Deparaffinazione ed estrazione delle proteine da tessuti FFPE

Facilitate l’estrazione delle proteine da sezioni di tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) utilizzando una combinazione ottimizzata di deparaffinazione, solubilizzazione e sonicazione con un sonicatore multiprovetta VialTweeter. Questo protocollo supporta le successive analisi proteomiche basate sulla spettrometria di massa ed è compatibile con i flussi di lavoro di purificazione SP3 e digestione enzimatica.

Questa procedura operativa standard (SOP) è destinata al personale di laboratorio che esegue analisi proteomiche di campioni di tessuto FFPE mediante sonicazione ad alte prestazioni. È ottimizzata per il trattamento in parallelo di un massimo di dieci campioni FFPE utilizzando il sonicatore multiprovetta VialTweeter.

Protocollo: estrazione delle proteine da campioni FFPE con VialTweeter

Materiali e reagenti

Reagenti

• Xilene (grado istologico)
• Etanolo (assoluto 96%)
• Tampone di lisi:

6 M cloridrato di guanidina
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (tris(2-carbossietil)fosfina)
40 mM CAA (2-cloroacetamide)

• Inibitore delle proteasi (facoltativo; ad esempio, cOmplete™ mini senza EDTA)

Strumentazione

• Sonicatore multiprovetta VialTweeter
• Provette da microcentrifuga da 1,5 mL o 2,0 mL a basso adsorbimento
• Blocco riscaldante o incubatore (impostazioni a 95°C e 80°C)
• Microcentrifuga
• Termomixer (facoltativo ma consigliato)

Quantità di campione iniziale

• 1–2 sezioni di tessuto FFPE dello spessore di 10 µm per campione (cioè per provetta)

OPPURE

• Un totale di ~100 µg di tessuto per campione (cioè per provetta)

Nota: utilizzare lame nuove per la microtomia per ridurre al minimo la contaminazione da residui di paraffina.

Procedura

1. Deparaffinazione
   1. Trasferire le sezioni FFPE in provette da microcentrifuga a basso adsorbimento.
   2. Aggiungere 1 mL di xilene e agitare brevemente al vortex.
   3. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
   4. Centrifugare a 14.000 × g per 2 minuti; eliminare il surnatante.
   5. Ripetere il lavaggio con xilene un’altra volta (passaggi 2–4).
   6. Lavare il pellet con 1 mL di etanolo al 96%, agitare al vortex, quindi centrifugare a 14.000 × g per 2 minuti. Eliminare il surnatante.
   7. Ripetere il lavaggio con etanolo un’altra volta (per un totale di 2 lavaggi con etanolo).
   8. Lasciare asciugare il pellet all’aria per 10 minuti a temperatura ambiente con i coperchi aperti per far evaporare l’etanolo residuo.
2. Estrazione delle proteine e sonicazione
   1. Aggiungere 200 µL di tampone di lisi a ciascun pellet asciutto.

      Nota: sebbene il sonicatore possa contenere fino a 1 mL, 200 µL è il volume ottimale per le successive fasi di trattamento.

   2. Miscelare mediante agitazione al vortex o pipettaggio delicato.
3. Prima incubazione termica
   1. Incubare le provette a 95 °C per 30 min, con agitazione a 400 rpm utilizzando un termomixer o un blocco riscaldante.
   2. Lasciare raffreddare i campioni a temperatura ambiente per 5 min.
4. Prima sonicazione con VialTweeter
   1. Inserire le provette nel VialTweeter.
   2. Impostare il VialTweeter UP200St sui valori riportati di seguito ed eseguire la sonicazione.
Impostazioni del sonicatore
• Impostare l’ampiezza (A) al 100%
• Impostare la modalità di pulsazione (C) al 100%
• Temporizzatore dei periodi: attivo
• Tempo di attivazione: 60s
• Tempo di pausa: 30s
• Valore limite: 15 min (corrisponde a 10 cicli)
(Nota sul calcolo: (60 s di attivazione + 30 s di pausa) × 10 cicli = 900 s = 15 min)
5. Seconda incubazione termica
   Rimuovere le provette e incubare nuovamente a 95 °C per 15 min, a 400 rpm.
6. Seconda sonicazione
   Ripetere la sonicazione con VialTweeter utilizzando le stesse impostazioni (riportate sopra) per altri 10 cicli (15 min in totale).
7. Chiarificazione del lisato
   1. Centrifugare i campioni a 13.000 × g per 10 min a 23°C (temperatura ambiente).
   2. Raccogliere con attenzione il surnatante in una nuova provetta Eppendorf Safe-lock da 2,0 mL. Evitare di smuovere il pellet.
8. Fasi successive di trattamento
   Il lisato è ora pronto per la purificazione SP3 e la digestione enzimatica.

Note e buone pratiche

1. Il rischio di surriscaldamento durante la sonicazione è mitigato dall’alternanza programmata di cicli di attivazione e pausa.
2. Evitare l’agitazione al vortex dopo la sonicazione per prevenire l’aggregazione delle proteine.

Smaltimento dei rifiuti e sicurezza

La tabella seguente fornisce un’indicazione della capacità di trattamento approssimativa dei nostri sonicatori da laboratorio: