Protocollo del saggio MBEC con il sonicatore per piastre a 96 pozzetti UIP400MTP

Il saggio MBEC viene utilizzato per determinare la concentrazione di agenti antimicrobici necessaria per eliminare i biofilm formati sui coperchi con pioli. Per valutare la vitalità del biofilm, occorre innanzitutto staccare i biofilm dai coperchi con pioli di una piastra a 96 pozzetti. La sonicazione è il metodo più affidabile ed efficiente per questo distacco. Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP è progettato specificamente per trattare le piastre per saggi con la massima efficienza e praticità, semplificando e accelerando i saggi MBEC a elevata capacità di trattamento dei campioni.

Sonicazione per il distacco del biofilm

La sonicazione è un passaggio fondamentale nei saggi della concentrazione minima di eradicazione del biofilm (MBEC), poiché consente di staccare efficacemente le cellule del biofilm dalla superficie a cui aderiscono. I biofilm sono comunità di microrganismi intrinsecamente strutturate e racchiuse in una matrice extracellulare, che li rende significativamente più resistenti agli agenti antimicrobici rispetto alle cellule planctoniche. Durante i saggi MBEC, la sonicazione utilizza onde ultrasoniche per generare una cavitazione controllata, disgregando la matrice del biofilm e liberando in sospensione le cellule inglobate. Questo passaggio garantisce che le cellule del biofilm siano disperse uniformemente nel terreno di recupero, facilitando valutazioni accurate della vitalità mediante semina su piastra, diluizione o metodi spettrofotometrici. Senza un adeguato distacco del biofilm, i componenti residui della matrice potrebbero proteggere le cellule, portando a una sottostima dell’efficacia antimicrobica. Pertanto, la sonicazione è indispensabile per ottenere valori MBEC affidabili e riproducibili, che riflettano il reale potenziale di eradicazione degli agenti testati. Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP consente di preparare facilmente i campioni nelle piastre per saggi con un’elevata capacità di trattamento dei campioni.

Protocollo del saggio della concentrazione minima di eradicazione del biofilm (MBEC)

Fase 1: Formazione del biofilm

1. Preparare la sospensione batterica:
   Coltivare i batteri in terreni appropriati fino alla fase di crescita logaritmica.
   Diluire la coltura batterica fino a una densità ottica definita (ad es., OD600 ~0,1).
2. Inoculare la piastra a 96 pozzetti:
   Aggiungere la sospensione batterica (ad es., 150–200 µL) in ciascun pozzetto di una piastra di microtitolazione standard a 96 pozzetti.
3. Applicare il coperchio con pioli:
   Posizionare il coperchio con pioli sulla piastra inoculata per consentire la formazione del biofilm sulle superfici dei pioli.
4. Incubare la piastra:
   Incubare il sistema a una temperatura appropriata (ad es., 37°C) per 24–48 ore senza agitazione per favorire la crescita del biofilm.

Fase 2: Trattamento con agenti antimicrobici

• Preparare le soluzioni antimicrobiche:
  Preparare una serie di concentrazioni di antimicrobici in terreni freschi.
  Esporre i biofilm agli agenti antimicrobici:
  Rimuovere il coperchio con pioli dalla coltura batterica e risciacquarlo in soluzione salina sterile o PBS per rimuovere le cellule planctoniche.
  Posizionare il coperchio con pioli su una nuova piastra a 96 pozzetti contenente le soluzioni antimicrobiche.
• Incubare la piastra:
  Incubare per un periodo definito (ad es., 24 ore) per consentire l’esposizione agli antimicrobici.

Fase 3: Sonicazione con il sonicatore per piastre a 96 pozzetti UIP400MTP

La fase di sonicazione è fondamentale per staccare i biofilm dai coperchi con pioli e valutarne la vitalità. Seguire questi passaggi per il sonicatore UIP400MTP:

1. Preparare il sistema:
   Riempire ciascun pozzetto di una nuova piastra a 96 pozzetti con terreno di recupero (ad es., brodo neutralizzante o terreno di crescita fresco).
2. Trasferire il coperchio con pioli:
   Rimuovere il coperchio con pioli dalla piastra di trattamento antimicrobico.
   Risciacquare il coperchio con pioli in soluzione salina sterile o PBS per rimuovere gli agenti antimicrobici residui.
3. Posizionare la piastra e il sonicatore:
   Applicare il coperchio con pioli alla piastra contenente il terreno di recupero.
   Posizionare la piastra contenente il terreno di recupero sulla piattaforma del sonicatore UIP400MTP, assicurandosi che sia centrata e stabile.
4. Regolare i parametri di sonicazione:
   Impostare i parametri di sonicazione sull’UIP400MTP (le impostazioni possono essere adattate al biofilm):
   Ampiezza: 70–100%.
   Tempo di sonicazione: 1–3 minuti (regolare in base alla robustezza del biofilm) in modalità ciclica.
5. Sonicare:
   Avviare il processo di sonicazione. La vibrazione ultrasonica staccherà i biofilm dalle superfici dei pioli, trasferendoli nel terreno di recupero.
6. Monitorare il processo:
   Utilizzare il sensore di temperatura collegabile per monitorare la temperatura dei campioni nei pozzetti. L’UIP400MTP può essere collegato a un refrigeratore da laboratorio per il raffreddamento.
7. Operazioni successive alla sonicazione:
   Trasferire immediatamente il terreno di recupero (che ora contiene i biofilm staccati) in una nuova piastra sterile per le analisi successive.

(A) Piastra contenente TSB con glucosio al 2% utilizzata per la formazione del biofilm, il recupero delle cellule e
la determinazione di MIC e MBCB; (B) Coperchio con pioli per la formazione di biofilm stafilococcici. determinazione di MIC e MBCB; (B) Coperchio con pioli per la formazione di biofilm stafilococcici.
Le cellule del biofilm formate sui pioli sono state staccate mediante sonicazione (Hielscher Ultrasound Technology) per 5 min in piastre a 96 pozzetti contenenti terreno di coltura fresco per il recupero delle cellule.
(Immagine e studio: ©de Oliveira et al., 2016)

Fase 4: Valutazione della vitalità

Seminare su piastra e coltivare i biofilm staccati:

1. Eseguire diluizioni seriali del terreno di recupero e seminare su agar per contare le unità formanti colonia (CFU).
   In alternativa, utilizzare un saggio di vitalità colorimetrico o basato sulla fluorescenza.
2. Registrare i risultati:
   Determinare la MBEC come la più bassa concentrazione di antimicrobico che ha eliminato la vitalità rilevabile del biofilm.

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Leggete qui come l’UIP400MTP viene utilizzato per il distacco del biofilm come fase di preparazione dei campioni nel protocollo ASTM E2799 per testare l’efficacia dei disinfettanti contro il biofilm di Pseudomonas aeruginosa mediante il saggio MBEC.