Protocollo del saggio della concentrazione minima inibente (MIC)

Il saggio della concentrazione minima inibente (MIC) basato sui biofilm è un metodo essenziale per valutare l’efficacia degli agenti antimicrobici contro i microrganismi associati ai biofilm, che mostrano una maggiore resistenza grazie alla loro matrice extracellulare protettiva. Una fase cruciale di questo saggio è il distacco delle strutture del biofilm per liberare le cellule inglobate e valutarne accuratamente la vitalità. Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP facilita questo processo impiegando ultrasuoni focalizzati per generare una cavitazione controllata, staccando efficacemente le cellule del biofilm e disperdendole in una sospensione uniforme. Questa disgregazione precisa e riproducibile del biofilm migliora l’affidabilità e la capacità di trattamento dei campioni dei saggi MIC, rendendo UIP400MTP uno strumento essenziale per il progresso della ricerca sui biofilm.

Perché utilizzare la sonicazione durante i saggi MIC?

• Dati accurati e riproducibili: Ottenete sospensioni cellulari uniformi che eliminano la protezione offerta dalla matrice, assicurando che le conte delle colonie e le letture della densità ottica riflettano effettivamente l’efficacia antimicrobica.
• Efficienza con elevata capacità di trattamento dei campioni: Trattate simultaneamente un’intera piastra a 96 pozzetti in soli 1–3 minuti, sostituendo il raschiamento manuale lento e poco uniforme con un flusso di lavoro semplificato.
• Vitalità cellulare preservata: Staccate delicatamente le cellule inglobate senza i danni fisici causati dal raschiamento, mantenendo tassi di sopravvivenza più elevati per calcoli MIC/MBEC affidabili.
• Rischio nullo di contaminazione crociata: Beneficiate di una configurazione cup-horn senza contatto che tratta tutti i pozzetti in modo uniforme, senza che le sonde tocchino i singoli campioni o pozzetti.
• Conformità agli standard: Allineate la vostra metodologia a protocolli di settore validati come ASTM E2799-22, conferendo ai vostri dati maggiore credibilità ai fini normativi o della pubblicazione.
• Screening affidabile di farmaci e trattamenti: Affidatevi ai vostri risultati di sensibilità per prendere decisioni più consapevoli sull’efficacia antimicrobica, sulla caratterizzazione dei profili di resistenza o sullo sviluppo terapeutico.

Sonicazione per il distacco dei biofilm

Il saggio MIC basato sui biofilm misura generalmente la vitalità batterica o l’inibizione della crescita mediante metodi quali la semina su piastra, la conta delle colonie o le misurazioni della densità ottica. La sonicazione è una fase cruciale nei saggi MIC basati sui biofilm quando si valuta la sensibilità agli antimicrobici dei microrganismi associati ai biofilm. La sua funzione principale è staccare e disperdere le cellule inglobate nella matrice del biofilm in una sospensione uniforme per un’analisi accurata.
I biofilm sono significativamente più resistenti agli agenti antimicrobici rispetto alle cellule planctoniche, il che rende un distacco adeguato fondamentale per un’analisi accurata. Durante questo processo, le onde ultrasoniche generano una cavitazione controllata, disgregando la matrice del biofilm e liberando le cellule inglobate in una sospensione uniforme nel terreno di recupero. Questa fase consente valutazioni precise della vitalità delle cellule disperse dal biofilm mediante metodi quali la semina su piastra, la diluizione e la conta delle colonie. Un’adeguata disgregazione del biofilm mediante sonicazione impedisce ai componenti residui della matrice di proteggere le cellule, evitando una possibile sottostima dell’attività antimicrobica. Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP è particolarmente adatto a questo scopo, offrendo condizioni di sonicazione precise e riproducibili per garantire una preparazione affidabile delle piastre per saggi con elevata capacità di trattamento dei campioni.

Perché la sonicazione è necessaria nei saggi della concentrazione minima inibente basati sui biofilm

Per le misurazioni della vitalità e la conta cellulare sono necessari un distacco e una dispersione completi e affidabili delle singole cellule. UIP400MTP favorisce il distacco uniforme del biofilm e la dispersione cellulare senza causare danni, per risultati dei saggi robusti.

• Complessità dei biofilm: I biofilm sono comunità microbiche strutturate racchiuse in una matrice di sostanze polimeriche extracellulari (EPS), che protegge i microrganismi e li rende più resistenti agli agenti antimicrobici.
• Dispersione uniforme: Per misurare accuratamente la vitalità delle cellule inglobate nel biofilm o la loro sensibilità agli antimicrobici, il biofilm deve prima essere staccato e disgregato in una sospensione omogenea.

Protocollo del saggio della concentrazione minima inibente basato sui biofilm

Il saggio della concentrazione minima inibente (MIC) determina la concentrazione più bassa di un agente antimicrobico necessaria per inibire la crescita visibile dei microrganismi. Questo protocollo è progettato per i microrganismi associati ai biofilm e utilizza il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP per la disgregazione del biofilm.

Fase 1: preparazione dell’inoculo batterico

1. Preparare la sospensione batterica:
   Coltivare i batteri in terreni appropriati fino alla fase logaritmica intermedia.
   Diluire la coltura per ottenere una densità cellulare standardizzata (ad es., standard 0,5 McFarland o OD600 ~0,1).
2. Preparare le soluzioni antimicrobiche:
   Diluire l’agente antimicrobico in un terreno adatto per ottenere una serie di concentrazioni (ad es., diluizioni seriali con fattore due).
3. Distribuire nella piastra a 96 pozzetti:
   Aggiungere le soluzioni antimicrobiche nei pozzetti di una piastra standard a 96 pozzetti, con un volume finale per pozzetto di ~150–200 µL.
   Includere controlli di crescita (senza antimicrobico) e controlli di sterilità (senza inoculo batterico).

Fase 2: formazione del biofilm sul coperchio con perni

• Applicare il coperchio con perni:
  Posizionare il coperchio specifico con perni sui pozzetti inoculati, assicurandosi che i perni siano completamente immersi nella sospensione batterica.
• Incubare la piastra:
  Incubare alla temperatura appropriata (ad es., 37°C) per una durata specificata (ad es., 24 ore) in condizioni statiche per consentire la formazione del biofilm sui perni.

Fase 3: esposizione agli antimicrobici

• Risciacquare i perni:
  Rimuovere il coperchio con perni dalla sospensione batterica e risciacquarlo delicatamente in soluzione salina sterile o PBS per rimuovere le cellule planctoniche debolmente aderenti.
• Esporre agli antimicrobici:
  Trasferire il coperchio con perni in una nuova piastra a 96 pozzetti contenente le diluizioni antimicrobiche preparate in precedenza.
  Incubare per un periodo definito (ad es., 24 ore) in condizioni statiche per consentire all’agente antimicrobico di agire sui biofilm.

Fase 4: sonicazione con il sonicatore per micropiastre UIP400MTP

La fase di sonicazione è cruciale per staccare i biofilm dai coperchi con perni e valutarne la vitalità. Seguire questi passaggi per il sonicatore UIP400MTP:

1. Preparare l’allestimento:
   Riempire ciascun pozzetto di una nuova piastra a 96 pozzetti con terreno di recupero (ad es., brodo neutralizzante o terreno di crescita sterile).
2. Trasferire il coperchio con perni:
   Rimuovere il coperchio con perni dalla piastra di trattamento antimicrobico.
   Risciacquare il coperchio con perni in soluzione salina sterile o PBS per rimuovere gli agenti antimicrobici residui.
3. Posizionare la piastra nel sonicatore:
   Applicare il coperchio con perni alla piastra contenente il terreno di recupero.
   Posizionare la piastra contenente il terreno di recupero nel sonicatore UIP400MTP, assicurandosi che sia centrata e stabile come descritto nel manuale.
4. Regolare i parametri di sonicazione:
   Impostare i parametri di sonicazione su UIP400MTP (le impostazioni possono essere adattate al biofilm):
   Ampiezza: 70–100%.
   Tempo di sonicazione: 1–3 minuti (regolare in base alla struttura del biofilm) in modalità ciclica.
5. Sonicare:
   Avviare il processo di sonicazione. Le onde ultrasoniche disgregheranno la matrice del biofilm e staccheranno le cellule, disperdendole nel terreno di recupero.
6. Monitorare il processo:
   Utilizzare il sensore di temperatura collegabile per monitorare la temperatura dei campioni nei pozzetti. UIP400MTP può essere collegato a un refrigeratore da laboratorio per il raffreddamento.
7. Gestione dopo la sonicazione:
   Trasferire immediatamente il terreno di recupero contenente i biofilm staccati in una nuova piastra sterile per le analisi successive.

(A) Piastra contenente TSB con 2% di glucosio utilizzata per la formazione del biofilm, il recupero cellulare e la determinazione di MIC e MBEC; (B) Coperchio con perni per la formazione di biofilm stafilococcici.
Le cellule del biofilm formatosi sui perni sono state staccate mediante sonicazione (Hielscher Ultrasound Technology) per 5 min in piastre a 96 pozzetti contenenti terreno di coltura fresco per il recupero delle cellule.
(Immagine e studio: ©de Oliveira et al., 2016)

Fase 4: valutazione della vitalità

Seminare su piastra e coltivare i biofilm staccati:

1. Eseguire diluizioni seriali del terreno di recupero e seminare su agar per contare le unità formanti colonia (CFU).
2. Valutare la MIC:
   Determinare la MIC come la concentrazione antimicrobica più bassa che inibisce completamente la crescita microbica visibile nel terreno di recupero.

MIC, concentrazione minima inibente: esempio di piastra per microtitolazione e interpretazione dei risultati della microdiluizione.
(Studio e immagine: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Chi trae vantaggio dalla sonicazione durante i saggi MIC?

• Produttori di dispositivi medici: Per testare l’efficacia dei rivestimenti superficiali e validare i protocolli di pulizia dei dispositivi soggetti alla formazione di biofilm.
• Microbiologi clinici: Per diagnosticare accuratamente le infezioni associate agli impianti (come le PJI) recuperando i batteri dai dispositivi medici.
• Sviluppatori farmaceutici: Per valutare l’efficacia di nuovi agenti antimicrobici contro patogeni resistenti inglobati nei biofilm.
• Ricercatori accademici: Per condurre studi riproducibili, con elevata capacità di trattamento dei campioni, sulla biologia dei biofilm e sui meccanismi di resistenza agli antimicrobici.
• Team di controllo qualità industriale: Per valutare il biofouling e l’efficacia dei disinfettanti in contesti industriali (ad es., utilizzando gli standard ASTM E2799-22).

Progettazione, produzione e consulenza – Qualità Made in Germany

I dispositivi a ultrasuoni Hielscher sono rinomati per i loro elevatissimi standard di qualità e progettazione. La robustezza e la facilità d’uso consentono un’integrazione agevole dei nostri dispositivi a ultrasuoni negli impianti industriali. I sonicatori Hielscher affrontano facilmente condizioni difficili e ambienti impegnativi.

Hielscher Ultrasonics è un’azienda certificata ISO e pone particolare enfasi sui dispositivi a ultrasuoni ad alte prestazioni, caratterizzati da tecnologia all’avanguardia e facilità d’uso. Naturalmente, i dispositivi a ultrasuoni Hielscher sono conformi alla marcatura CE e soddisfano i requisiti UL, CSA e RoHs.

Leggete qui come UIP400MTP viene utilizzato per il distacco dei biofilm nel protocollo ASTM E2799 – Valutazione dell’efficacia dei disinfettanti contro il biofilm di Pseudomonas aeruginosa mediante il saggio MBEC.