sono più adatti i sistemi a ultrasuoni continui con reattore a celle a flusso. Il flusso continuo e uniforme del materiale lavorato assicura una sonicazione uniforme. Tutti i parametri del processo di disintegrazione ultrasonica possono essere ottimizzati e adattati ai requisiti dell'applicazione e al materiale specifico della cella.

Procedura esemplare per la lisi ad ultrasuoni delle cellule batteriche:

  • Preparazione della sospensione cellulare: I pellet cellulari devono essere completamente sospesi in una soluzione tampone per omogeneizzazione (scegliere una soluzione tampone compatibile con le analisi successive, ad es. metodo cromatografico specifico). Aggiungere lisozimi e/o altri additivi, se necessario (devono essere compatibili anche con i mezzi di separazione/pulificazione). Miscelare/omogeneizzare delicatamente la soluzione sotto leggera sonicazione fino ad ottenere una sospensione completa.
  • Lisi ad ultrasuoni: Mettere il campione in un bagno di ghiaccio. Per le interruzioni cellulari, sonicare la sospensione a raffiche di 60-90 secondi (utilizzando la modalità a impulsi dell'ultrasuoni).
  • Separazione: Centrifugare il lisato (es. 10 min. a 10.000 x g; a 4°C). Separare accuratamente il surnatante dal pellet di cellule. Il surnatante è il lisato cellulare totale. Dopo la filtrazione del surnatante, si ottiene un fluido chiarificato della proteina cellulare solubile.

Le applicazioni più comuni per gli ultrasuoni in biologia e biotecnologia sono:

  • Preparazione dell'estratto cellulare
  • Perturbazione di lievito, batteri, cellule vegetali, cellule vegetali, morbide & tessuto cellulare duro, materiale nucleico
  • Estrazione di proteine
  • Preparazione e isolamento degli enzimi
  • Produzione di antigeni
  • Estrazione del DNA e/o frammentazione mirata
  • Preparazione dei liposomi
Omogeneizzatori a ultrasuoni ad alta potenza come l'UIP1000hd sono utilizzati per la rottura delle cellule e l'estrazione in modalità batch o a flusso continuo, anche se in modalità a flusso continuo. (Clicca per ingrandire!)

Sistemi da banco ad ultrasuoni come il UIP1000hd (1kW) può trattare grandi volumi di materiale biologico.

Le molteplici applicazioni degli ultrasuoni si ramifica nei settori della biotecnologia, bioingegneria, microbiologia, biologia molecolare, biochimica, biochimica, immunologia, batteriologia, virologia, proteomica, genetica, fisiologia, biologia cellulare, ematologia e botanica.

Per la valutazione e l'ottimizzazione delle applicazioni dei clienti, Hielscher Ultrasonics offre una gamma completa di prodotti per la valutazione e l'ottimizzazione delle applicazioni dei clienti. laboratorio di processo ad ultrasuoni. Contattateci per ulteriori informazioni!

Letteratura/riferimenti

  • Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Progressi nelle strategie di rilascio dei prodotti e impatto sulla progettazione dei bioprocessi. Tendenze della biotecnologia 27/8, 2009. pp. 477-485.
  • Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkkumar, M. (2011): Recupero ad ultrasuoni e modifica degli ingredienti alimentari. Dentro: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Tecnologie ad ultrasuoni per l'alimentazione e la biotrasformazione. New York: Springer, 2011. pp. pp. 345-368.

Contattateci per richiedere maggiori informazioni!

Non esitate a contattarci per parlare di vostro bisogno di progetto. Raccomanderemo i parametri di impostazione ed elaborazione più adatti per il vostro progetto.





Si prega di notare il nostro informativa sulla privacy.