Disaggregazione cellulare mediante ultrasuoni di campioni batterici

I campioni batterici raramente si presentano come vere e proprie sospensioni monocellulari. Le colture crescono in catene e fiocchi, gli isolati ambientali formano aggregati legati da sostanze polimeriche extracellulari e i pellet centrifugati spesso resistono alla risospensione nonostante un’accurata agitazione con il vortex. La conta delle cellule vitali, la densità ottica, la citometria a flusso e la profilazione del microbioma presuppongono tutte che una particella equivalga a una cellula. La disaggregazione cellulare ad ultrasuoni risolve tale conflitto: brevi impulsi controllati di sonicazione separano gli aggregati in singole cellule senza lisarle.

Perché l'aggregazione cellulare compromette i risultati

L'aggregazione è una caratteristica biologica, non un errore di preparazione. Lo stafilococco, lo streptococco, il lattobacillo, l'actinomicete e molte specie ambientali crescono in catene, grappoli o frammenti di biofilm, e il DNA extracellulare e i polisaccaridi legano le cellule tra loro nei pellet e negli eluati dei tamponi. Le conseguenze analitiche sono sistematiche:

• Il numero delle colonie viene sottostimato, poiché ogni agglomerato produce una sola colonia, indipendentemente dal numero di cellule che contiene.
• La densità ottica e i contatori di particelle rilevano gli aggregati anziché le cellule, distorcendo le curve di crescita.
• La citometria a flusso e la selezione cellulare contano erroneamente gli eventi aggregati ed escludono questi ultimi dall’analisi.
• Le estrazioni di DNA e proteine riguardano solo le cellule presenti sulla superficie dell’aggregato, alterando i dati relativi al microbioma e alle discipline omiche.

I metodi convenzionali sono lenti, incompleti o comportano alterazioni chimiche. L’agitazione vigorosa con pipetta e vortex lascia residui sotto forma di microaggregati. La dispersione enzimatica o basata su chelanti modifica la superficie cellulare che si intende analizzare. La disaggregazione meccanica mediante cavitazione controllata agisce in pochi secondi e non richiede l’uso di additivi.

In che modo la sonicazione disgrega le cellule senza lisarle

La disaggregazione cellulare ad ultrasuoni sfrutta una differenza nella resistenza meccanica. Gli aggregati batterici sono tenuti insieme da legami intercellulari relativamente deboli e da una matrice extracellulare, mentre l’involucro cellulare intatto resiste a forze di taglio notevolmente superiori. Quando gli ultrasuoni calibrati penetrano nella sospensione, la cavitazione acustica genera microcorrenti, impulsi di pressione e forze di taglio che agiscono innanzitutto sulle interfacce degli aggregati. Agglomerati, catene e frammenti di biofilm vengono separati per taglio (disaggregazione) prima che venga raggiunto il livello di energia necessario alla rottura delle membrane (lisi).

Disaggregazione ad ultrasuoni di aggregati di cellule batteriche

Disaggregazione o lisi – L'importanza dei parametri di sonicazione

La conseguenza pratica è che la disaggregazione e la lisi sono lo stesso processo eseguito con parametri diversi. A un’ampiezza moderata, con cicli pulsati brevi e a temperatura controllata, si ottiene una sospensione di cellule singole vitali. Aumentando l’ampiezza, il tempo di esposizione o la temperatura del campione, il processo si sposta verso la disgregazione completa delle cellule per il trattamento di bersagli intracellulari. I generatori Hielscher consentono di impostare con precisione l’ampiezza, la potenza, l’impulso e l’apporto energetico e di salvare il metodo, in modo che la fase di disaggregazione sia riproducibile tra campioni, operatori e cicli di lavorazione.

Sonificazione efficiente senza contatto

La sonicazione in vasca non può eguagliare questo livello di controllo. Le vasche e i serbatoi di pulizia a ultrasuoni forniscono solo una bassa energia ultrasonica, il che comporta una preparazione incompleta, e la cavitazione si verifica in modo non uniforme, per cui ogni provetta viene trattata in base alla sua posizione nella vasca. Il VialTweeter trasmette forze ultrasoniche intense e concentrate direttamente attraverso la parete del recipiente fino a 10 campioni sigillati contemporaneamente. I trattamenti che richiedono un’esposizione prolungata e variabile in un bagno vengono completati con uno schema di impulsi standardizzato.
I sonicatori senza contatto Hielscher applicano ultrasuoni intensi e focalizzati attraverso le pareti delle fiale chiuse. Il VialTweeter tratta fino a 10 fiale contemporaneamente con la stessa intensità, senza sonda nel campione, senza contaminazione incrociata e senza rilascio di aerosol. Laddove la produttività lo richiede, i sonicatori per micropiastre UIP400MTP e UIP550MTP estendono lo stesso trasferimento controllato di energia alle piastre multipozzo.

Vantaggi della disaggregazione ultrasonica senza contatto

• Assenza totale di contaminazione incrociata: Poiché le fiale rimangono chiuse in modo permanente e nessuna sonda viene immersa nel campione, si evitano completamente la contaminazione incrociata e la perdita di campione. Non c'è nulla da sterilizzare tra un campione e l'altro, e un ciclo di analisi non può influire su quello successivo.
• Protezione dagli aerosol: La sonicazione a sonda aperta genera aerosol infettivi e contamina le superfici degli strumenti. La sonicazione in fiala sigillata confina il campione all’interno della fiala stessa, aspetto importante quando si maneggiano batteri patogeni come il Mycobacterium tuberculosis e altri agenti classificati BSL-2 o BSL-3.
• Nessuna riduzione della mancia: Durante il funzionamento, le sonde in titanio possono rilasciare una piccola quantità di microparticelle nel campione. Tali particelle alterano la densità ottica e il conteggio delle particelle a valle. La sonicazione indiretta attraverso la parete del recipiente elimina completamente questa fonte di solidi.
• Portata uniforme: Il VialTweeter eroga la stessa intensità ultrasonica a ciascuna delle 10 fiale, garantendo risultati di sonicazione uniformi e riproducibili. Gli effetti legati alla posizione, che spesso compromettono l’utilizzo dei bagni ultrasonici e la sonda a campione singolo, vengono eliminati e le linee di base rimangono comparabili tra le diverse repliche.
• Integrità del campione: le provette rimangono chiuse durante l’intero processo, quindi il campione non può essere contaminato, alterato o volatilizzato. È possibile lavorare con piccoli volumi senza diluizione, compresi i preziosi pellet clinici che non possono subire un’ulteriore fase di trasferimento.
• Controllo dei processi: L'ampiezza è regolabile dal 20 al 100%, la modalità a impulsi dallo 0 al 100% e i sistemi supportano il monitoraggio della temperatura, in modo che i ceppi e le proteine termosensibili rimangano al di sotto delle soglie dannose.

Applicazioni tipiche

• Analisi del microbioma e del contenuto intestinale: dispersione dei Lactobacillus, dei Bifidobacterium e dei campioni fecali prima della semina o del sequenziamento, in modo che il conteggio non risulti ridotto a causa della formazione di aggregati.
• Microbiologia degli alimenti e dell'acqua: disgregazione dei flocculi in tamponi, risciacqui e brodi di arricchimento per una determinazione accurata delle colonie e della vitalità.
• Ricerca sui biofilm: recupero delle cellule da supporti e superfici sotto forma di sospensioni di cellule singole, senza ricorrere a trattamenti enzimatici che potrebbero rimuovere le proteine superficiali.
• Diagnostica clinica: risospensione di espettorato, pus ed eluati da tamponi in condizioni di contenimento.
• Coltura cellulare: separazione degli aggregati di cellule di mammiferi, insetti e CHO prima del conteggio e del passaggio.
• Preparazione dell’intero flusso di lavoro: lo stesso strumento che disgrega a bassa ampiezza esegue la disgregazione completa delle cellule a impostazioni più elevate, consentendo così di procedere alla lisi, all’estrazione delle proteine e alla frammentazione del DNA senza necessità di trasferimenti tra provette.

Letteratura / Riferimenti