Sonicazione per la lisi cellulare: disgregazione cellulare ed estrazione
La lisi cellulare a ultrasuoni è una tecnica di preparazione dei campioni ampiamente utilizzata nei moderni laboratori biotecnologici. Il suo scopo principale è disgregare le membrane cellulari o le cellule intere per rilasciare componenti intracellulari quali proteine, acidi nucleici o organelli. Nel lavoro quotidiano in laboratorio, ciò significa che la sonicazione è un metodo standard per la disgregazione cellulare controllata e l’estrazione efficiente di biomolecole. Il principale vantaggio dei sonicatori risiede nella loro capacità di modulare con precisione i parametri critici del processo, tra cui l’intensità degli ultrasuoni, il funzionamento pulsato e il controllo della temperatura. Questo controllo consente ai ricercatori di ottenere una lisi affidabile riducendo al minimo i danni termici o meccanici alle biomolecole sensibili, con un processo di estrazione delicato ma altamente efficiente.
Lisi cellulare mediante sonicatori
La lisi cellulare a ultrasuoni utilizza la cavitazione acustica per disgregare le membrane cellulari e rilasciare le molecole intracellulari. Hielscher Ultrasonics offre il classico sonicatore a sonda e sonicatori per più campioni per il trattamento in condizioni sterili: il VialTweeter per più provette e fiale e il sonicatore per piastre a 96 pozzetti UIP400MTP per micropiastre standard.
Hielscher Ultrasonics fornisce potenti sonicatori senza contatto per la preparazione dei campioni e l’analisi clinica. Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP, il VialTweeter, il CupHorn e il sonicatore a flusso GDmini2 trattano i campioni in condizioni sterili.
Omogeneizzatori a ultrasuoni UP100H (100 watt) e UP400St (400 watt): sonicazione per la lisi cellulare e l’estrazione.
Omogeneizzatori a ultrasuoni per la lisi cellulare e l’estrazione
| Tipo di dispositivo a ultrasuoni | Applicazione principale | Volume del campione | Caso d’uso tipico | Vantaggi | Esempi di modelli |
|---|---|---|---|---|---|
| Sonicatori a sonda | Sonicazione di un singolo campione | Da 0,1 mL a ~1000 mL | Lisi cellulare, estrazione delle proteine, frammentazione di DNA/RNA | Controllo preciso dell’energia; diversi sonotrodi; ottimali per campioni di volume piccolo e medio | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Trattamento parallelo di più fiale sigillate | 8–10 fiale (~1–20 mL ciascuna) | Lisi standardizzata di più sospensioni cellulari | Sonicazione uniforme; evita la contaminazione crociata; risultati riproducibili | VialTweeter, CupHorn |
| Sonicatore per piastre a 96 pozzetti | Sonicazione di piastre multipozzetto e piastre per microtitolazione | Formato micropiastra | Screening con elevata capacità di trattamento dei campioni, proteomica, saggi cellulari | Sonicazione simultanea e uniforme in tutti i pozzetti; ideale per flussi di lavoro con più campioni | UIP400MTP |
| Reattori con cella di flusso | Sonicazione continua per volumi maggiori | >1 L, scalabile | Disgregazione cellulare su scala industriale, produzione di estratti | Trattamento continuo; scalabile; controllo completo del processo (ampiezza, pressione, temperatura) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + cella di flusso |
| Sistemi di sonicazione sterile / indiretta | Trattamento dei campioni senza contaminazione | Dipende dalla fiala/provetta/micropiastra | Campioni sensibili, ambienti sterili, contesti soggetti a requisiti normativi | Nessun contatto con la sonda; evita il trascinamento di residui; pulizia minima | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Vantaggi dell’uso della sonicazione per la lisi cellulare
Rispetto ad altri metodi di lisi cellulare ed estrazione, la lisi cellulare a ultrasuoni presenta diversi vantaggi:
- Rapidità: La lisi cellulare e l’estrazione a ultrasuoni costituiscono un metodo rapido in grado di rompere le cellule in pochi secondi. È molto più rapido di altri metodi quali l’omogeneizzazione, il congelamento-scongelamento o la macinazione con mulino a sfere.
- Efficienza: La lisi cellulare e l’estrazione a ultrasuoni possono essere utilizzate per trattare campioni piccoli, grandi o più campioni contemporaneamente, risultando più efficienti di altri metodi che richiedono il trattamento individuale di piccoli campioni.
- Senza sostanze chimiche: La lisi cellulare e l’estrazione a ultrasuoni costituiscono un metodo non invasivo che non richiede l’uso di sostanze chimiche aggressive o enzimi. Ciò lo rende ideale per le applicazioni in cui occorre mantenere l’integrità del contenuto cellulare. È possibile evitare la contaminazione indesiderata dei campioni.
- Resa elevata: La lisi cellulare e l’estrazione a ultrasuoni consentono di ottenere una resa elevata del contenuto cellulare, inclusi DNA, RNA e proteine. Questo avviene perché le onde sonore ad alta frequenza rompono le pareti cellulari e rilasciano il contenuto nella soluzione circostante.
- Controllo della temperatura: I sonicatori avanzati consentono un controllo preciso della temperatura del campione. I sonicatori digitali Hielscher sono dotati di un sensore di temperatura collegabile e di un software per il monitoraggio della temperatura.
- Riproducibilità: I protocolli per la lisi cellulare a ultrasuoni possono essere facilmente riprodotti e adattati anche a volumi di campione diversi, maggiori o minori, mediante un semplice cambiamento lineare di scala.
- Versatilità: La lisi cellulare e l’estrazione a ultrasuoni possono essere utilizzate per estrarre il contenuto di un’ampia gamma di tipi cellulari, tra cui batteri, lieviti, funghi, cellule vegetali e di mammifero. Possono inoltre essere utilizzate per estrarre diversi tipi di molecole, tra cui proteine, DNA, RNA e lipidi.
- Preparazione simultanea di numerosi campioni: Hielscher Ultrasonics offre diverse soluzioni per trattare comodamente numerosi campioni nelle medesime condizioni di processo. Ciò rende la fase di preparazione dei campioni mediante lisi ed estrazione altamente efficiente e consente di risparmiare tempo.
- Facilità d’uso: Le apparecchiature per la lisi cellulare e l’estrazione a ultrasuoni sono facili da usare e richiedono una formazione minima. Sono anche economiche, poiché comportano un unico investimento senza la necessità di riacquistare materiali monouso. Questo le rende interessanti per un’ampia gamma di ricercatori e laboratori.
Nel complesso, la lisi cellulare e l’estrazione a ultrasuoni costituiscono un metodo rapido, efficiente, controllabile con precisione e versatile per estrarre il contenuto cellulare. I vantaggi rispetto ai metodi alternativi lo rendono una scelta interessante per un’ampia gamma di applicazioni di ricerca e industriali.
Principio di funzionamento della lisi cellulare a ultrasuoni
La lisi cellulare e l’estrazione a ultrasuoni utilizzano onde sonore ad alta frequenza per disgregare le cellule ed estrarne il contenuto. Le onde sonore creano variazioni di pressione nel liquido circostante, causando la formazione e il collasso di piccole bolle in un processo noto come cavitazione. Queste bolle generano forze meccaniche localizzate molto intense, in grado di rompere le cellule e rilasciarne il contenuto nella soluzione circostante.
La lisi cellulare mediante un sonicatore comprende generalmente le seguenti fasi:
- Il campione viene posto in una provetta o in un contenitore con una soluzione tampone liquida.
- Una sonda a ultrasuoni viene inserita nel campione e vengono applicate onde sonore ad alta frequenza di circa 20–30 kHz.
- Le onde ultrasoniche causano oscillazioni e cavitazione nel liquido circostante, generando forze localizzate che rompono le cellule e ne rilasciano il contenuto.
- Il campione viene centrifugato o filtrato per rimuovere eventuali detriti cellulari e il contenuto estratto viene raccolto per le analisi successive.
Svantaggi dei metodi di lisi comuni
Durante il lavoro in laboratorio, potreste aver già sperimentato le difficoltà della lisi cellulare mediante protocolli tradizionali di lisi meccanica o chimica.
- Lisi meccanica: I metodi di lisi meccanica, quali la triturazione con mortaio e pestello o l’omogeneizzazione mediante una pressa French, un mulino a sfere o un sistema rotore-statore, spesso non offrono possibilità precise di controllo e regolazione. Ciò significa che la macinazione e la triturazione possono generare rapidamente calore e forze di taglio in grado di danneggiare il campione e denaturare le proteine. Possono inoltre richiedere molto tempo e grandi quantità di materiale di partenza.
- Lisi chimica: I metodi di lisi chimica, come la lisi con detergenti, possono danneggiare il campione disgregando il doppio strato lipidico e denaturando le proteine. Possono inoltre richiedere più fasi e lasciare contaminanti residui che interferiscono con le applicazioni successive. Individuare il dosaggio ottimale del detergente rappresenta un’ulteriore difficoltà.
- Cicli di congelamento-scongelamento: I cicli di congelamento-scongelamento possono causare la rottura delle membrane cellulari, ma cicli ripetuti possono anche provocare la denaturazione e la degradazione delle proteine. Questo metodo può inoltre richiedere più cicli, con tempi lunghi e rese spesso inferiori.
- Lisi enzimatica: I metodi di lisi enzimatica possono essere specifici per determinati tipi cellulari e richiedere più fasi, rendendoli dispendiosi in termini di tempo. Generano inoltre rifiuti e richiedono un’attenta ottimizzazione per evitare la degradazione del campione. I kit per la lisi enzimatica sono spesso costosi. Se la procedura di lisi enzimatica attualmente utilizzata dà risultati insufficienti, è possibile applicare la sonicazione come metodo sinergico per intensificare la disgregazione cellulare.
Rispetto ai metodi convenzionali di lisi cellulare meccanica e chimica, la sonicazione è uno strumento molto efficiente e affidabile per la disgregazione cellulare, che consente un controllo completo dei parametri di sonicazione. Ciò garantisce un’elevata selettività nel rilascio dei materiali e un’elevata purezza del prodotto. [cfr. Balasundaram et al., 2009]
È adatta a tutti i tipi cellulari ed è facilmente applicabile su piccola e grande scala – sempre in condizioni controllate. I sonicatori sono facili da pulire. Un omogeneizzatore a ultrasuoni dispone sempre delle funzioni di pulizia in loco (CIP) e sterilizzazione in loco (SIP). Il sonotrodo è costituito da una massiccia sonotromba in titanio, che può essere pulita con un panno o risciacquata con acqua o solvente (a seconda del mezzo di lavoro). Grazie alla loro robustezza, la manutenzione dei sonicatori è quasi trascurabile.
Lisi a ultrasuoni e disgregazione cellulare
Generalmente, la lisi dei campioni in laboratorio richiede tra 15 secondi e 2 minuti. Poiché l’intensità della sonicazione è molto facile da regolare impostando l’ampiezza e il tempo di sonicazione, nonché scegliendo l’apparecchiatura appropriata, è possibile disgregare le membrane cellulari in modo molto delicato o molto brusco, a seconda della struttura cellulare e dello scopo della lisi (ad esempio, l’estrazione del DNA richiede una sonicazione più delicata, mentre l’estrazione completa delle proteine dai batteri richiede un trattamento a ultrasuoni più intenso). La temperatura durante il processo può essere monitorata mediante un sensore di temperatura integrato e può essere facilmente controllata mediante raffreddamento (bagno di ghiaccio o celle di flusso con camicie di raffreddamento) oppure mediante sonicazione in modalità pulsata. Durante la sonicazione in modalità pulsata, brevi cicli di sonicazione della durata di 1–15 secondi consentono la dissipazione del calore e il raffreddamento durante gli intervalli più lunghi.
Tutti i processi basati sugli ultrasuoni sono completamente riproducibili e scalabili linearmente.
Il VialTweeter è un omogeneizzatore a ultrasuoni per la preparazione sterile simultanea, uniforme e rapida di numerosi campioni.
- Preparazione della sospensione cellulare: i pellet cellulari devono essere completamente sospesi in una soluzione tampone mediante omogeneizzazione (scegliete una soluzione tampone compatibile con l’analisi successiva, ad esempio con uno specifico metodo cromatografico). Aggiungete lisozimi e/o altri additivi, se necessario (devono essere compatibili anche con i metodi di separazione/purificazione). Mescolate/omogeneizzate delicatamente la soluzione mediante sonicazione a bassa intensità fino a ottenere una sospensione completa.
Scoprite di più sulle sinergie dei lisozimi combinati con la sonicazione! - Lisi a ultrasuoni: ponete il campione in un bagno di ghiaccio. Per la disgregazione cellulare, sonicate la sospensione con impulsi di 60–90 secondi (utilizzando la modalità pulsata del sonicatore).
- Separazione: centrifugate il lisato (ad esempio, 10 min. a 10.000 x g; a 4degC). Separate con cura il surnatante dal pellet cellulare. Il surnatante è il lisato cellulare totale. Dopo la filtrazione del surnatante, si ottiene un liquido chiarificato contenente le proteine cellulari solubili.
Le applicazioni più comuni dei sonicatori in biologia e biotecnologia sono:
- Preparazione di estratti cellulari
- Disgregazione di lieviti, batteri, cellule vegetali, tessuti cellulari molli o duri, materiale nucleico
- Estrazione delle proteine
- Preparazione e isolamento di enzimi
- Produzione di antigeni
- Estrazione del DNA e/o frammentazione mirata
- Preparazione di liposomi
La disgregazione cellulare con un sonicatore a sonda è un metodo efficiente di preparazione dei campioni.
Le molteplici applicazioni degli ultrasuoni si estendono ai settori della biotecnologia, bioingegneria, microbiologia, biologia molecolare, biochimica, immunologia, batteriologia, virologia, proteomica, genetica, fisiologia, biologia cellulare, ematologia e botanica.
Lisi: rottura delle strutture cellulari
Le cellule sono protette da una membrana plasmatica semipermeabile costituita da un doppio strato fosfolipidico (anche doppio strato proteico-lipidico; formato da lipidi idrofobici e molecole di fosforo idrofile con molecole proteiche incorporate), che crea una barriera tra l’interno della cellula (citoplasma) e l’ambiente extracellulare. Le cellule vegetali e le cellule procariotiche sono circondate da una parete cellulare. A causa della spessa parete cellulare di cellulosa composta da più strati, le cellule vegetali sono più difficili da lisare rispetto alle cellule animali. Le strutture interne della cellula, quali organelli, nucleo e mitocondrio, sono stabilizzate dal citoscheletro.
La lisi cellulare ha lo scopo di estrarre e separare organelli, proteine, DNA, mRNA o altre biomolecole.
Metodi convenzionali di lisi cellulare e relativi svantaggi
Esistono diversi metodi per lisare le cellule, che possono essere suddivisi in metodi meccanici e chimici e comprendono l’uso di detergenti o solventi, l’applicazione di alta pressione oppure l’uso di un mulino a sfere o di una pressa French. Lo svantaggio più problematico di questi metodi è la difficoltà di controllare e regolare i parametri del processo e, di conseguenza, i loro effetti.
La tabella seguente mostra i principali svantaggi dei metodi di lisi comuni:
Tabella: i metodi convenzionali di lisi cellulare presentano svantaggi rilevanti
Procedura di lisi
La lisi è un processo delicato. Durante la lisi viene distrutta la protezione offerta dalla membrana cellulare; tuttavia, occorre prevenire l’inattivazione, la denaturazione e la degradazione delle proteine estratte causate da un ambiente non fisiologico (scostamento dal valore di pH). Pertanto, la lisi viene generalmente eseguita in una soluzione tampone. La maggior parte delle difficoltà deriva da una disgregazione cellulare non controllata, che provoca un rilascio non mirato di tutto il materiale intracellulare e/o la denaturazione del prodotto di interesse.
Domande frequenti sulla sonicazione e sulla lisi cellulare
- È possibile lisare le cellule mediante sonicazione? Sì, la sonicazione lisa efficacemente le cellule utilizzando onde ultrasoniche ad alta frequenza che inducono cavitazione, un fenomeno in cui minuscole bolle di vapore si formano e collassano violentemente all’interno della sospensione cellulare. Le forze meccaniche risultanti disgregano le membrane cellulari e facilitano il rilascio dei componenti intracellulari nel liquido.
- Come si utilizza un sonicatore per la lisi cellulare? L’utilizzo di un sonicatore per la lisi cellulare prevede l’immersione della sonda del sonicatore in una sospensione cellulare e la regolazione di parametri quali l’ampiezza e la durata degli impulsi. Il processo deve essere monitorato attentamente per ottimizzare la disgregazione cellulare riducendo al minimo la denaturazione delle proteine e l’inattivazione degli enzimi.
- Qual è il principio della sonicazione per la lisi cellulare? La sonicazione si basa sul principio della cavitazione acustica. L’energia ultrasonica viene trasmessa nel mezzo liquido, causando rapide fluttuazioni di pressione che portano alla formazione e all’implosione di microbolle. Queste implosioni generano intense forze di taglio ed elevate temperature localizzate, disgregando le strutture cellulari e migliorando l’omogeneità del lisato.
- Quanto tempo richiede la sonicazione per la lisi cellulare? La durata della sonicazione per la lisi cellulare può variare significativamente a seconda di fattori quali il tipo cellulare, la densità cellulare, la potenza del sonicatore e il protocollo specifico utilizzato. Le procedure tipiche possono durare da alcuni secondi a pochi minuti e vengono spesso eseguite in cicli per gestire la produzione di calore e garantire una disgregazione cellulare uniforme.
- Qual è lo scopo della sonicazione nell’estrazione delle proteine? Nell’estrazione delle proteine, la sonicazione serve a rompere efficacemente le membrane cellulari e a solubilizzare le proteine. Questo metodo è particolarmente utile per rilasciare le proteine dai compartimenti cellulari, rendendolo essenziale per preparare lisati dai quali le proteine devono essere purificate o analizzate.
- Perché si utilizza la sonicazione per l’estrazione? La sonicazione è preferita per l’estrazione grazie alla sua azione rapida e alla capacità di applicare energia in modo mirato, disgregando le strutture cellulari per rilasciare molecole bioattive senza l’uso di trattamenti chimici aggressivi e preservando così l’integrità funzionale dei composti estratti.
- La sonicazione altera le interazioni proteina-proteina? Sebbene la sonicazione possa disgregare efficacemente le membrane cellulari, può anche alterare le interazioni proteina-proteina. Il grado di alterazione dipende dall’intensità della sonicazione e dalla durata dell’esposizione e può portare alla denaturazione o alla dissociazione dei complessi proteici, con possibili effetti sui successivi studi analitici o funzionali.
- È possibile utilizzare la sonicazione per lisare E. coli? I sonicatori Hielscher sono particolarmente efficaci per lisare cellule batteriche quali E. coli, che presentano pareti cellulari robuste. La tecnica offre un metodo fisico per rompere la parete e la membrana cellulare mediante forze di taglio, rendendola un metodo preferito per preparare lisati batterici nei laboratori di biologia molecolare e biochimica.
- Quali processi seguono la fase di sonicazione?
Le fasi successive alla lisi a ultrasuoni comprendono generalmente il frazionamento del lisato, l’isolamento mirato degli organelli e un’ulteriore estrazione o purificazione delle proteine.
Il lisato trattato viene quindi separato e preparato per applicazioni analitiche o funzionali, quali proteomica ad alta risoluzione, trascrittomica o studi di legame ai recettori.
Letteratura/Riferimenti bibliografici
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.