La sonicazione per la lisi cellulare: Disgregazione ed estrazione delle cellule
La lisi cellulare a ultrasuoni è una tecnica di preparazione dei campioni ampiamente applicata nei moderni laboratori biotecnologici. Il suo scopo principale è quello di rompere le membrane cellulari o intere cellule per rilasciare componenti intracellulari come proteine, acidi nucleici o organelli. Nel lavoro quotidiano di laboratorio, ciò significa che la sonicazione è un metodo standard per la disgregazione controllata delle cellule e l'estrazione efficiente delle biomolecole. Il vantaggio principale dei sonicatori risiede nella loro capacità di modulare con precisione i parametri critici del processo, tra cui l'intensità degli ultrasuoni, le pulsazioni e il controllo della temperatura. Questo controllo consente ai ricercatori di ottenere una lisi affidabile riducendo al minimo i danni termici o meccanici alle biomolecole sensibili, ottenendo un processo di estrazione delicato ma altamente efficiente.
Lisi cellulare con i sonicatori
La lisi cellulare a ultrasuoni utilizza la cavitazione acustica per rompere le membrane cellulari e rilasciare le molecole intracellulari. Hielscher Ultrasonics offre il classico sonicatore a sonda e sonicatori multi-campione per il trattamento sterile: il VialTweeter per provette e fiale multiple e il Sonicatore per piastre a 96 pozzetti UIP400MTP per micropiastre standard.
Hielscher Ultrasonics fornisce potenti sonicatori senza contatto per la preparazione dei campioni e le analisi cliniche. Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP, Il VialTweeter, il corno a tazza e il sonicatore di flusso GDmini2 elaborare i campioni in condizioni di sterilità.
Omogeneizzatori a ultrasuoni UP100H (100 watt) e UP400St (400 watt): Sonizzazione per la lisi e l'estrazione delle cellule.
Omogeneizzatori a ultrasuoni per la lisi e l'estrazione delle cellule
| Tipo di dispositivo a ultrasuoni | Focus sull'applicazione | Volume del campione | Caso d'uso tipico | Vantaggi | Modelli di esempio |
|---|---|---|---|---|---|
| Sonicatori a sonda | Sonicazione di un singolo campione | 0Da .1 mL a ~1000 mL | Lisi cellulare, estrazione di proteine, frammentazione di DNA/RNA | Controllo preciso dell'energia; diversi sonotrodi; ottimale per campioni medio-piccoli | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Trattamento in parallelo di più fiale sigillate | 8-10 fiale (~1-20 mL ciascuna) | Lisi standardizzata di sospensioni cellulari multiple | Sonicazione uniforme; evita la contaminazione incrociata; risultati riproducibili | VialTweeter, Cuphorn |
| Sonicatore per piastre da 96 pozzetti | Sonizzazione di piastre multipozzetto e microtitolazione | Formato della micropiastra | Screening ad alta produttività, proteomica, saggi cellulari | Sonicazione simultanea e uniforme su tutti i pozzetti; ideale per flussi di lavoro multi-campione | UIP400MTP |
| reattori a cella di flusso | Sonicazione continua per volumi più elevati | >1 L, scalabile | Distruzione cellulare su scala industriale, produzione di estratti | Lavorazione continua; scalabile; controllo completo del processo (ampiezza, pressione, temperatura) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + cella a flusso |
| Sistemi di sonicazione sterili/indiretti | Trattamento dei campioni senza contaminazione | Dipendente da fiala/provetta/micropiastra | Campioni sensibili, ambienti sterili, impostazioni normative | Nessun contatto con la sonda; evita il carryover; minimo sforzo di pulizia | VialTweeter, Cuphorn, UIP400MTP |
Vantaggi dell'uso della sonicazione per la lisi cellulare
Rispetto ad altri metodi di lisi ed estrazione cellulare, la lisi cellulare a ultrasuoni presenta diversi vantaggi:
- Velocità: La lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni è un metodo rapido che può aprire le cellule in pochi secondi. È molto più veloce di altri metodi come l'omogeneizzazione, il liofilizzazione o la macinazione delle perle.
- Efficienza: La lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni possono essere utilizzate per trattare campioni piccoli, grandi o multipli in una sola volta, rendendole più efficienti rispetto ad altri metodi che richiedono il trattamento individuale di piccoli campioni.
- Senza sostanze chimiche: La lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni è un metodo non invasivo che non richiede l'uso di sostanze chimiche o enzimi aggressivi. Ciò lo rende ideale per le applicazioni in cui è necessario mantenere l'integrità del contenuto cellulare. È possibile evitare la contaminazione indesiderata dei campioni.
- Alto rendimento: La lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni possono estrarre un'elevata quantità di contenuti cellulari, tra cui DNA, RNA e proteine. Questo perché le onde sonore ad alta frequenza rompono le pareti cellulari e rilasciano il contenuto nella soluzione circostante.
- Controllo della temperatura: I sofisticati ultrasonici consentono un controllo preciso della temperatura del campione. I sonicatori digitali Hielscher sono dotati di un sensore di temperatura collegabile e di un software di monitoraggio della temperatura.
- Riproducibile: I protocolli per la lisi cellulare a ultrasuoni possono essere facilmente riprodotti e persino adattati a volumi di campione più o meno grandi con un semplice scale-up lineare.
- Versatile: La lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni possono essere utilizzate per estrarre un'ampia gamma di tipi di cellule, tra cui batteri, lieviti, funghi, cellule vegetali e di mammiferi. Può anche essere utilizzata per estrarre diversi tipi di molecole, tra cui proteine, DNA, RNA e lipidi.
- Preparazione simultanea di numerosi campioni: Hielscher Ultrasonics offre diverse soluzioni per trattare comodamente numerosi campioni nelle stesse condizioni di processo. In questo modo la fase di preparazione dei campioni, la lisi e l'estrazione, diventa estremamente efficiente e consente di risparmiare tempo.
- Facile da usare: L'apparecchiatura per la lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni è facile da usare e richiede una formazione minima. L'apparecchiatura è anche economica, in quanto si tratta di un unico investimento che non richiede il riacquisto di prodotti da smaltire. Ciò la rende interessante per un'ampia gamma di ricercatori e laboratori.
Nel complesso, la lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni è un metodo veloce, efficiente, controllabile con precisione e versatile per estrarre il contenuto cellulare. I suoi vantaggi rispetto ai metodi alternativi lo rendono una scelta interessante per un'ampia gamma di applicazioni industriali e di ricerca.
Principio di funzionamento della lisi cellulare a ultrasuoni
La lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni utilizza onde sonore ad alta frequenza per disgregare le cellule ed estrarne il contenuto. Le onde sonore creano cambiamenti di pressione nel liquido circostante, causando la formazione e il collasso di piccole bolle in un processo noto come cavitazione. Queste bolle generano forze meccaniche localizzate e molto intense che possono rompere le cellule e rilasciare il loro contenuto nella soluzione circostante.
La lisi cellulare con l'ausilio di un ultrasuonatore prevede comunemente le seguenti fasi:
- Il campione viene posto in una provetta o in un contenitore con un tampone liquido.
- Una sonda a ultrasuoni viene inserita nel campione e vengono applicate onde sonore ad alta frequenza di circa 20-30 kHz.
- Le onde ultrasonore provocano oscillazioni e cavitazione nel liquido circostante, generando forze localizzate che rompono le cellule e ne rilasciano il contenuto.
- Il campione viene centrifugato o filtrato per rimuovere eventuali detriti cellulari e il contenuto estratto viene raccolto per l'analisi a valle.
Svantaggi dei metodi di lisi più comuni
Durante il vostro lavoro in laboratorio, potreste aver già sperimentato la seccatura della lisi cellulare con i tradizionali protocolli di lisi meccanica o chimica.
- Lisi meccanica: I metodi di lisi meccanica, come la macinazione con mortaio e pestello o l'omogeneizzazione con pressa francese, mulino a perline o sistema rotore-statore, spesso non hanno opzioni di controllo e regolazione precise. Ciò significa che l'uso di macinazione e triturazione può generare rapidamente calore e forze di taglio che possono danneggiare il campione e denaturare le proteine. Inoltre, possono richiedere molto tempo e grandi quantità di materiale di partenza.
- Lisi chimica: I metodi di lisi chimica, come la lisi basata su detergenti, possono danneggiare il campione interrompendo il bilayer lipidico e denaturando le proteine. Inoltre, possono richiedere più passaggi e lasciare contaminanti residui che interferiscono con le applicazioni a valle. Trovare il dosaggio ottimale di detergente è un'ulteriore sfida.
- Cicli di congelamento e scongelamento: I cicli di congelamento e scongelamento possono causare la rottura delle membrane cellulari, ma cicli ripetuti possono anche causare la denaturazione e la degradazione delle proteine. Questo metodo può anche richiedere più cicli, il che può richiedere molto tempo e spesso comporta rese inferiori.
- Lisi enzimatica: I metodi di lisi enzimatica possono essere specifici per alcuni tipi di cellule e richiedono più passaggi, con conseguente dispendio di tempo. Inoltre, generano rifiuti e richiedono un'attenta ottimizzazione per evitare la degradazione del campione. I kit di lisi enzimatica sono spesso costosi. Se l'attuale procedura di lisi enzimatica non dà risultati sufficienti, è possibile applicare la sonicazione come metodo sinergico per intensificare la disgregazione cellulare.
A differenza dei metodi convenzionali di lisi cellulare meccanica e chimica, la sonicazione è uno strumento molto efficiente e affidabile per la disintegrazione cellulare che consente un controllo completo dei parametri di sonicazione. Ciò garantisce un'elevata selettività nel rilascio dei materiali e la purezza del prodotto. [Balasundaram et al., 2009].
È adatto a tutti i tipi di cellule e facilmente applicabile su piccola e grande scala. – sempre in condizioni controllate. Gli omogeneizzatori a ultrasuoni sono facili da pulire. Un omogeneizzatore a ultrasuoni è sempre dotato di funzioni di pulizia in loco (CIP) e sterilizzazione in loco (SIP). Il sonotrodo consiste in un corno di titanio massiccio che può essere pulito o lavato in acqua o solvente (a seconda del mezzo di lavoro). La manutenzione degli ultrasonori è quasi trascurabile grazie alla loro robustezza.
Lisi e distruzione cellulare a ultrasuoni
In genere, la lisi dei campioni in laboratorio richiede da 15 secondi a 2 minuti. Poiché l'intensità della sonicazione è molto facile da regolare attraverso l'impostazione dell'ampiezza e del tempo di sonicazione, nonché scegliendo l'apparecchiatura giusta, è possibile rompere le membrane cellulari in modo molto delicato o molto brusco, a seconda della struttura cellulare e dello scopo della lisi (ad esempio, l'estrazione del DNA richiede una sonicazione più morbida, mentre l'estrazione completa delle proteine dei batteri richiede un trattamento a ultrasuoni più intenso). La temperatura durante il processo può essere monitorata da un sensore di temperatura integrato e può essere facilmente controllata mediante raffreddamento (bagno di ghiaccio o celle a flusso con camicie di raffreddamento) o mediante sonicazione in modalità pulsata. Durante la sonicazione in modalità pulsata, brevi cicli di sonicazione della durata di 1-15 secondi consentono la dissipazione del calore e il raffreddamento durante i periodi intermittenti più lunghi.
Tutti i processi guidati dagli ultrasuoni sono completamente riproducibili e linearmente scalabili.
Il VialTweeter è un omogeneizzatore a ultrasuoni per la preparazione sterile, uniforme e rapida di numerosi campioni.
- Preparazione della sospensione cellulare: I pellet cellulari devono essere completamente sospesi in una soluzione tampone mediante omogeneizzazione (scegliere una soluzione tampone compatibile con l'analisi successiva, ad esempio un metodo cromatografico specifico). Aggiungere lisozimi e/o altri additivi, se necessario (devono essere compatibili con i mezzi di separazione/purificazione). Mescolare/omogeneizzare delicatamente la soluzione con una leggera sonicazione fino a ottenere una sospensione completa.
Per saperne di più sulle sinergie dei lisozimi combinati con la sonicazione! - Lisi a ultrasuoni: Mettere il campione in un bagno di ghiaccio. Per la disgregazione cellulare, sonicare la sospensione a raffiche di 60-90 secondi (utilizzando la modalità a impulsi del sonicatore).
- Separazione: Centrifugare il lisato (ad es. 10 minuti a 10.000 x g; a 4°C). Separare accuratamente il surnatante dal pellet cellulare. Il surnatante è il lisato cellulare totale. Dopo la filtrazione del surnatante, si ottiene un fluido chiarificato di proteine cellulari solubili.
Le applicazioni più comuni degli ultrasuoni in biologia e biotecnologia sono:
- Preparazione dell'estratto cellulare
- Distruzione di lieviti, batteri, cellule vegetali, tessuto cellulare molle o duro, materiale nucleico
- estrazione delle proteine
- Preparazione e isolamento degli enzimi
- Produzione di antigeni
- Estrazione del DNA e/o frammentazione mirata
- preparazione di liposomi
La disgregazione delle cellule con un ultrasuonatore a sonda è un metodo efficiente di preparazione dei campioni.
Le molteplici applicazioni degli ultrasuoni si estendono ai settori della biotecnologia, della bioingegneria, della microbiologia, della biologia molecolare, della biochimica, dell'immunologia, della batteriologia, della virologia, della proteomica, della genetica, della fisiologia, della biologia cellulare, dell'ematologia e della botanica.
Lisi: Rompere le strutture cellulari
Le cellule sono protette da una membrana plasmatica semipermeabile che consiste in un bilayer fosfo-lipidico (anche bilayer proteico-lipidico; formato da lipidi idrofobici e molecole di fosforo idrofile con molecole proteiche incorporate) e crea una barriera tra l'interno della cellula (citoplasma) e l'ambiente extracellulare. Le cellule vegetali e procariotiche sono circondate da una parete cellulare. Grazie alla parete cellulare spessa più strati di cellulosa, le cellule vegetali sono più difficili da lisciare rispetto alle cellule animali. L'interno della cellula, come gli organelli, il nucleo e il mitocondrio, è stabilizzato dal citoscheletro.
La lisazione delle cellule ha lo scopo di estrarre e separare organelli, proteine, DNA, mRNA o altre biomolecole.
Metodi convenzionali di lisi cellulare e loro svantaggi
Esistono diversi metodi per lisare le cellule, che possono essere suddivisi in metodi meccanici e chimici, che includono l'uso di detergenti o solventi, l'applicazione di alta pressione, l'uso di un mulino a perline o di una pressa francese. Lo svantaggio più problematico di questi metodi è il difficile controllo e la regolazione dei parametri del processo e quindi l'impatto.
La tabella seguente mostra i principali svantaggi dei metodi di lisi più comuni:
Tabella: I metodi convenzionali di lisi cellulare presentano notevoli svantaggi
Procedura di lisi
La lisi è un processo delicato. Durante la lisi la protezione della membrana cellulare viene distrutta, ma occorre evitare l'inattivazione, la denaturazione e la degradazione delle proteine estratte da parte di un ambiente non fisiologico (deviazione dal valore di pH). Pertanto, in genere la lisi viene effettuata in una soluzione tampone. La maggior parte delle difficoltà deriva da un'interruzione incontrollata della cellula che comporta un rilascio non mirato di tutto il materiale intracellulare e/o la denaturazione del prodotto target.
Domande frequenti su sonicazione e lisi cellulare
- Si possono lisciviare le cellule con la sonicazione? Sì, la sonicazione liscia efficacemente le cellule utilizzando onde ultrasoniche ad alta frequenza che inducono la cavitazione, un fenomeno in cui piccole bolle di vapore si formano e collassano violentemente all'interno della sospensione cellulare. Le forze meccaniche risultanti rompono le membrane cellulari e facilitano il rilascio di componenti intracellulari nel liquido.
- Come utilizzare un sonicatore per la lisi cellulare? L'utilizzo di un sonicatore per la lisi cellulare comporta l'immersione della sonda del sonicatore in una sospensione cellulare e la regolazione di parametri quali l'ampiezza e la durata dell'impulso. Il processo deve essere attentamente monitorato per ottimizzare la rottura delle cellule e ridurre al minimo la denaturazione delle proteine e l'inattivazione degli enzimi.
- Qual è il principio della sonicazione per la lisi cellulare? La sonicazione funziona secondo il principio della cavitazione acustica. L'energia ultrasonica viene trasmessa nel mezzo liquido, provocando rapide fluttuazioni di pressione che portano alla formazione e all'implosione di microbolle. Queste implosioni generano intense forze di taglio e alte temperature localizzate, disgregando le strutture cellulari e migliorando l'omogeneità del lisato.
- Quanto dura la sonicazione della lisi cellulare? La durata della sonicazione per la lisi cellulare può variare in modo significativo a seconda di fattori quali il tipo di cellula, la densità cellulare, la potenza del sonicatore e il protocollo specifico utilizzato. Le procedure tipiche possono variare da alcuni secondi a qualche minuto, spesso eseguite in cicli per gestire la generazione di calore e garantire una rottura uniforme delle cellule.
- Qual è lo scopo della sonicazione nell'estrazione delle proteine? Nell'estrazione delle proteine, la sonicazione serve a rompere efficacemente le membrane cellulari e a solubilizzare le proteine. Questo metodo è particolarmente utile per liberare le proteine dall'interno dei compartimenti cellulari, il che lo rende essenziale per la preparazione di lisati da cui le proteine devono essere purificate o analizzate.
- Perché si usa la sonicazione per l'estrazione? La sonicazione è favorita per l'estrazione grazie alla sua azione rapida e alla capacità di applicare un'energia mirata, rompendo le strutture cellulari per rilasciare molecole bioattive senza l'uso di trattamenti chimici aggressivi, preservando così l'integrità funzionale dei composti estratti.
- La sonicazione interrompe le interazioni proteina-proteina? Sebbene la sonicazione sia in grado di disgregare efficacemente le membrane cellulari, può anche interrompere le interazioni proteina-proteina. Il livello di interruzione dipende dall'intensità della sonicazione e dalla durata dell'esposizione, e può portare alla denaturazione o alla dissociazione dei complessi proteici, con possibili ripercussioni sui successivi studi analitici o funzionali.
- Si può usare la sonicazione per lisciviare l'E. coli? I sonicatori Hielscher sono particolarmente efficaci per lisare cellule batteriche come l'E. coli, che hanno pareti cellulari robuste. Questa tecnica fornisce un metodo fisico per tagliare la parete cellulare e la membrana, rendendola un metodo preferito per preparare lisati batterici nei laboratori di biologia molecolare e biochimica.
- Quali sono i processi successivi alla fase di sonicazione?
Le fasi a valle della lisi ad ultrasuoni includono tipicamente il frazionamento del lisato, l'isolamento mirato degli organelli e l'ulteriore estrazione o purificazione delle proteine.
Il lisato elaborato viene quindi separato e preparato per applicazioni analitiche o funzionali, come la proteomica ad alta risoluzione, la trascrittomica o gli studi di legame con i recettori.
Letteratura/riferimenti
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.