Protocollo di analisi della concentrazione minima inibitoria (MIC)
Il saggio della concentrazione minima inibitoria (MIC) basata sul biofilm è un metodo essenziale per valutare l'efficacia degli agenti antimicrobici contro i microrganismi associati al biofilm, che presentano una maggiore resistenza grazie alla loro matrice extracellulare protettiva. Una fase cruciale di questo test è la rottura delle strutture del biofilm per liberare le cellule incorporate per un'accurata valutazione della vitalità. Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP facilita questo processo impiegando ultrasuoni focalizzati per generare una cavitazione controllata, staccando efficacemente le cellule del biofilm e disperdendole in una sospensione uniforme. Questo distacco preciso e riproducibile del biofilm migliora l'affidabilità e la produttività dei test MIC, rendendo l'UIP400MTP uno strumento essenziale per il progresso della ricerca sul biofilm.
Sonicazione per il distacco del biofilm
Il saggio MIC basato su biofilm misura tipicamente la vitalità batterica o l'inibizione della crescita utilizzando metodi come la piastratura, la conta delle colonie o la misurazione della densità ottica. La sonicazione è una fase critica dei test MIC basati sul biofilm quando si valuta la suscettibilità antimicrobica dei microrganismi associati al biofilm. La sua funzione principale è quella di staccare e disperdere le cellule incorporate nella matrice del biofilm in una sospensione uniforme per un'analisi accurata.
I biofilm sono significativamente più resistenti agli agenti antimicrobici rispetto alle cellule planctoniche, rendendo il distacco corretto fondamentale per un'analisi accurata. Durante questo processo, le onde ultrasoniche generano una cavitazione controllata, rompendo la matrice del biofilm e rilasciando le cellule incorporate in una sospensione uniforme nel mezzo di recupero. Questa fase consente di valutare con precisione la vitalità delle cellule disperse nel biofilm attraverso metodi quali la piastratura, la diluizione e la conta delle colonie. L'adeguata disgregazione del biofilm mediante sonicazione impedisce ai componenti residui della matrice di schermare le cellule, il che potrebbe altrimenti portare a una sottostima dell'attività antimicrobica. Il sonicatore per piastre a pozzetti multipli UIP400MTP è particolarmente adatto a questo scopo, in quanto offre condizioni di sonicazione precise e riproducibili per garantire una preparazione affidabile e ad alta produttività delle piastre di saggio.
Sonicatore per micropiastre UIP400MTP per un distacco del biofilm controllabile con precisione nei saggi MIC e MBEC.
Perché la sonicazione è necessaria nei saggi di concentrazione minima inibitoria basati su biofilm
Per le misure di vitalità e il conteggio delle cellule, è necessario un distacco e una dispersione completi e affidabili delle singole cellule. L'UIP400MTP favorisce un distacco uniforme e non dannoso del biofilm e la dispersione delle cellule per ottenere risultati affidabili.
- Complessità del biofilm: I biofilm sono comunità microbiche strutturate racchiuse in una matrice polimerica extracellulare (EPS), che protegge i microrganismi e li rende più resistenti agli agenti antimicrobici.
- Dispersione uniforme: Per misurare con precisione la vitalità delle cellule incorporate nel biofilm o la loro suscettibilità agli antimicrobici, il biofilm deve prima essere staccato e scomposto in una sospensione omogenea.
Protocollo di saggio della concentrazione minima inibitoria basato sul biofilm
La concentrazione minima inibitoria (MIC) determina la concentrazione minima di un agente antimicrobico necessaria per inibire la crescita visibile dei microrganismi. Questo protocollo è stato progettato per i microrganismi associati a biofilm, utilizzando il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP per la disgregazione del biofilm.
Fase 1: Preparazione dell'inoculo batterico
- Preparare la sospensione batterica:
Far crescere i batteri in terreni appropriati fino alla fase medio-logaritmica.
Diluire la coltura per ottenere una densità cellulare standardizzata (ad esempio, 0,5 McFarland standard o OD600 ~0,1). - Preparare soluzioni antimicrobiche:
Diluire l'agente antimicrobico in un mezzo adeguato per creare una gamma di concentrazioni (ad esempio, diluizioni seriali di due volte). - Dispensare nella piastra da 96 pozzetti:
Aggiungere le soluzioni antimicrobiche nei pozzetti di una piastra standard a 96 pozzetti, con un volume finale del pozzetto di ~150-200 µL.
Includere controlli di crescita (senza antimicrobici) e controlli di sterilità (senza inoculo batterico).
Fase 2: Formazione del biofilm sul coperchio del piolo
- Fissare il coperchio del piolo:
Posizionare il coperchio del piolo specializzato sui pozzetti inoculati, assicurandosi che i pioli siano completamente immersi nella sospensione batterica. - Incubare la piastra:
Incubare alla temperatura appropriata (ad esempio, 37°C) per una durata specifica (ad esempio, 24 ore) in condizioni statiche per consentire la formazione di biofilm sui chiodini. - Sciacquare i pioli:
Rimuovere il coperchio dalla sospensione batterica e risciacquare delicatamente con soluzione fisiologica sterile o PBS per rimuovere le cellule planctoniche non fissate. - Esposizione agli antimicrobici:
Trasferire il coperchio del piolo in una nuova piastra a 96 pozzetti contenente le diluizioni antimicrobiche preparate in precedenza.
Incubare per un periodo definito (ad esempio, 24 ore) in condizioni statiche per consentire all'agente antimicrobico di agire sui biofilm.
Fase 3: esposizione agli antimicrobici
Sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP per la preparazione di campioni ad alta produttività
Fase 4: sonicazione con il Sonicator per micropiastre UIP400MTP
La fase di sonicazione è fondamentale per staccare i biofilm dai coperchi dei pioli e valutare la vitalità. Seguire questi passaggi per il sonicatore UIP400MTP:
- Preparare la configurazione:
Riempire una nuova piastra da 96 pozzetti con terreno di recupero (ad esempio, brodo neutralizzante o terreno di crescita sterile) in ogni pozzetto. - Trasferire il coperchio del piolo:
Rimuovere il coperchio del piolo dalla piastra per il trattamento antimicrobico.
Sciacquare il coperchio del piolo in soluzione fisiologica sterile o PBS per rimuovere gli agenti antimicrobici residui. - Posizionare la piastra nel sonicatore:
Collegare il coperchio del piolo alla piastra del terreno di coltura.
Posizionare la piastra di terreno di recupero nel sonicatore UIP400MTP, assicurandosi che la piastra sia centrata e stabile come descritto nel manuale. - Regolare i parametri di sonicazione:
Impostare i parametri di sonicazione sull'UIP400MTP (le impostazioni possono essere adattate al biofilm):
Ampiezza: 70-100%.
Tempo di sonicazione: 1-3 minuti (regolare in base alla struttura del biofilm) in modalità ciclo. - Sonicato:
Avviare il processo di sonicazione. Le onde ultrasoniche disgregheranno la matrice del biofilm e dislocheranno le cellule nel terreno di recupero. - Monitorare il processo:
Utilizzare il sensore di temperatura collegabile per monitorare la temperatura del campione nei pozzetti. L'UIP400MTP può essere collegato a un refrigeratore da laboratorio per il raffreddamento. - Gestione della post-sonorizzazione:
Trasferire immediatamente il terreno di recupero contenente i biofilm staccati in una nuova piastra sterile per le successive analisi.
(A) Piastra contenente TSB con glucosio al 2% utilizzata per la formazione di biofilm, il recupero delle cellule e la determinazione di MIC e MBEC; (B) Coperchio con spilli per la formazione di biofilm stafilococcici.
Le cellule del biofilm formatesi sui perni sono state rimosse mediante sonicazione (Hielscher Ultrasound Technology) per 5 minuti in piastre da 96 pozzetti contenenti terreno di coltura fresco per il recupero delle cellule.
(Immagine e studio: ©de Oliveira et al., 2016)
Fase 4: Valutazione della redditività
Piastra e coltura di biofilm staccati:
- Eseguire diluizioni seriali del terreno di coltura e applicare su agar per contare le unità formanti colonie (CFU).
- Valutare il MIC:
Determinare la MIC come la più bassa concentrazione antimicrobica che inibisce completamente la crescita microbica visibile nel terreno di recupero.
MIC Concentrazione minima inibitoria: Esempio di piastra di microtitolazione e interpretazione dei risultati della microdiluizione.
(Studio e immagine: ©Jaskiewicz et al. 2019)
Progettazione, produzione e consulenza – Qualità Made in Germany
Gli ultrasuoni Hielscher sono noti per i loro elevati standard di qualità e design. La robustezza e la facilità d'uso consentono un'agevole integrazione dei nostri ultrasonori negli impianti industriali. I sonicatori Hielscher sono in grado di gestire facilmente condizioni difficili e ambienti impegnativi.
Hielscher Ultrasonics è un'azienda certificata ISO e pone particolare enfasi sugli ultrasuonatori ad alte prestazioni, caratterizzati da tecnologia all'avanguardia e facilità d'uso. Naturalmente, gli ultrasuoni Hielscher sono conformi alla normativa CE e soddisfano i requisiti UL, CSA e RoH.
Semplificare la preparazione dei campioni in piastre a 96 pozzetti e piastre di dosaggio utilizzando il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP
Letteratura / Riferimenti
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Domande frequenti
Che cos'è il test MIC?
La concentrazione minima inibitoria (MIC) è un test standardizzato utilizzato per determinare la concentrazione minima di un agente antimicrobico necessaria per inibire la crescita visibile di un microrganismo. Viene comunemente eseguito con metodi di microdiluizione in brodo o di diluizione in agar, in cui i microrganismi sono esposti a diluizioni seriali dell'agente antimicrobico. I test MIC sono fondamentali per valutare l'efficacia antimicrobica, guidare il trattamento clinico e valutare i livelli di resistenza nei microrganismi planctonici e associati a biofilm.
Qual è la differenza tra il saggio della concentrazione minima inibitoria basata sul biofilm e il saggio MBIC?
Il saggio della concentrazione minima inibitoria (MIC) basato sul biofilm e il saggio della concentrazione minima inibitoria del biofilm (MBIC) sono correlati ma distinti per finalità e metodologia.
Il saggio MIC basato sul biofilm valuta la concentrazione più bassa di un agente antimicrobico necessaria per inibire la crescita o la vitalità visibile del biofilm, concentrandosi sulle cellule associate al biofilm piuttosto che sui batteri planctonici. Il saggio MBIC, invece, misura specificamente la capacità di un agente antimicrobico di prevenire la formazione di biofilm, piuttosto che trattare biofilm già formati. Sebbene entrambi i saggi abbiano a che fare con batteri associati a biofilm, il saggio MIC basato sul biofilm si occupa del trattamento, mentre il saggio MBIC enfatizza la prevenzione, rendendoli strumenti complementari per lo studio dell'efficacia antimicrobica contro i biofilm.
Quali biofilm vengono utilizzati nei test MIC?
I biofilm microbici e le cellule planctoniche sono entrambi utilizzati nei saggi di concentrazione minima inibitoria (MIC) per studiare l'efficacia antimicrobica in diverse condizioni.
- Cellule planctoniche:
Le cellule planctoniche sono singole cellule microbiche che galleggiano liberamente e che costituiscono il modello standard per i tradizionali test MIC. I microrganismi più comuni sono Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida albicans. Questi saggi determinano la MIC necessaria per inibire la crescita delle cellule a vita libera e sono fondamentali per lo screening antimicrobico iniziale. - Cellule associate al biofilm:
Le cellule del biofilm sono microrganismi incorporati in una matrice extracellulare, che aumenta significativamente la loro resistenza agli antimicrobici. I test MIC per biofilm spesso includono:- Batteri Gram-negativi: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae, noti per la formazione di biofilm nelle infezioni e negli ambienti industriali.
- Batteri Gram-positivi: Staphylococcus aureus (incluso MRSA), Staphylococcus epidermidis ed Enterococcus faecalis, comunemente implicati in infezioni correlate ai dispositivi.
- Funghi: Candida albicans e specie affini, importanti nelle infezioni fungine da biofilm.
- Biofilm di specie miste: Sono talvolta utilizzati per replicare i biofilm polimicrobici naturali, come quelli presenti nelle ferite croniche o nel biofouling industriale.
Confrontando i valori di MIC per le cellule planctoniche e per quelle associate al biofilm, i ricercatori possono valutare la maggiore resistenza dei biofilm e identificare agenti efficaci contro queste comunità microbiche più resistenti.
Qual è la differenza tra MIC e MBEC?
La concentrazione minima inibitoria (MIC) è la concentrazione più bassa di un agente antimicrobico necessaria per prevenire la formazione del biofilm, mentre la concentrazione minima di eradicazione del biofilm (MBEC) è la concentrazione più bassa necessaria per eradicare un biofilm consolidato. La MIC si concentra sulla prevenzione dei biofilm, mentre la MBEC valuta l'efficacia del trattamento contro i biofilm maturi.
Quali piastre sono comunemente utilizzate per i test MBEC?
Le piastre per microtitolazione comunemente utilizzate per i saggi MBEC sono in genere piastre a 96 pozzetti in polistirene o polipropilene. Questi materiali forniscono una superficie adatta alla formazione del biofilm e sono chimicamente resistenti agli agenti antimicrobici testati durante il saggio. Le piastre di polistirene sono ampiamente preferite per la loro chiarezza ottica, che è vantaggiosa per le analisi a valle, come le misurazioni spettrofotometriche o basate sulla fluorescenza. Il design di queste piastre include coperchi a pioli staccabili, che sono essenziali per il saggio poiché i biofilm si formano sui pioli che sono immersi nei pozzetti contenenti il terreno di coltura. Le piastre standardizzate, come quelle conformi al protocollo di analisi MBEC, sono specificamente progettate per garantire la riproducibilità e la compatibilità con il sonicatore UIP400MTP o altre apparecchiature di elaborazione.
Cosa sono le piastre con coperchio in PEG?
Le piastre con coperchio in PEG sono sistemi specializzati di piastre a più pozzetti in cui il coperchio è dotato di piccoli pioli o perni in polietilenglicole (PEG) che si estendono in ogni pozzetto. Questi pioli forniscono una superficie per la formazione di biofilm microbici in condizioni controllate, imitando la crescita di biofilm nel mondo reale. Il design consente ai biofilm di svilupparsi sui pioli mentre i pozzetti contengono terreni di coltura o agenti antimicrobici, consentendo di eseguire test ad alta produttività sulla suscettibilità dei biofilm ai trattamenti, come nei saggi MBEC, MBIC e MIC.
Qual è il vantaggio della rimozione del biofilm a ultrasuoni rispetto al raschiamento cellulare?
Lo scollamento del biofilm a ultrasuoni offre un vantaggio significativo rispetto al raschiamento delle cellule, in quanto fornisce un metodo non invasivo, uniforme e altamente efficiente per rimuovere i biofilm dalle superfici. A differenza del raschiamento, che può essere incoerente e danneggiare la superficie o le cellule sottostanti, le onde ultrasoniche penetrano nella matrice del biofilm, rompendolo senza compromettere l'integrità delle strutture adiacenti. Questo metodo garantisce la riproducibilità, riduce al minimo il rischio di contaminazione ed è particolarmente efficace per le applicazioni che richiedono una rimozione precisa del biofilm, come negli studi microbiologici o nei test dei dispositivi medici. Per saperne di più su come il Sonicator UIP400MTP eccelle nella raschiatura delle cellule!
Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni da laboratorio a dimensioni industriali.