Protocollo di coltura e distacco del biofilm di Staphylococcus

I metodi standardizzati sono essenziali per ottenere risultati di ricerca affidabili. Qui è disponibile un protocollo di coltivazione e distacco di biofilm di stafilococco. Questo protocollo si concentra sulla preparazione semplificata dei campioni ad alto rendimento utilizzando il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP per un distacco efficiente e ad alto rendimento del biofilm in piastre da 96 pozzetti. Il protocollo contiene anche i passaggi chiave per la coltivazione, il lavaggio e la visualizzazione del biofilm, con l'obiettivo di ridurre al minimo la variabilità e garantire la riproducibilità.

Biofilm di stafilococco e ricerca sugli antibiotici

I biofilm di stafilococco svolgono un ruolo critico nelle infezioni persistenti a causa della loro resistenza agli antibiotici e alle risposte immunitarie. La formazione di biofilm fornisce un ambiente protettivo per i batteri, rendendo le infezioni difficili da trattare. La ricerca sui biofilm si concentra spesso sulla comprensione della loro formazione, del loro comportamento e della loro suscettibilità agli antimicrobici, ponendo l'accento sui metodi high-throughput per semplificare i flussi di lavoro sperimentali.
Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP offre un vantaggio significativo nella ricerca sui biofilm, consentendo il distacco rapido ed efficiente dei biofilm dalle piastre a 96 pozzetti. Questo dispositivo fornisce un'energia ultrasonica uniforme a tutti i pozzetti, garantendo risultati uniformi e riducendo al minimo la variabilità.

Protocollo per la coltivazione e il distacco del biofilm di Staphylococcus

Di seguito, vi guidiamo con un'istruzione passo-passo attraverso il processo di coltivazione e distacco di un biofilm di stafilococco. Come fase analitica esemplare, vi mostriamo come quantificare spettrofotometricamente la biomassa coltivata mediante colorazione con cristalvioletto.

Coltivazione del biofilm di Staphylococcus

Materiale richiesto:

• Piastre per microtitolazione sterili a 96 pozzetti a fondo piatto in polistirene trattato per coltura tissutale con coperchio
• Brodo di soia triptica (TSB) con glucosio allo 0,25%.
• Cabina di sicurezza biologica

Passi:

1. Preparare un ambiente di lavoro sterile in una cabina di sicurezza biologica per ridurre al minimo la contaminazione.
2. Aggiungere TSB contenente lo 0,25% di glucosio ai pozzetti della piastra di microtitolazione. Il TSB senza glucosio non favorisce in genere la formazione di biofilm e deve essere usato solo come controllo, se necessario.
3. Inoculare i pozzetti con ceppi batterici preparati come descritto di seguito:
4. Preparare le sospensioni batteriche, assicurandosi che non vi siano ammassi cellulari preesistenti, omogeneizzando le sospensioni con la sonicazione o rompendo gli ammassi con un ago da 23 e un breve vortice.
5. Sigillare la piastra con il suo coperchio e incubare in condizioni ottimali per la formazione del biofilm (ad esempio, 37°C per 24 ore).
6. Eseguire l'esperimento in triplicato per ogni ceppo batterico (tre pozzetti per ceppo) per garantire l'affidabilità.
7. Assegnare sei pozzetti per piastra per i controlli negativi. È possibile testare fino a 30 ceppi per ogni piastra da 96 pozzetti.

Visualizzazione e lavaggio del biofilm

1. Dopo l'incubazione, scartare con cura il terreno di coltura per evitare di disturbare il biofilm.
2. Lavare ogni pozzetto quattro volte con soluzione fisiologica per rimuovere i batteri planctonici.
3. Ispezionare il fondo dei pozzetti per individuare eventuali macchie bianche indicative della presenza di biofilm.

Distacco del biofilm con il sonicatore per piastre a pozzetti multipli UIP400MTP

Impostazione e parametri del dispositivo:

• UIP400MTP Sonicatore per piastre a pozzetti multipli
• Impostazioni operative: Ampiezza 60%, modalità ciclo con 60 secondi ON / 30 secondi OFF

Passi:

1. Posizionare la piastra per microtitolazione lavata sulla piattaforma UIP400MTP.
2. Sonicare i campioni con le impostazioni consigliate (60% di ampiezza, 60 secondi ON, 30 secondi OFF). Regolare le impostazioni in base al ceppo batterico.
3. Avviare il processo di sonicazione per staccare il biofilm. Le onde ultrasoniche rompono la matrice del biofilm, liberando i batteri aderenti.
4. La UIP400MTP garantisce un'esposizione uniforme in tutti i pozzetti per ottenere risultati di distacco uniformi.

Fase analitica: Quantificazione della biomassa del biofilm di Staphylococcus staccato con l'uso del cristalvioletto (CV)

Materiale richiesto:

• 0.1% di soluzione di cristal-violetto (CV)
• etanolo al 95% o acido acetico al 30% (per la solubilizzazione)
• Lettore di micropiastre in grado di leggere a 570 nm
• Piastre sterili da microtitolazione per la colorazione

Passi:

1. Preparazione della piastra di colorazione: Trasferire 100 µL di sospensione di biofilm staccato da ciascun pozzetto della piastra sonicata nei pozzetti corrispondenti di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti pulita e sterile. Questo assicura un ambiente chiaro e uniforme per la colorazione.
2. Colorazione del biofilm staccato: Aggiungere 150 µL di soluzione di cristalvioletto allo 0,1% in ogni pozzetto contenente la sospensione di biofilm staccato. Pipettare delicatamente per garantire una miscelazione uniforme della sospensione di biofilm e del cristalvioletto.
3. Incubazione: Lasciare incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti per consentire al cristalvioletto di colorare efficacemente la biomassa.
4. Lavaggio: dopo l'incubazione, eliminare con cura la soluzione di cristalvioletto dai pozzetti senza disturbare la biomassa. Lavare ogni pozzetto tre volte con soluzione fisiologica sterile per rimuovere il colorante non legato.
5. Asciugatura: Lasciare asciugare la piastra all'aria a temperatura ambiente o sotto una cappa sterile. Evitare il riscaldamento, che potrebbe alterare i risultati.
6. Solubilizzazione: Aggiungere 200 µL di etanolo al 95% (o acido acetico al 30%, a seconda delle pratiche di laboratorio standard) a ciascun pozzetto per solubilizzare il cristalvioletto legato. Mescolare delicatamente pipettando o agitando la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente.
7. Misurazione: Misurare la densità ottica (OD) della soluzione di cristalvioletto solubilizzata a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
8. Analisi dei dati: Sottrarre il valore medio di OD570 dei controlli negativi (pozzetti con TSB ma senza inoculo batterico) dai pozzetti sperimentali per tenere conto della colorazione di fondo. Registrare e analizzare i dati.

Nota: eseguire l'esperimento in triplo per ogni condizione per garantire la riproducibilità. Assicurare la corretta manipolazione del cristalvioletto e dell'etanolo, rispettando i protocolli di sicurezza e di smaltimento.
 

I principali vantaggi della UIP400MTP in sintesi:

• Elaborazione ad alto rendimento: Progettato specificamente per piastre a più pozzetti, consente di elaborare più campioni contemporaneamente.
• Distribuzione uniforme degli ultrasuoni: Assicura un'intensità ultrasonica uguale tra i pozzetti, fornendo risultati coerenti per tutti i campioni.
• Utilizzare qualsiasi piastra standard: L'UIP400MTP è in grado di gestire qualsiasi piastra multipozzetto, piastra Petri e rack per provette standard. Non sono necessarie costose piastre proprietarie!
• Interfaccia facile da usare: Facile da impostare e controllare, è uno strumento eccellente per aumentare la produttività del laboratorio. Le impostazioni programmabili e l'automazione facilitano la standardizzazione dei processi!