Protocollo con sonicatori multicampione Hielscher per l’analisi dei biofilm e l’analisi proteomica

L’uso di sonicatori multicampione, come il sonicatore multiprovetta VialTweeter e il sonicatore per micropiastre UIP400MTP, semplifica i flussi di lavoro di laboratorio per applicazioni con elevata capacità di trattamento dei campioni. Entrambi i dispositivi consentono un trattamento a ultrasuoni preciso e uniforme di più campioni, riducendo al minimo la variabilità e migliorando la riproducibilità. Questo è particolarmente vantaggioso negli esperimenti che richiedono una lisi uniforme dei campioni, il distacco dei biofilm, l’estrazione delle proteine o la digestione proteolitica, nei quali i metodi manuali o di trattamento di singoli campioni sono meno efficienti e soggetti a risultati non uniformi.

Semplificare i flussi di lavoro con sonicatori multicampione

L’UIP400MTP, ad esempio, consente il trattamento simultaneo a ultrasuoni dei pozzetti delle micropiastre, assicurando un distacco uniforme dei biofilm o del materiale cellulare. Il VialTweeter, invece, offre una lisi e un’omogeneizzazione precise di più campioni in provetta senza contaminazione crociata. Questi sonicatori riducono significativamente i tempi di trattamento, migliorano la riproducibilità sperimentale e mantengono un’elevata integrità dei campioni, rendendoli strumenti indispensabili nella ricerca in microbiologia, proteomica e biologia molecolare.
Di seguito è riportato un protocollo dettagliato che illustra l’uso dei modelli di sonicatori multicampione Hielscher, il sonicatore multiprovetta VialTweeter e il sonicatore per micropiastre UIP400MTP, in uno studio sulla formazione di biofilm di E. coli e sulla successiva analisi proteomica.

Protocollo: formazione e distacco dei biofilm e analisi proteomica con sonicatori multicampione Hielscher

1. Preparazione della coltura batterica

• Coltivare i batteri E. coli (ceppo W3110) a 30°C, una temperatura favorevole alla formazione di biofilm di E. coli, in un terreno di brodo di triptone (TB) contenente:
  – 10 g/L di triptone
  – 5 g/L di NaCl
• Aggiungere antibiotici secondo necessità per assicurare il mantenimento dei plasmidi.
• Per gli studi di microscopia e di attività dei promotori, utilizzare il ceppo W3110 di E. coli con un reporter genomico della GFP potenziata (eGFP) sotto il controllo del promotore rplL.
• Utilizzare plasmidi reporter GFP per diversi promotori (ad es., csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) per misurare le attività dei promotori.

2. Coltivazione e distacco dei biofilm

• Inoculare 1,5 mL di coltura batterica diluita per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti (piastre CellStar a 12 pozzetti, Greiner Bio-One).
• Incubare per consentire la formazione del biofilm.
• Rimuovere con cautela la coltura planctonica (non aderente).

– Lavare ogni pozzetto con 500 µL di PBS.
– Staccare le cellule adese sottoponendo la piastra a 12 pozzetti a sonicazione nel sonicatore per micropiastre UIP400MTP. L’UIP400MTP assicura un distacco uniforme erogando energia ultrasonica in modo costante in tutti i pozzetti.
– Impostazioni di sonicazione: ampiezza del 60%, modalità ciclica: 60 sec ON / 30 sec OFF.

3. Raccolta e lisi delle cellule

• Centrifugare le cellule staccate dal biofilm a 4.500 g per 5 minuti.
• Lavare le cellule sedimentate con PBS.
• Risospendere le cellule in 100 µL di lauroil sarcosinato di sodio (SLS) al 2% e incubare a 95°C per 15 minuti.
• Sottoporre a sonicazione utilizzando il sonicatore multiprovetta VialTweeter per assicurare una lisi cellulare completa.
  – Impostazioni di sonicazione: ampiezza del 100%, 50 s ON / 10 s OFF per un tempo totale di funzionamento di 10 min; mantenere i campioni sul ghiaccio.

4. Riduzione e alchilazione

• Aggiungere tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) a 5 mM per ridurre i legami disolfuro e incubare a 95°C per 15 minuti.
• Alchilare le proteine con iodoacetamide a 10 mM per 30 minuti a 25°C.

5. Quantificazione e digestione delle proteine

• Centrifugare i lisati per rimuovere i detriti.
• Quantificare il contenuto proteico totale utilizzando il Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Digerire 50 µg di proteine totali con 1 µg di tripsina in una soluzione contenente SLS al 2% e bicarbonato di ammonio a 100 mM.
• Incubare la reazione di digestione per tutta la notte a 30°C.

6. Purificazione dei peptidi

• Precipitare l’SLS aggiungendo acido trifluoroacetico (TFA) all’1,5%, quindi centrifugare.
• Purificare i peptidi utilizzando colonne microspin C18.
• Essiccare i peptidi purificati e risospenderli in TFA allo 0,1%.

7. Cromatografia liquida–spettrometria di massa (LC-MS/MS)

• Analizzare i peptidi con uno spettrometro di massa Q-Exactive Plus accoppiato a un sistema Ultimate 3000 RSLC nano.
• Separare i peptidi utilizzando una colonna HPLC a fase inversa (75 µm × 42 cm) impaccata con resina C18 (2,4 µm).
• Applicare un gradiente dal 2% al 35% di solvente B (acetonitrile con acido formico allo 0,15%) nell’arco di 140 minuti.
• Acquisire i dati mediante scansioni MS ad alta risoluzione seguite da scansioni MS/MS in tandem dei 10 ioni più intensi.

8. Analisi dei dati

• Elaborare i dati LC-MS grezzi utilizzando il software Progenesis.
• Esportare i file .mgf e analizzarli con MASCOT.
• Eseguire la quantificazione dei peptidi utilizzando SafeQuant per il controllo di qualità e la correzione dei falsi positivi.
• Condurre tutti gli esperimenti in duplicato o triplicato per assicurare la riproducibilità.

Sonicatori multicampione per la preparazione dei campioni con elevata capacità di trattamento

I modelli di sonicatori multicampione VialTweeter e UIP400MTP migliorano significativamente la precisione e l’efficienza dei flussi di lavoro sperimentali, soprattutto nella ricerca sui biofilm e nella proteomica. La loro capacità di trattare più campioni in modo uniforme assicura un’elevata capacità di trattamento dei campioni senza compromettere la qualità dei dati. Questi vantaggi, insieme ai flussi di lavoro semplificati descritti sopra, rendono i sonicatori multicampione Hielscher strumenti essenziali per la moderna ricerca biologica.

Progettazione, produzione e consulenza – Qualità Made in Germany

I sonicatori Hielscher sono rinomati per i loro elevatissimi standard di qualità e progettazione. La robustezza e la facilità d’uso consentono una facile integrazione dei nostri sonicatori negli impianti industriali. I sonicatori Hielscher affrontano agevolmente condizioni difficili e ambienti impegnativi.

Hielscher Ultrasonics è un’azienda certificata ISO e pone particolare attenzione ai sonicatori ad alte prestazioni dotati di tecnologia all’avanguardia e facilità d’uso. Naturalmente, i sonicatori Hielscher sono conformi alla normativa CE e soddisfano i requisiti di UL, CSA e RoHs.