Protocollo di utilizzo dei sonicatori multicampione Hielscher per l'analisi di biofilm e proteomica

L'uso di sonicatori multi-campione, come il sonicatore multi-tubo VialTweeter e il sonicatore per micropiastre UIP400MTP, snellisce i flussi di lavoro del laboratorio per le applicazioni ad alta produttività. Entrambi i dispositivi consentono un'elaborazione precisa e uniforme degli ultrasuoni su più campioni, riducendo al minimo la variabilità e migliorando la riproducibilità. Ciò è particolarmente vantaggioso negli esperimenti che richiedono una lisi coerente del campione, il distacco del biofilm, l'estrazione di proteine o la digestione proteolitica, dove i metodi manuali o per singolo campione sono meno efficienti e soggetti a incoerenza.

Semplificare i flussi di lavoro con i sonicatori multicampione

UIP400MTP, ad esempio, consente il trattamento simultaneo a ultrasuoni dei pozzetti delle micropiastre, garantendo il distacco uniforme di biofilm o materiale cellulare. Il VialTweeter, invece, offre una lisi e un'omogeneizzazione precisa di campioni multipli in provetta senza contaminazione incrociata. Questi sonicatori riducono significativamente i tempi di elaborazione, migliorano la riproducibilità sperimentale e mantengono un'elevata integrità del campione, rendendoli strumenti indispensabili per la ricerca in microbiologia, proteomica e biologia molecolare.
Di seguito è riportato un protocollo dettagliato che esemplifica l'uso dei modelli di sonicatori multi-campione Hielscher, il sonicatore multi-tubo VialTweeter e il sonicatore per micropiastre UIP400MTP, in uno studio che prevede la formazione di biofilm di E. coli e la successiva analisi proteomica.

Protocollo: Formazione, distacco e analisi proteomica del biofilm con i sonicatori multicampione Hielscher

1. Preparazione della coltura batterica

• Coltivare i batteri E. coli (ceppo W3110) a 30°C, temperatura favorevole alla formazione del biofilm di E. coli, in terreno tryptone broth (TB) contenente:
  – 10 g/L di triptone
  – 5 g/L NaCl
• Integrare con antibiotici se necessario per garantire la ritenzione del plasmide.
• Per gli studi di microscopia e attività del promotore, utilizzare il ceppo W3110 di E. coli con un reporter GFP genomico potenziato (eGFP) sotto il controllo del promotore rplL.
• Utilizzare plasmidi reporter GFP per vari promotori (ad es, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) per misurare le attività dei promotori.

2. Coltivazione e distacco del biofilm

• Seminare 1,5 mL di coltura batterica diluita per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti (piastre CellStar a 12 pozzetti, Greiner Bio-One).
• Incubare per consentire la formazione del biofilm.
• Rimuovere con cura la coltura planctonica (non aderente).

– Lavare ogni pozzetto con 500 µL di PBS.
– Staccare le cellule attaccate sonicando la piastra a 12 pozzetti nel sonicatore per micropiastre UIP400MTP. L'UIP400MTP garantisce un distacco uniforme erogando un'energia ultrasonica costante in tutti i pozzetti.
– Impostazioni di sonicazione: Ampiezza 60%, modalità ciclo: 60 sec ON / 30 sec OFF.

3. Raccolta e lisi delle cellule

• Centrifugare le cellule del biofilm staccate a 4.500 g per 5 minuti.
• Lavare le cellule schiuse con PBS.
• Risospendere le cellule in 100 µL di sodio lauroil sarcosinato (SLS) al 2% e incubare a 95°C per 15 minuti.
• Sonicare con il sonicatore VialTweeter Multi-Tube per garantire la lisi cellulare completa.
  – Impostazioni di sonicazione: 100% di ampiezza, 50 s ON / 10 s OFF per un tempo totale di esecuzione di 10 minuti; conservare i campioni nel ghiaccio.

4. Riduzione e alchilazione

• Aggiungere 5 mM di Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) per ridurre i legami disolfuro e incubare a 95°C per 15 minuti.
• Alchilare le proteine con 10 mM di iodoacetamide per 30 minuti a 25°C.

5. Quantificazione e digestione delle proteine

• Centrifugare i lisati per eliminare i detriti.
• Quantificare il contenuto di proteine totali utilizzando il kit Pierce BCA Protein Assay.
• Digerire 50 µg di proteine totali con 1 µg di tripsina in una soluzione contenente il 2% di SLS e 100 mM di bicarbonato di ammonio.
• Incubare la reazione di digestione per una notte a 30°C.

6. Purificazione dei peptidi

• Precipitare SLS aggiungendo l'1,5% di acido trifluoroacetico (TFA), quindi centrifugare.
• Purificare i peptidi utilizzando colonne C18 microspin.
• Asciugare i peptidi purificati e risospenderli in TFA allo 0,1%.

7. Cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS/MS)

• Analizzare i peptidi su uno spettrometro di massa Q-Exactive Plus accoppiato a un sistema Ultimate 3000 RSLC nano.
• Separare i peptidi utilizzando una colonna HPLC in fase inversa (75 µm × 42 cm) confezionata con resina C18 (2,4 µm).
• Applicare un gradiente dal 2% al 35% di solvente B (acetonitrile con lo 0,15% di acido formico) in 140 minuti.
• Acquisire i dati utilizzando scansioni MS ad alta risoluzione seguite da scansioni MS/MS tandem dei 10 ioni più intensi.

8. Analisi dei dati

• Elaborare i dati LC-MS grezzi utilizzando il software Progenesis.
• Esportazione di file .mgf e analisi con MASCOT.
• Eseguire la quantificazione dei peptidi utilizzando SafeQuant per il controllo di qualità e la regolazione delle false scoperte.
• Condurre tutti gli esperimenti in duplicati o triplicati per garantire la riproducibilità.

Sonicatori multi-campione per la preparazione dei campioni ad alta produttività

I modelli di sonicatori multicampione VialTweeter e UIP400MTP migliorano significativamente la precisione e l'efficienza dei flussi di lavoro sperimentali, in particolare nella ricerca sul biofilm e nella proteomica. La loro capacità di processare più campioni in modo uniforme garantisce una capacità di produzione elevata senza compromettere la qualità dei dati. Questi vantaggi, uniti alla semplificazione dei flussi di lavoro sopra descritta, rendono i sonicatori multicampione Hielscher strumenti essenziali per la moderna ricerca biologica.

Progettazione, produzione e consulenza – Qualità Made in Germany

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