Deparaffinizzazione ed estrazione di proteine da FFPE
Facilitate l'estrazione di proteine da sezioni di tessuto FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded) utilizzando una combinazione ottimizzata di deparaffinizzazione, solubilizzazione e sonicazione con un ultrasuonatore multi-tubo VialTweeter. Questo protocollo supporta la proteomica a valle basata sulla spettrometria di massa ed è compatibile con i flussi di lavoro di pulizia e digestione enzimatica SP3.
Questa SOP è destinata al personale di laboratorio coinvolto nell'analisi proteomica di campioni di tessuto FFPE utilizzando la sonicazione ad alte prestazioni. È ottimizzata per un massimo di dieci campioni FFPE trattati in parallelo con il sonicatore VialTweeter Multi-Tube.
Sonicatore VialTweeter per la sonicazione simultanea di 10 campioni, ad esempio per la lisi e l'estrazione di proteine da campioni FFPE
Protocollo: Estrazione di proteine da campioni FFPE utilizzando il VialTweeter
Materiali e reagenti
Reagenti
- Xilene (grado istologico)
- Etanolo (assoluto 96%)
- Tampone di lisi:
- Inibitore di proteasi (opzionale; ad esempio, cOmplete™ mini EDTA-free)
6 M Guanidina cloridrato
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-carbossietil)fosfina)
40 mM CAA (2-cloroacetamide)
Attrezzatura
- Ultrasuonatore multi-tubo VialTweeter
- Provette per microcentrifuga da 1,5 mL o 2,0 mL a basso contenuto di legante
- Blocco termico o incubatore (impostazioni 95°C e 80°C)
- Microcentrifuga
- Termomixer (facoltativo ma consigliato)
Esempio di ingresso
- 1-2 sezioni di tessuto FFPE di 10 µm di spessore per campione (cioè, per fiala)
- Un totale di ~100 µg di tessuto per campione (cioè, per fiala)
o
Nota: utilizzare lame fresche per la microtomia per ridurre al minimo la contaminazione dei detriti di paraffina.
Procedura
- Deparaffinizzazione
- Trasferire le sezioni FFPE in provette da microcentrifuga a basso legame.
- Aggiungere 1 mL di xilene, agitare brevemente.
- Incubare 10 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifugare a 14.000 × g per 2 minuti; scartare il surnatante.
- Ripetere il lavaggio con xilene un'altra volta (fasi 2-4).
- Lavare il pellet con 1 mL di etanolo al 96%, agitare, quindi centrifugare a 14.000 × g per 2 minuti. Scartare il surnatante.
- Ripetere il lavaggio con etanolo un'altra volta (per un totale di 2 lavaggi con etanolo).
- Asciugare il pellet all'aria per 10 minuti a temperatura ambiente con i coperchi aperti per far evaporare l'etanolo residuo.
- Estrazione di proteine e sonicazione
- Aggiungere 200 µL di tampone di lisi a ciascun pellet secco.
Nota: sebbene il sonicatore sia in grado di ospitare fino a 1 mL, 200 µL sono ottimali per l'elaborazione a valle. - Miscelare con il vortex o con un leggero pipettaggio.
- Aggiungere 200 µL di tampone di lisi a ciascun pellet secco.
- Prima incubazione termica
- Incubare le provette a 95 °C per 30 minuti, agitando a 400 rpm con un termomixer o un blocco termico.
- Lasciare raffreddare i campioni a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Prima sonicazione con il VialTweeter
- Inserire le provette nel VialTweeter.
- Impostare il VialTweeter UP200St sui valori indicati di seguito e sonicare.
- Seconda incubazione termica
Rimuovere le provette e incubare nuovamente a 95 °C per 15 minuti, 400 rpm. - Seconda sonicazione
Ripetere la sonicazione su VialTweeter utilizzando le stesse impostazioni (come sopra) per altri 10 cicli (15 minuti in totale). - Chiarificazione del lisato
- Centrifugare i campioni a 13.000 × g per 10 minuti a 23°C (temperatura ambiente).
- Raccogliere con cura il surnatante in una nuova provetta Eppendorf Safe-lock da 2,0 mL. Evitare di disturbare il pellet.
- Trattamento a valle
Il lisato è ora pronto per la pulizia SP3 e la digestione enzimatica.
- Impostare l'ampiezza (A) al 100%.
- Impostare la modalità di pulsazione (C) al 100%.
- Orologio del periodo: Acceso
- In orario: 60
- Tempo di spegnimento: 30s
- Valore limite: 15 min (corrisponde a 10 cicli)
(Nota di calcolo: (60 s On + 30 s Off) × 10 cicli = 900 s = 15 min)
Hielscher VialTweeter con 10 provette Eppendorf
Note e buone pratiche
- Il rischio di surriscaldamento durante la sonicazione è attenuato dal ciclo ON/OFF programmato.
- Evitare il vortice dopo la sonizzazione per evitare l'aggregazione delle proteine.
Smaltimento dei rifiuti e sicurezza
La tabella seguente fornisce un'indicazione della capacità di trattamento approssimativa dei nostri ultrasuoni da laboratorio:
| Dispositivi raccomandati | Volume di batch | Portata |
|---|---|---|
| UIP400MTP Sonicatore per piastre a 96 pozzetti | piastre multipozzetto / microtitolazione | n.a. |
| Coccodrillo a ultrasuoni | CupHorn per fiale o becher | n.a. |
| GDmini2 | Reattore a microflusso a ultrasuoni | n.a. |
| VialTweeter | 0,5-1,5 mL | n.a. |
| UP100H | 1 - 500mL | 10 - 200mL/min |
| UP200Ht, UP200St | Da 10 a 1000 ml | Da 20 a 200 mL/min |
| UP400St | 10 - 2000mL | 20 - 400mL/min |
| Agitatore a ultrasuoni a setaccio | n.a. | n.a. |
Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni per applicazioni di miscelazione, dispersione, emulsione ed estrazione su scala di laboratorio, pilota e industriale.
Letteratura / Riferimenti
- Georgios Mermelekas, Mahshid Zarrineh, Rudi Branca, Fabio Socciarelli (2025): FFPE sections SP3 digestion – rapizyme and ACN. Protocols.io 2025
- Li, W., Chi, H., Salovska, B. et al. (2019): Assessing the Relationship Between Mass Window Width and Retention Time Scheduling on Protein Coverage for Data-Independent Acquisition. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 30, 2019. 1396–1405.
- Salovska B., Li W., Bernhardt O.M., Germain P.L., Gandhi T., Reiter L., Liu Y. (2024): A Comprehensive and Robust Multiplex-DIA Workflow Profiles Protein Turnover Regulations Associated with Cisplatin Resistance. bioRxiv [Preprint]. Oct 31, 2024.
Domande frequenti
Perché i campioni di tessuto vengono fissati come FFPE?
La conservazione in formalina fissata in paraffina (FFPE) stabilizza la morfologia dei tessuti e le strutture proteiche formando legami crociati covalenti attraverso la formaldeide. L'inclusione in paraffina consente la conservazione a lungo termine a temperatura ambiente, mantenendo l'integrità istologica e molecolare per le analisi retrospettive.
Come si deparaffina un campione FFPE?
La deparaffinizzazione prevede lavaggi sequenziali con solventi per rimuovere la paraffina: in genere due incubazioni con xilene, seguite da due lavaggi con etanolo (96%). Dopo la centrifugazione e l'essiccazione, il tessuto è pronto per l'estrazione a valle. Questo processo ripristina l'accessibilità del campione per la lisi e la digestione enzimatica.
Qual è lo scopo dell'incubazione termica?
L'incubazione termica si riferisce all'esposizione controllata di un campione a una temperatura definita per un periodo di tempo specifico per indurre cambiamenti biochimici o fisici. In proteomica, è comunemente usata per denaturare le proteine, invertire i legami incrociati della formaldeide nei tessuti FFPE o migliorare l'efficacia del tampone di lisi. La temperatura e la durata sono parametri critici, adattati alla reazione target o al tipo di campione.
Che cos'è la digestione SP3?
Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation (SP3) è un flusso di lavoro proteomico basato su microsfere. Utilizza microsfere paramagnetiche per legare le proteine, consentendo un'efficiente pulizia, concentrazione e digestione enzimatica on-bead in condizioni denaturanti. SP3 riduce al minimo la perdita di campioni ed è altamente compatibile con campioni a basso input e FFPE.
Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni da laboratorio a dimensioni industriali.