Disaggregazione cellulare a ultrasuoni di campioni batterici
I campioni batterici raramente si presentano come vere sospensioni di cellule singole. Le colture crescono in catene e flocculi, gli isolati ambientali formano aggregati legati da sostanze polimeriche extracellulari e i pellet centrifugati spesso resistono alla risospensione nonostante un’accurata agitazione su vortex. La conta delle cellule vitali, la densità ottica, la citometria a flusso e la profilazione del microbioma presuppongono tutte che una particella corrisponda a una cellula. La disaggregazione cellulare a ultrasuoni risolve questa discrepanza: brevi impulsi di sonicazione controllata separano gli aggregati in cellule singole senza provocarne la lisi.
Perché l’aggregazione cellulare compromette i risultati
L’aggregazione è una caratteristica biologica, non un errore di preparazione. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces e molte specie ambientali crescono in catene, ammassi o frammenti di biofilm, mentre il DNA extracellulare e i polisaccaridi tengono unite le cellule nei pellet e negli eluati dei tamponi. Le conseguenze analitiche sono sistematiche:
- La conta delle colonie viene sottostimata, perché un ammasso produce una sola colonia indipendentemente dal numero di cellule che contiene.
- La densità ottica e i contatori di particelle rilevano aggregati anziché cellule, alterando le curve di crescita.
- La citometria a flusso e la separazione cellulare conteggiano erroneamente gli eventi costituiti da ammassi e li escludono dall’analisi.
- Le estrazioni di DNA e proteine rappresentano soltanto le cellule sulla superficie dell’aggregato, distorcendo i dati sul microbioma e i dati omici.
I rimedi convenzionali sono lenti, incompleti oppure inducono alterazioni chimiche. Il pipettaggio energico e l’agitazione su vortex lasciano microaggregati residui. La dispersione enzimatica o mediante chelanti modifica la superficie cellulare che si potrebbe voler analizzare. La disaggregazione meccanica mediante cavitazione controllata agisce in pochi secondi e non richiede additivi.
Un aggregato equivale a una colonia – e a un risultato errato. Scoprite come la disaggregazione a ultrasuoni produce vere sospensioni di cellule singole senza lisi, aerosol o manipolazione della sonda. Richiedete maggiori informazioni!
Sonicatore multiprovetta VialTweeter per la preparazione dei campioni senza contatto: disaggregate gli ammassi cellulari in provette sigillate
Come la sonicazione disaggrega le cellule senza provocarne la lisi
La disaggregazione cellulare a ultrasuoni sfrutta una differenza nella resistenza meccanica. Gli aggregati batterici sono tenuti insieme da legami intercellulari relativamente deboli e da una matrice extracellulare, mentre un involucro cellulare intatto resiste a sollecitazioni di taglio nettamente superiori. Quando gli ultrasuoni calibrati entrano nella sospensione, la cavitazione acustica genera microflussi, impulsi di pressione e forze di taglio che agiscono dapprima sulle interfacce degli aggregati. Ammassi, catene e frammenti di biofilm vengono separati dalle forze di taglio (deagglomerazione) prima che venga raggiunto il livello di energia al quale le membrane si rompono (lisi).
Disaggregazione a ultrasuoni degli ammassi di cellule batteriche
Disaggregazione o lisi – Il ruolo dei parametri di sonicazione
La conseguenza pratica è che disaggregazione e lisi si ottengono con lo stesso strumento utilizzato con parametri diversi. Con un’ampiezza moderata, brevi cicli pulsati e una temperatura controllata si ottiene una sospensione di cellule singole vitali. Aumentare l’ampiezza, il tempo di esposizione o la temperatura del campione sposta il processo verso la disgregazione cellulare completa per accedere ai bersagli intracellulari. I generatori Hielscher consentono di impostare con precisione ampiezza, potenza, impulsi e apporto energetico e di salvare il metodo, rendendo la fase di disaggregazione riproducibile tra campioni, operatori e sessioni di trattamento.
Sonicazione efficiente senza contatto
La sonicazione in bagno non può offrire questo livello di controllo. I bagni e le vasche di pulizia a ultrasuoni forniscono soltanto una bassa energia ultrasonica, che comporta una preparazione incompleta, e la cavitazione si manifesta in modo non uniforme, per cui ciascuna provetta viene trattata in funzione della sua posizione nel bagno. Il VialTweeter trasmette forze ultrasoniche intense e focalizzate direttamente attraverso la parete del recipiente a un massimo di 10 campioni sigillati contemporaneamente. I trattamenti che in un bagno richiedono un’esposizione lunga e variabile vengono completati con una sequenza di impulsi standardizzata.
I sonicatori Hielscher senza contatto applicano ultrasuoni intensi e focalizzati attraverso le pareti delle fiale chiuse. Il VialTweeter tratta fino a 10 fiale contemporaneamente con intensità identica, senza sonda nel campione, senza contaminazione incrociata e senza rilascio di aerosol. Quando la capacità di trattamento richiesta lo impone, i sonicatori per micropiastre UIP400MTP e UIP550MTP estendono lo stesso trasferimento controllato di energia alle piastre multipozzetto.
Il VialTweeter sottopone a sonicazione fino a 10 fiale più piccole e fino a 5 provette più grandi contemporaneamente.
Vantaggi della disaggregazione a ultrasuoni senza contatto
- Nessuna contaminazione incrociata: Poiché le fiale rimangono sempre chiuse e nessuna sonda viene immersa nel campione, la contaminazione incrociata e la perdita di campione vengono completamente evitate. Non vi è nulla da sterilizzare tra un campione e l’altro e una sessione di trattamento non può influire sulla successiva.
- Protezione dagli aerosol: La sonicazione con sonda in un recipiente aperto genera aerosol infettivi e contamina le superfici dello strumento. La sonicazione in fiale sigillate mantiene il campione all’interno della propria provetta, un aspetto rilevante quando si manipolano batteri patogeni quali Mycobacterium tuberculosis e altri agenti BSL-2 o BSL-3.
- Nessuna erosione della punta: Durante il funzionamento, le sonde in titanio possono rilasciare una piccola quantità di microparticelle nel campione. Queste particelle alterano la densità ottica e le conte delle particelle nelle fasi successive. La sonicazione indiretta attraverso la parete del recipiente elimina completamente questa fonte di solidi.
- Trattamento uniforme dei campioni: Il VialTweeter eroga la stessa intensità ultrasonica a ciascuna delle fiale, fino a un massimo di 10, rendendo i risultati della sonicazione uniformi e riproducibili. Gli effetti della posizione che affliggono i bagni e il trattamento con sonda di singoli campioni scompaiono e i valori di riferimento rimangono confrontabili tra le repliche.
- Integrità del campione: le provette rimangono chiuse durante l’intero trattamento, impedendo che il campione venga contaminato, si deteriori o si volatilizzi. Anche i piccoli volumi possono essere trattati senza diluizione, compresi i preziosi pellet clinici che non possono subire un’ulteriore fase di trasferimento.
- Controllo del processo: L’ampiezza è regolabile dal 20 al 100%, la modalità pulsata dallo 0 al 100% e i sistemi supportano il monitoraggio della temperatura, affinché ceppi e proteine termosensibili rimangano al di sotto delle soglie che potrebbero danneggiarli.
Applicazioni tipiche
- Analisi del microbioma e del contenuto intestinale: dispersione di Lactobacillus, Bifidobacterium e campioni fecali prima della semina su piastra o del sequenziamento, affinché gli ammassi non riducano le conte.
- Microbiologia degli alimenti e delle acque: disaggregazione dei flocculi in tamponi, liquidi di risciacquo e brodi di arricchimento per una determinazione accurata delle colonie e della vitalità.
- Ricerca sui biofilm: recupero di cellule da supporti e superfici sotto forma di sospensioni di cellule singole, senza un trattamento enzimatico che rimuoverebbe le proteine di superficie.
- Diagnostica clinica: risospensione di espettorato, pus ed eluati dei tamponi in condizioni di contenimento.
- Coltura cellulare: separazione degli aggregati di cellule di mammifero, di insetto e CHO prima della conta e dei passaggi di coltura.
- Preparazione per l’intero flusso di lavoro: lo stesso strumento che disaggrega a bassa ampiezza esegue una disgregazione cellulare completa con impostazioni più elevate, consentendo di procedere con la lisi, l’estrazione delle proteine e la frammentazione del DNA senza trasferimenti tra provette.
Sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP per la deagglomerazione degli ammassi cellulari con elevata capacità di trattamento dei campioni
Oltre alle piastre multipozzetto, i modelli di sonicatori per micropiastre UIP400MTP e UIP550MTP trattano anche i portaprovette.
Trovate il sonicatore adatto al vostro flusso di lavoro di disaggregazione
Sonicatore multiprovetta VialTweeter
Il metodo d’elezione per la disaggregazione sterile in fiale sigillate. Azionato dal processore UP200St da 200 watt a 26 kHz con sintonizzazione automatica, il VialTweeter trasmette gli ultrasuoni indirettamente attraverso le pareti di un massimo di 10 fiale chiuse contemporaneamente, fino a 10 W per provetta, per risultati uniformi e riproducibili senza contaminazione incrociata e senza perdita di campione. Il sonotrodo VialTweeter in titanio è autoclavabile e le impostazioni di ampiezza e impulso sono regolabili e memorizzabili, offrendo l’intervallo di controllo necessario per un protocollo di deagglomerazione. Il sonotrodo standard a 10 posizioni accoglie fiale per autocampionatore, provette per microcentrifuga e provette Eppendorf o Nunc da 1 a 5 mL. Il dispositivo di serraggio VialPress consente di trattare fino a 5 recipienti più grandi con diametro fino a 20 mm.
Sono disponibili modelli VialTweeter dedicati a singola provetta per provette Falcon e per fiale singole, personalizzati in base alle dimensioni del recipiente. Smontando il sonotrodo a blocco, l’unità centrale UP200St funziona come un sonicatore a sonda convenzionale per il trattamento diretto di campioni di piccole e medie dimensioni.
Sonicatori per micropiastre
Passaggio alla preparazione con elevata capacità di trattamento dei campioni mediante sonicazione di piastre multipozzetto: per i flussi di lavoro basati su piastre, i sonicatori per micropiastre UIP400MTP e UIP550MTP estendono la sonicazione uniforme senza contatto da dieci provette a un’intera piastra.
L’UIP400MTP da 400 watt tratta piastre di microtitolazione e multipozzetto standard, compresi i formati a 96 pozzetti, con controllo preciso di ampiezza, potenza e impulsi, oltre a timer, sonda di temperatura e raffreddamento mediante bagno d’acqua. Il distacco dei biofilm e il trattamento delle colture batteriche sono applicazioni consolidate del sonicatore per micropiastre UIP400MTP.
L’UIP550MTP da 550 watt è l’opzione più potente – ideale per applicazioni più impegnative.
Entrambi i sistemi di sonicazione senza contatto trattano in modo affidabile piastre a 6, 12, 24, 48, 96 e 384 pozzetti, nonché portaprovette e piastre di Petri. I sonicatori per micropiastre Hielscher funzionano con qualsiasi piastra standard, evitando costosi materiali di consumo proprietari. Grazie ai limiti di temperatura programmabili, la sonicazione si interrompe automaticamente al raggiungimento della temperatura massima del campione e riprende dopo il raffreddamento, preservando la vitalità durante i cicli ripetuti. Preparazione intelligente e affidabile con elevata capacità di trattamento dei campioni per risultati ripetibili.
La tabella seguente offre una panoramica della capacità di trattamento approssimativa dei nostri sonicatori per campioni di laboratorio utilizzati nelle scienze della vita, nella genomica, nella proteomica e nella diagnostica:
| Dispositivi consigliati | Volume per lotto | Portata |
|---|---|---|
| Sonicatore multiprovetta VialTweeter | fiale da 0,5 a 1,5mL | n.a. |
| Sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP (440 watt) | piastre multipozzetto / di microtitolazione | n.a. |
| Sonicatore per piastre multipozzetto UIP550MTP (550 watt) | piastre multipozzetto / di microtitolazione | n.a. |
| CupHorn a ultrasuoni | CupHorn per fiale o becher | n.a. |
| Sonicatore a sonda UP100H da 100 watt | da 1 a 500mL | da 10 a 200mL/min |
| UP200Ht, UP200St modelli di sonicatori a sonda da 200 watt | da 10 a 1000mL | da 20 a 200mL/min |
| Sonicatore a sonda UP400St da 400 watt | da 10 a 2000mL | da 20 a 400mL/min |
| GDmini2 | microreattore a flusso sterile a ultrasuoni | n.a. |
| Setacciatore a ultrasuoni | n.a. | n.a. |
Domande frequenti sulla disaggregazione cellulare a ultrasuoni
Qual è la differenza tra disaggregazione cellulare e lisi cellulare?
La disaggregazione, detta anche deagglomerazione, separa le cellule riunite in ammassi formando una sospensione di cellule singole, mentre le cellule rimangono intatte e vitali. La lisi rompe l’involucro cellulare e rilascia il contenuto intracellulare. Entrambe sono indotte dalle forze di taglio generate dalla cavitazione e la differenza risiede nell’apporto energetico. Con impostazioni ottimizzate di ampiezza, impulso e temperatura, la sonicazione consente di ottenere la disaggregazione al di sotto della soglia di lisi.
Perché i bagni a ultrasuoni non sono adatti alla disaggregazione standardizzata?
I bagni forniscono soltanto una bassa energia ultrasonica, che comporta una preparazione incompleta, e la cavitazione si sviluppa in modo molto disomogeneo nella vasca, per cui ciascun campione riceve un trattamento diverso a seconda della sua posizione. Le conte microbiologiche e gli studi comparativi dipendono dalla confrontabilità. I sonicatori senza contatto, come il sonicatore multiprovetta VialTweeter e i modelli di sonicatori per micropiastre UIP400MTP e UIP550MTP, trattano tutti i recipienti in condizioni ultrasoniche regolate, migliorando la riproducibilità tra le repliche.
La sonicazione può danneggiare le cellule?
Sì, se i parametri non sono controllati. Una sonicazione eccessiva o un riscaldamento incontrollato possono danneggiare le cellule e il DNA rilasciato rende i campioni viscosi e favorisce la riaggregazione. Per questo il processo deve essere sviluppato con attenzione: ampiezza moderata, cicli pulsati, raffreddamento e strumenti con limitazione della temperatura mantengono il trattamento nella regione della curva corrispondente alla disaggregazione.
Tutti i sonicatori digitali Hielscher offrono parametri controllabili con precisione, sensori di temperatura collegabili, impostazioni programmabili e registrazione automatizzata dei dati per una preparazione affidabile dei campioni.
Il campione deve essere trasferito in un altro recipiente?
No. Fiale e piastre vengono trattate nei loro contenitori originali chiusi. La sonicazione indiretta evita sia le perdite dovute al trasferimento sia il trascinamento di materiale associato alla manipolazione della sonda.
Quali formati di fiale può trattare il VialTweeter?
Il sonotrodo standard a 10 posizioni accoglie fiale per autocampionatore, provette per microcentrifuga e provette Eppendorf o Nunc da 1 a 5 mL. L’accessorio VialPress accoglie fino a 5 recipienti più grandi con diametro fino a 20 mm. Sono disponibili modelli VialTweeter dedicati a singola provetta per provette Falcon e per formati personalizzati a fiala singola o di dimensioni maggiori.
Posso eseguire disaggregazione e lisi con un unico strumento?
Sì. La stessa configurazione che disaggrega a un’ampiezza moderata esegue una disgregazione cellulare completa con un’ampiezza superiore e un’esposizione più lunga, consentendo di ottenere la sospensione di cellule singole e di eseguire l’estrazione successiva in sequenza senza cambiare piattaforma.
La sonicazione viene utilizzata nei saggi MBEC?
La sonicazione è una componente consolidata e ampiamente standardizzata. Nel saggio MBEC con coperchio a pioli, dopo la crescita dei biofilm sui pioli di polistirene e l’esposizione all’antibiotico, i pioli vengono trasferiti in terreno fresco e sottoposti ad agitazione su vortex e sonicazione per distaccare e disaggregare le cellule aderenti del biofilm in una sospensione planctonica prima della diluizione seriale e della conta delle cellule vitali (la MBEC viene determinata come la concentrazione più bassa che riduce le conte delle cellule recuperate di ≥3 log10 rispetto al biofilm non trattato). La sonicazione migliora significativamente la qualità della dispersione: il rilascio incompleto delle cellule inglobate nella matrice EPS porta a sottostimare l’eradicazione e a sovrastimare i valori di MBEC. La sonicazione mirata dei pozzetti che accolgono i pioli nelle piastre del saggio mediante il sonicatore per micropiastre UIP400MTP supera i tradizionali punti deboli della sonicazione in bagno – ossia la distribuzione non uniforme dell’energia, il riscaldamento e il rischio di aerosol e contaminazione incrociata.
Scoprite come il sonicatore per micropiastre senza contatto UIP400MTP facilita i saggi MBEC!
La sonicazione viene utilizzata nei saggi MIC?
La sonicazione viene applicata in diversi flussi di lavoro correlati ai saggi MIC per migliorare l’efficienza e la riproducibilità:
- micobatteriologia, dove l’espettorato e altri campioni viscosi vengono abitualmente decontaminati e omogeneizzati, talvolta mediante sonicazione, prima dei test di sensibilità, e gli inoculi di micobatteri che formano ammassi beneficiano di una breve dispersione per ottenere MIC accurate;
- organismi inclini all’aggregazione (ad esempio streptococchi, stafilococchi nei pellet), nei quali i microaggregati alterano la densità dell’inoculo; e
- diagnostica combinata, come la coltura del liquido di sonicazione degli impianti seguita dai test di sensibilità nelle infezioni delle protesi articolari (un’applicazione simile alla MBEC, non alla MIC classica).
Letteratura / Riferimenti
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Scegliete la vostra piastra! Il sonicatore per micropiastre UIP550MTP disaggrega i campioni batterici in qualsiasi piastra multipozzetto standard.
Modelli di sonicatori multicampione Hielscher UIP400MTP per micropiastre, VialTweeter e CupHorn: preparazione rapida dei campioni con elevata capacità di trattamento