La sonicazione per la lisi: Disgregazione ed estrazione delle cellule

La disintegrazione o lisi cellulare è una parte comune della preparazione quotidiana dei campioni nei laboratori biotecnologici. L'obiettivo della lisi è quello di disgregare parti della parete cellulare o l'intera cellula per rilasciare molecole biologiche. Gli omogeneizzatori a ultrasuoni sono ampiamente utilizzati per la lisi cellulare. Il vantaggio principale degli ultrasonici sofisticati è il controllo preciso dei parametri di processo, come l'intensità e la temperatura, che consente una disgregazione e un'estrazione delle cellule delicata ma altamente efficiente.

Lisi cellulare con gli ultrasuoni

La lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni è un metodo utilizzato per rompere le cellule ed estrarne il contenuto utilizzando onde sonore ad alta frequenza, cioè gli ultrasuoni. La sonicazione è una tecnica di lisi ampiamente utilizzata come metodo consolidato e affidabile di rottura delle cellule e di estrazione del materiale intracellulare. La lisi ultrasonica è una tecnica affidabile per preparare lisati contenenti, ad esempio, plasmidi, saggi recettoriali, proteine, DNA, RNA ecc. Poiché l'intensità degli ultrasuoni può essere livellata regolando i parametri del processo, è possibile impostare l'intensità di sonicazione ottimale, da molto blanda a intensa, per ogni sostanza e mezzo di coltura, in modo da soddisfare i requisiti specifici dell'applicazione. Le fasi successive alla lisi sono il frazionamento, l'isolamento degli organelli e/o l'estrazione e la purificazione delle proteine. Il materiale estratto (= lisato) deve essere separato ed è soggetto a ulteriori indagini o applicazioni, ad esempio per la ricerca proteomica.

Rispetto ad altri metodi di lisi ed estrazione cellulare, la lisi cellulare a ultrasuoni presenta diversi vantaggi:

1. Velocità: La lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni è un metodo rapido che può aprire le cellule in pochi secondi. È molto più veloce di altri metodi come l'omogeneizzazione, il congelamento o la macinazione delle perle.
2. Efficienza: La lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni possono essere utilizzate per trattare campioni piccoli, grandi o multipli in una sola volta, rendendole più efficienti rispetto ad altri metodi che richiedono il trattamento individuale di piccoli campioni.
3. Senza sostanze chimiche: La lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni è un metodo non invasivo che non richiede l'uso di sostanze chimiche o enzimi aggressivi. Ciò lo rende ideale per le applicazioni in cui è necessario mantenere l'integrità del contenuto cellulare. È possibile evitare la contaminazione indesiderata dei campioni.
4. Alto rendimento: La lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni possono estrarre un'elevata quantità di contenuti cellulari, tra cui DNA, RNA e proteine. Questo perché le onde sonore ad alta frequenza rompono le pareti cellulari e rilasciano il contenuto nella soluzione circostante.
5. Controllo della temperatura: I sofisticati ultrasuoni consentono un controllo preciso della temperatura del campione. Gli ultrasuoni digitali Hielscher sono dotati di un sensore di temperatura collegabile e di un software di monitoraggio della temperatura.
6. Riproducibile: I protocolli per la lisi cellulare a ultrasuoni possono essere facilmente riprodotti e persino adattati a volumi di campione più o meno grandi con un semplice scale-up lineare.
7. Versatile: La lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni possono essere utilizzate per estrarre un'ampia gamma di tipi di cellule, tra cui batteri, lieviti, funghi, cellule vegetali e di mammiferi. Può anche essere utilizzata per estrarre diversi tipi di molecole, tra cui proteine, DNA, RNA e lipidi.
8. Preparazione simultanea di numerosi campioni: Hielscher Ultrasonics offre diverse soluzioni per trattare comodamente numerosi campioni nelle stesse condizioni di processo. In questo modo, la fase di preparazione dei campioni, la lisi e l'estrazione, diventa estremamente efficiente e consente di risparmiare tempo.
9. Facile da usare: L'apparecchiatura per la lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni è facile da usare e richiede una formazione minima. L'apparecchiatura è anche economica, in quanto si tratta di un unico investimento che non richiede il riacquisto di prodotti da smaltire. Ciò la rende interessante per un'ampia gamma di ricercatori e laboratori.

Nel complesso, la lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni è un metodo veloce, efficiente, controllabile con precisione e versatile per estrarre il contenuto cellulare. I suoi vantaggi rispetto ai metodi alternativi lo rendono una scelta interessante per un'ampia gamma di applicazioni industriali e di ricerca.

Principio di funzionamento della lisi cellulare a ultrasuoni

La lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni utilizza onde sonore ad alta frequenza per disgregare le cellule ed estrarne il contenuto. Le onde sonore creano cambiamenti di pressione nel liquido circostante, causando la formazione e il collasso di piccole bolle in un processo noto come cavitazione. Queste bolle generano forze meccaniche localizzate e molto intense che possono rompere le cellule e rilasciare il loro contenuto nella soluzione circostante.

La lisi cellulare con l'ausilio di un ultrasuonatore prevede comunemente le seguenti fasi:

• Il campione viene posto in una provetta o in un contenitore con un tampone liquido.
• Una sonda a ultrasuoni viene inserita nel campione e vengono applicate onde sonore ad alta frequenza di circa 20-30 kHz.
• Le onde ultrasonore provocano oscillazioni e cavitazione nel liquido circostante, generando forze localizzate che rompono le cellule e ne rilasciano il contenuto.
• Il campione viene centrifugato o filtrato per rimuovere eventuali detriti cellulari e il contenuto estratto viene raccolto per l'analisi a valle.

Le potenti onde ultrasonore rompono la matrice cellulare delle strutture biologiche e rilasciano i composti bioattivi. Il trasferimento di massa tra il materiale vegetale e il solvente (ad esempio, il tampone) viene intensificato. (grafica: ©Vilkhu et al., 2006)

Svantaggi dei metodi di lisi più comuni

Durante il vostro lavoro in laboratorio, potreste aver già sperimentato la seccatura della lisi cellulare con i tradizionali protocolli di lisi meccanica o chimica.

• Lisi meccanica: I metodi di lisi meccanica, come la macinazione con mortaio e pestello o l'omogeneizzazione con una pressa francese, un mulino a perline o un sistema rotore-statore, spesso non hanno opzioni di controllo e regolazione precise. Ciò significa che l'uso di macinazione e triturazione può generare rapidamente calore e forze di taglio che possono danneggiare il campione e denaturare le proteine. Inoltre, possono richiedere molto tempo e grandi quantità di materiale di partenza.
• Lisi chimica: I metodi di lisi chimica, come la lisi basata su detergenti, possono danneggiare il campione interrompendo il bilayer lipidico e denaturando le proteine. Inoltre, possono richiedere più passaggi e lasciare contaminanti residui che interferiscono con le applicazioni a valle. Trovare il dosaggio ottimale di detergente è un'ulteriore sfida.
• Cicli di congelamento e scongelamento: I cicli di congelamento e scongelamento possono causare la rottura delle membrane cellulari, ma cicli ripetuti possono anche causare la denaturazione e la degradazione delle proteine. Questo metodo può anche richiedere più cicli, il che può richiedere molto tempo e spesso comporta rese inferiori.
• Lisi enzimatica: I metodi di lisi enzimatica possono essere specifici per alcuni tipi di cellule e richiedono più passaggi, con conseguente dispendio di tempo. Inoltre, generano rifiuti e richiedono un'attenta ottimizzazione per evitare la degradazione del campione. I kit di lisi enzimatica sono spesso costosi. Se l'attuale procedura di lisi enzimatica non dà risultati sufficienti, è possibile applicare la sonicazione come metodo sinergico per intensificare la disgregazione cellulare.

A differenza dei metodi convenzionali di lisi cellulare meccanica e chimica, la sonicazione è uno strumento molto efficiente e affidabile per la disintegrazione cellulare che consente un controllo completo dei parametri di sonicazione. Ciò garantisce un'elevata selettività sul rilascio dei materiali e sulla purezza del prodotto. [cfr. Balasundaram et al., 2009].
È adatto a tutti i tipi di cellule e facilmente applicabile su piccola e grande scala. – sempre in condizioni controllate. Gli omogeneizzatori a ultrasuoni sono facili da pulire. Un omogeneizzatore a ultrasuoni è sempre dotato di funzioni di pulizia in loco (CIP) e sterilizzazione in loco (SIP). Il sonotrodo consiste in un corno di titanio massiccio che può essere pulito o lavato in acqua o solvente (a seconda del mezzo di lavoro). La manutenzione degli ultrasonori è quasi trascurabile grazie alla loro robustezza.

Lisi a ultrasuoni e interruzione delle cellule

Generalmente, la lisi dei campioni in laboratorio richiede tra i 15 secondi e i 2 minuti. Poiché l'intensità della sonicazione è molto facile da regolare impostando l'ampiezza del tempo di sonicazione e scegliendo l'attrezzatura giusta, è possibile interrompere le membrane cellulari molto delicatamente o molto bruscamente, a seconda della struttura cellulare e dello scopo della lisi (ad esempio, l'estrazione del DNA richiede una sonicazione più morbida, l'estrazione completa delle proteine dei batteri richiede un trattamento ecografico più intenso). La temperatura durante il processo può essere monitorata da un sensore di temperatura integrato e può essere facilmente controllata mediante raffreddamento (bagno di ghiaccio o celle a flusso con camicie di raffreddamento) o mediante sonicazione in modalità pulsata. Durante la sonicazione a impulsi, brevi cicli di scoppio di sonicazione della durata di 1-15 secondi consentono la dissipazione del calore e il raffreddamento durante i periodi intermittenti più lunghi.
Tutti i processi a ultrasuoni sono completamente riproducibili e linearmente scalabili.

Omogeneizzatori a ultrasuoni per la lisi e l'estrazione delle cellule

Diversi tipi di dispositivi a ultrasuoni consentono di soddisfare gli obiettivi di preparazione dei campioni e di assicurare la facilità d'uso e il comfort operativo. Gli ultrasuonatori a sonda sono i dispositivi più comuni in laboratorio. Sono i più adatti per la preparazione di campioni di piccole e medie dimensioni con volumi da 0,1mL a 1000mL. Le diverse potenze e i diversi sonotrodi consentono di adattare l'ultrasuonatore al volume del campione e al recipiente per ottenere risultati di sonicazione più efficaci ed efficienti. Il dispositivo con sonda a ultrasuoni è la scelta migliore quando si devono preparare campioni singoli.

Se si devono preparare più campioni, ad esempio 8-10 fiale di soluzione cellulare, un'intensa sonicazione indiretta con sistemi a ultrasuoni come il VialTweeter o un corno a tazza a ultrasuoni sono il metodo di omogeneizzazione più adatto per una lisi efficiente. Diverse fiale vengono sonicate contemporaneamente, alla stessa intensità. In questo modo non solo si risparmia tempo, ma si garantisce anche lo stesso trattamento di tutti i campioni, rendendo i risultati tra i campioni affidabili e comparabili. Inoltre, durante la sonicazione indiretta si evita la contaminazione incrociata dovuta all'immersione del sonotrodo a ultrasuoni (noto anche come sonda a ultrasuoni, corno, punta o dito). L'utilizzo di fiale adatte alle dimensioni del campione consente di evitare le lunghe operazioni di pulizia e la perdita di campioni dovuta al travaso dei recipienti. Per la sonicazione uniforme di piastre multipozzetto o microtiter, Hielscher offre il modello UIP400MTP.
Per volumi superiori, ad esempio per la produzione commerciale di estratti cellulari, sono più adatti i sistemi a ultrasuoni continui con reattore a celle a flusso. Il flusso continuo e uniforme del materiale lavorato assicura una sonicazione uniforme. Tutti i parametri del processo di disintegrazione ultrasonica possono essere ottimizzati e adattati ai requisiti dell'applicazione e al materiale specifico della cella.
 
 
Procedura esemplare per la lisi ad ultrasuoni delle cellule batteriche:

• Preparazione della sospensione cellulare: I pellet cellulari devono essere completamente sospesi in una soluzione tampone per omogeneizzazione (scegliere una soluzione tampone compatibile con le analisi successive, ad es. metodo cromatografico specifico). Aggiungere lisozimi e/o altri additivi, se necessario (devono essere compatibili anche con i mezzi di separazione/pulificazione). Miscelare/omogeneizzare delicatamente la soluzione sotto leggera sonicazione fino ad ottenere una sospensione completa.
• Lisi ad ultrasuoni: Mettere il campione in un bagno di ghiaccio. Per le interruzioni cellulari, sonicare la sospensione a raffiche di 60-90 secondi (utilizzando la modalità a impulsi dell'ultrasuoni).
• Separazione: Centrifugare il lisato (es. 10 min. a 10.000 x g; a 4°C). Separare accuratamente il surnatante dal pellet di cellule. Il surnatante è il lisato cellulare totale. Dopo la filtrazione del surnatante, si ottiene un fluido chiarificato della proteina cellulare solubile.

 
 
Le applicazioni più comuni per gli ultrasuoni in biologia e biotecnologia sono:

• Preparazione dell'estratto cellulare
• Distruzione di lievito, batteri, cellule vegetali, tessuto cellulare morbido o duro, materiale nucleico
• Estrazione di proteine
• Preparazione e isolamento degli enzimi
• Produzione di antigeni
• Estrazione del DNA e/o frammentazione mirata
• Preparazione dei liposomi