Protocollo di analisi MBEC con il Sonicator a 96 pozzetti UIP400MTP

Il saggio MBEC viene utilizzato per determinare la concentrazione di agenti antimicrobici necessaria per eliminare i biofilm formatisi sui coperchi dei pioli. Per valutare la vitalità del biofilm, i biofilm devono prima essere staccati dai coperchi a pioli di una piastra a 96 pozzetti. La sonicazione è il metodo più affidabile ed efficiente per questo distacco. Il sonicatore per piastre a più pozzetti UIP400MTP è stato progettato specificamente per processare le piastre di saggio con la massima efficienza e convenienza, semplificando e accelerando i saggi MBEC ad alta produttività.

Sonicazione per il distacco del biofilm

La sonicazione è un passaggio cruciale nei saggi di concentrazione minima di biofilm (MBEC), in quanto consente di staccare efficacemente le cellule del biofilm dal loro attacco superficiale. I biofilm sono comunità intrinsecamente strutturate di microrganismi racchiusi in una matrice extracellulare, che li rende significativamente più resistenti agli agenti antimicrobici rispetto alle cellule planctoniche. Durante i saggi MBEC, la sonicazione utilizza onde ultrasoniche per generare una cavitazione controllata, disgregando la matrice del biofilm e rilasciando le cellule incorporate in una sospensione. Questa fase assicura che le cellule del biofilm siano disperse in modo uniforme nel mezzo di recupero, facilitando valutazioni accurate della vitalità attraverso metodi di piastratura, diluizione o spettrofotometria. Senza un adeguato distacco del biofilm, i componenti residui della matrice potrebbero schermare le cellule, portando a una sottostima dell'efficacia antimicrobica. Pertanto, la sonicazione è indispensabile per ottenere valori MBEC affidabili e riproducibili, che riflettono il vero potenziale di eradicazione degli agenti testati. Il sonicatore per piastre a pozzetti multipli UIP400MTP consente una facile preparazione dei campioni ad alta produttività in piastre di saggio.

Protocollo per il saggio della concentrazione minima di eradicazione del biofilm (MBEC)

Fase 1: formazione del biofilm

1. Preparare la sospensione batterica:
   Far crescere i batteri in terreni appropriati fino alla fase di crescita logaritmica.
   Diluire la coltura batterica a una densità ottica definita (ad esempio, OD600 ~0,1).
2. Inoculare la piastra da 96 pozzetti:
   Aggiungere la sospensione batterica (ad esempio, 150-200 µL) in ciascun pozzetto di una piastra di microtitolazione standard a 96 pozzetti.
3. Fissare il coperchio del piolo:
   Posizionare il coperchio del piolo sulla piastra inoculata per consentire la formazione del biofilm sulle superfici del piolo.
4. Incubare la piastra:
   Incubare il setup a una temperatura appropriata (ad esempio, 37°C) per 24-48 ore senza agitare per promuovere la crescita del biofilm.

Fase 2: trattamento con agenti antimicrobici

• Preparare soluzioni antimicrobiche:
  Preparare una gamma di concentrazioni antimicrobiche in terreni freschi.
  Esporre i biofilm agli agenti antimicrobici:
  Rimuovere il coperchio dalla coltura batterica e sciacquarla in soluzione fisiologica sterile o PBS per rimuovere le cellule planctoniche.
  Inserire il coperchio del piolo in una nuova piastra da 96 pozzetti contenente le soluzioni antimicrobiche.
• Incubare la piastra:
  Incubare per un periodo definito (ad esempio, 24 ore) per consentire l'esposizione agli antimicrobici.

Fase 3: sonicazione con il sonicatore per piastre da 96 pozzetti UIP400MTP

La fase di sonicazione è fondamentale per staccare i biofilm dai coperchi dei pioli e valutare la vitalità. Seguire questi passaggi per il sonicatore UIP400MTP:

1. Preparare la configurazione:
   Riempire una nuova piastra da 96 pozzetti con terreno di recupero (ad esempio, brodo di neutralizzazione o terreno di crescita fresco) in ogni pozzetto.
2. Trasferire il coperchio del piolo:
   Rimuovere il coperchio del piolo dalla piastra per il trattamento antimicrobico.
   Sciacquare il coperchio del piolo in soluzione fisiologica sterile o PBS per rimuovere gli agenti antimicrobici residui.
3. Posizionare la piastra e il sonicatore:
   Collegare il coperchio del piolo alla piastra del terreno di coltura.
   Posizionare la piastra di terreno di recupero sulla piattaforma del sonicatore UIP400MTP, assicurandosi che la piastra sia centrata e stabile.
4. Regolare i parametri di sonicazione:
   Impostare i parametri di sonicazione sull'UIP400MTP (le impostazioni possono essere adattate al biofilm):
   Ampiezza: 70-100%.
   Tempo di sonicazione: 1-3 minuti (da regolare in base alla robustezza del biofilm) in modalità ciclo.
5. Sonicato:
   Avviare il processo di sonicazione. La vibrazione ad ultrasuoni dislocherà i biofilm dalle superfici dei peg nel mezzo di recupero.
6. Monitorare il processo:
   Utilizzare il sensore di temperatura collegabile per monitorare la temperatura del campione nei pozzetti. L'UIP400MTP può essere collegato a un refrigeratore da laboratorio per il raffreddamento.
7. Gestione della post-sonorizzazione:
   Trasferire immediatamente il terreno di recupero (ora contenente biofilm staccati) in una nuova piastra sterile per l'analisi a valle.

(A) Piastra contenente TSB con il 2% di glucosio utilizzata per la formazione del biofilm, il recupero delle cellule e l'analisi dei risultati.
determinazione di MIC e MBCB; (B) Coperchio con spilli per la formazione di biofilm stafilococcici. determinazione di MIC e MBCB; (B) Coperchio con spilli per la formazione di biofilm stafilococcici.
Le cellule del biofilm formatesi sui perni sono state rimosse mediante sonicazione (Hielscher Ultrasound Technology) per 5 minuti in piastre da 96 pozzetti contenenti terreno di coltura fresco per il recupero delle cellule.
(Immagine e studio: ©de Oliveira et al., 2016)

Fase 4: Valutazione della redditività

Piastra e coltura di biofilm staccati:

1. Eseguire diluizioni seriali del terreno di coltura e applicare su agar per contare le unità formanti colonie (CFU).
   In alternativa, utilizzare un test di vitalità colorimetrico o a fluorescenza.
2. Risultati record:
   Determinare la MBEC come la più bassa concentrazione di antimicrobico che ha eradicato la vitalità del biofilm rilevabile.

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Leggete qui come l'UIP400MTP viene utilizzato per il distacco del biofilm come fase di preparazione del campione durante il protocollo ASTM E2799 per testare l'efficacia dei disinfettanti contro il biofilm di Pseudomonas aeruginosa utilizzando il test MBEC.