Protocollo ASTM E2799-22 per la valutazione degli antimicrobici

Hielscher UIP400MTP è un sonicatore per piastre multipozzetto potente ed efficiente, progettato per semplificare la fase di sonicazione del protocollo ASTM E2799-22. Erogando energia ultrasonica uniforme sull’intera piastra per microtitolazione, UIP400MTP garantisce un distacco uniforme e affidabile dei biofilm dai coperchi con pioli, senza danneggiare le cellule né compromettere l’integrità dei campioni. La sua elevata capacità di trattamento dei campioni e la facilità d’uso riducono significativamente i tempi di trattamento, migliorando al contempo la riproducibilità e rendendolo una soluzione ideale per i laboratori che eseguono saggi di vitalità dei biofilm e test di efficacia degli antimicrobici.

ASTM E2799

ASTM E2799 è un metodo di prova standardizzato progettato per valutare l’efficacia degli agenti antimicrobici contro i biofilm, con particolare attenzione a Pseudomonas aeruginosa. I biofilm sono comunità microbiche complesse che aderiscono alle superfici e presentano una maggiore resistenza ai trattamenti antimicrobici, costituendo una sfida significativa in ambito sanitario, industriale e ambientale. Questo metodo utilizza il saggio della concentrazione minima di eradicazione del biofilm (MBEC) per fornire un quadro affidabile e riproducibile per testare i disinfettanti in condizioni realistiche di biofilm.

In che modo la sonicazione contribuisce al protocollo ASTM E2799?

La sonicazione svolge un ruolo fondamentale nel protocollo ASTM E2799, facilitando il distacco dei biofilm dalle superfici di prova e garantendo una valutazione accurata della vitalità microbica dopo il trattamento. Utilizzando energia ultrasonica controllata, il protocollo ottiene una disgregazione efficiente e uniforme del biofilm senza danneggiare le cellule, consentendo risultati precisi e riproducibili. Ciò rende ASTM E2799 uno strumento essenziale per far progredire la ricerca sui biofilm e sviluppare strategie antimicrobiche efficaci.

Come eseguire il saggio MBEC in conformità alla norma ASTM E2799-22

Il protocollo ASTM E2799-22 descrive le fasi per valutare l’efficacia degli agenti antimicrobici contro i biofilm. Utilizzando il sonicatore per piastre per microtitolazione Hielscher UIP400MTP, il protocollo può essere adattato per integrare questo metodo avanzato di sonicazione per il distacco dei biofilm. Di seguito sono descritte le fasi adattate all’utilizzo del sonicatore per micropiastre UIP400MTP:

1. Preparazione dei biofilm
   Preparare una piastra per microtitolazione sterile a 96 pozzetti con coperchi rimovibili dotati di pioli.
   Inoculare i pozzetti con una sospensione batterica standardizzata in un terreno di crescita adeguato.
   Posizionare il coperchio con pioli sulla piastra, assicurandosi che i pioli siano completamente immersi nella sospensione batterica.
   Incubare la piastra in condizioni controllate (ad esempio, temperatura e tempo) per consentire la formazione del biofilm sui pioli.
2. Trattamento con agenti antimicrobici
   Dopo la formazione del biofilm, sostituire il terreno con terreno fresco contenente gli agenti antimicrobici da testare a diverse concentrazioni.
   Riposizionare il coperchio con pioli e incubare nelle condizioni specificate nel disegno sperimentale.
3. Preparazione per il distacco del biofilm
   Dopo il trattamento, risciacquare il coperchio con pioli immergendolo in una soluzione di risciacquo sterile per rimuovere gli agenti antimicrobici residui e le cellule planctoniche debolmente aderenti.
4. Distacco del biofilm mediante il sonicatore UIP400MTP
   Preparare una nuova piastra per microtitolazione a 96 pozzetti contenente un terreno di recupero (ad esempio, brodo neutralizzante).
   Distaccare i biofilm posizionando il coperchio con pioli nei pozzetti della piastra contenente il terreno di recupero.
   Inserire la piastra nel sonicatore UIP400MTP, assicurandosi che il coperchio e la piastra siano correttamente allineati.
   Impostare il sonicatore a un’ampiezza del 70%–80% e sonicare per 3–4 minuti in modalità ciclica, per garantire un distacco uniforme del biofilm senza lisi cellulare.
5. Valutazione della vitalità del biofilm
   Dopo la sonicazione, trattare il terreno di recupero contenente le cellule del biofilm distaccate utilizzando tecniche microbiologiche o analitiche standard, quali:
   • Conteggio delle unità formanti colonia (CFU): eseguire diluizioni seriali e seminare su agar per contare le cellule vitali.
   • Misurazioni della densità ottica (OD): utilizzare l’analisi spettrofotometrica per valutare la densità cellulare.
   • Saggi di vitalità basati sulla fluorescenza: quantificare le cellule vive e morte utilizzando coloranti fluorescenti.
6. Analisi dei dati
   Confrontare i dati di vitalità dei biofilm trattati e non trattati per determinare l’efficacia degli agenti antimicrobici.
   Calcolare la concentrazione minima di eradicazione del biofilm (MBEC) in base alla concentrazione necessaria per eliminare le cellule vitali del biofilm.
7. Controllo qualità
   Garantire condizioni di sonicazione uniformi calibrando regolarmente UIP400MTP e verificando che il processo di distacco del biofilm non provochi una lisi o una distruzione cellulare significativa.
   Includere controlli appropriati, come biofilm non trattati e bianchi contenenti soltanto il terreno, per validare i risultati.

Le cellule del biofilm formatosi sui pioli sono state distaccate mediante sonicazione (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Germania, UIP250MTP) per 5 min in piastre a 96 pozzetti contenenti terreno di coltura fresco per il recupero delle cellule.
(Immagine e studio: ©de Oliveira et al., 2016)

Integrando UIP400MTP nel flusso di lavoro del protocollo ASTM E2799-22, il processo di distacco del biofilm viene ottimizzato in termini di uniformità, efficienza e applicazioni con elevata capacità di trattamento dei campioni.