Protocollo per la coltivazione e il distacco del biofilm di Staphylococcus

I metodi standardizzati sono essenziali per ottenere risultati di ricerca affidabili. Qui trovate un protocollo per la coltivazione e il distacco dei biofilm stafilococcici. Questo protocollo si concentra sulla semplificazione della preparazione dei campioni con elevata capacità di trattamento mediante il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP, per un distacco efficiente dei biofilm in piastre a 96 pozzetti con elevata capacità di trattamento dei campioni. Il protocollo comprende inoltre le fasi principali per la coltivazione, il lavaggio e la visualizzazione dei biofilm, con particolare attenzione alla riduzione della variabilità e alla riproducibilità.

Biofilm di Staphylococcus e ricerca sugli antibiotici

I biofilm di Staphylococcus svolgono un ruolo cruciale nelle infezioni persistenti a causa della loro resistenza agli antibiotici e alle risposte immunitarie. La formazione del biofilm crea un ambiente protettivo per i batteri, rendendo le infezioni difficili da trattare. La ricerca sui biofilm si concentra spesso sulla comprensione della loro formazione, del loro comportamento e della loro sensibilità agli antimicrobici, privilegiando metodi con elevata capacità di trattamento dei campioni per semplificare i flussi di lavoro sperimentali.
Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP offre un vantaggio significativo nella ricerca sui biofilm, consentendone il distacco rapido ed efficiente dalle piastre a 96 pozzetti. Questo dispositivo fornisce energia ultrasonica uniforme a tutti i pozzetti, garantendo risultati coerenti e riducendo al minimo la variabilità.

Protocollo per la coltivazione e il distacco del biofilm di Staphylococcus

Di seguito vi guidiamo passo dopo passo attraverso il processo di coltivazione e distacco di un biofilm di Staphylococcus. Come esempio di fase analitica, vi mostriamo come quantificare mediante spettrofotometria la biomassa coltivata tramite colorazione con cristalvioletto.

Coltivazione del biofilm di Staphylococcus

Materiali necessari:

• Piastre da microtitolazione sterili in polistirene a 96 pozzetti con fondo piatto, trattate per colture tissutali e dotate di coperchio
• Brodo triptico di soia (TSB) con 0,25% di glucosio
• Cabina di sicurezza biologica

Procedura:

1. Predisporre un ambiente di lavoro sterile in una cabina di sicurezza biologica per ridurre al minimo la contaminazione.
2. Aggiungere TSB contenente 0,25% di glucosio ai pozzetti della piastra da microtitolazione. Il TSB senza glucosio generalmente non favorisce la formazione del biofilm e deve essere utilizzato solo come controllo, se necessario.
3. Inoculare i pozzetti con ceppi batterici preparati come descritto di seguito:
4. Preparare le sospensioni batteriche, assicurandosi che non siano presenti aggregati cellulari preesistenti, omogeneizzando le sospensioni mediante sonicazione oppure disgregando gli aggregati con un ago da 23 gauge e una breve agitazione su vortex.
5. Chiudere la piastra con il suo coperchio e incubare in condizioni ottimali per la formazione del biofilm (ad esempio, a 37°C per 24 ore).
6. Eseguire l’esperimento in triplicato per ciascun ceppo batterico (tre pozzetti per ceppo) per garantire l’affidabilità.
7. Destinare sei pozzetti per piastra ai controlli negativi. È possibile testare fino a 30 ceppi per piastra a 96 pozzetti.

Visualizzazione e lavaggio del biofilm

1. Dopo l’incubazione, eliminare con cautela il terreno di coltura per evitare di perturbare il biofilm.
2. Lavare ciascun pozzetto quattro volte con soluzione fisiologica per rimuovere i batteri planctonici.
3. Ispezionare il fondo dei pozzetti per individuare chiazze bianche indicative della presenza di biofilm.

Distacco del biofilm mediante il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP

Configurazione del dispositivo e parametri:

• Sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP
• Impostazioni operative: ampiezza del 60%, modalità ciclica con 60 secondi di attivazione / 30 secondi di pausa

Procedura:

1. Posizionare la piastra da microtitolazione lavata sulla piattaforma dell’UIP400MTP.
2. Sottoporre i campioni a sonicazione con le impostazioni consigliate (ampiezza del 60%, 60 secondi di attivazione, 30 secondi di pausa). Adattare le impostazioni al ceppo batterico.
3. Avviare il processo di sonicazione per distaccare il biofilm. Le onde ultrasoniche disgregano la matrice del biofilm, liberando i batteri adesi.
4. L’UIP400MTP garantisce un’esposizione uniforme in tutti i pozzetti, assicurando risultati coerenti nel distacco.

Fase analitica: quantificazione della biomassa del biofilm di Staphylococcus distaccato mediante cristalvioletto (CV)

Materiali necessari:

• Soluzione di cristalvioletto (CV) allo 0,1%
• Etanolo al 95% o acido acetico al 30% (per la solubilizzazione)
• Lettore di micropiastre in grado di effettuare letture a 570 nm
• Piastre da microtitolazione sterili per la colorazione

Procedura:

1. Preparazione della piastra per la colorazione: trasferire 100 µL della sospensione di biofilm distaccato da ciascun pozzetto della piastra sottoposta a sonicazione ai pozzetti corrispondenti di una piastra da microtitolazione a 96 pozzetti pulita e sterile. Questo garantisce un ambiente pulito e uniforme per la colorazione.
2. Colorazione del biofilm distaccato: aggiungere 150 µL di soluzione di cristalvioletto allo 0,1% a ciascun pozzetto contenente la sospensione di biofilm distaccato. Pipettare delicatamente per garantire una miscelazione uniforme della sospensione di biofilm e del cristalvioletto.
3. Incubazione: lasciare incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti, per consentire al cristalvioletto di colorare efficacemente la biomassa.
4. Lavaggio: dopo l’incubazione, eliminare con cautela la soluzione di cristalvioletto dai pozzetti senza perturbare la biomassa. Lavare ciascun pozzetto tre volte con soluzione fisiologica sterile per rimuovere il colorante non legato.
5. Asciugatura: lasciare asciugare la piastra all’aria a temperatura ambiente o sotto una cappa a flusso d’aria sterile. Evitare il riscaldamento, poiché potrebbe alterare i risultati.
6. Solubilizzazione: aggiungere 200 µL di etanolo al 95% (o acido acetico al 30%, a seconda delle pratiche standard del laboratorio) a ciascun pozzetto per solubilizzare il cristalvioletto legato. Miscelare delicatamente pipettando o agitando la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente.
7. Misurazione: misurare la densità ottica (OD) della soluzione di cristalvioletto solubilizzato a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
8. Analisi dei dati: sottrarre il valore medio di OD570 dei controlli negativi (pozzetti con TSB ma senza inoculo batterico) dai valori dei pozzetti sperimentali per correggere la colorazione di fondo. Registrare e analizzare i dati.

Nota: eseguire l’esperimento in triplicato per ciascuna condizione per garantire la riproducibilità. Assicurare la corretta manipolazione del cristalvioletto e dell’etanolo, rispettando i protocolli di sicurezza e smaltimento.
 

I principali vantaggi dell’UIP400MTP in sintesi:

• Elevata capacità di trattamento dei campioni: Progettato specificamente per piastre multipozzetto, consente di trattare più campioni contemporaneamente.
• Distribuzione uniforme degli ultrasuoni: Garantisce la stessa intensità ultrasonica in tutti i pozzetti, fornendo risultati coerenti per tutti i campioni.
• Utilizzate qualsiasi piastra standard: L’UIP400MTP può trattare qualsiasi piastra multipozzetto standard, piastre di Petri e portaprovette. Non sono necessarie costose piastre proprietarie!
• Interfaccia intuitiva: Facile da configurare e controllare, è uno strumento eccellente per aumentare la produttività del laboratorio. Le impostazioni programmabili e l’automazione facilitano la standardizzazione dei processi!