Preparazione di campioni FFPE a elevata capacità di trattamento: estrazione delle proteine e taglio degli acidi nucleici
Con il sonicatore a elevata capacità di trattamento UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics affronta le sfide della preparazione di tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE). Scoprite come gli ultrasuoni consentono di trattare un gran numero di campioni FFPE per la deparaffinizzazione, la lisi tissutale, l’omogeneizzazione, l’estrazione delle proteine e il taglio di DNA/RNA! Approfittate della preparazione a ultrasuoni dei tessuti FFPE – trattando un gran numero di campioni in piastre multipozzetto! Ottenete campioni di alta qualità e trattate un elevato numero di campioni per risultati di ricerca affidabili! E, non da ultimo, risparmiate tempo e denaro!
Preparazione dei campioni FFPE facilitata dalla sonicazione a elevata capacità di trattamento
La fissazione in formalina e l’inclusione in paraffina (FFPE) sono il metodo più comune per conservare e archiviare tessuti solidi. L’estrazione di biomolecole da campioni di tessuto FFPE presenta spesso sfide significative a causa della qualità dei campioni conservati. Questi campioni, che costituiscono risorse preziose per la biologia molecolare e la ricerca clinica, offrono una ricca fonte di informazioni biologiche per studi retrospettivi e per la validazione di biomarcatori diagnostici. Tuttavia, il processo di fissazione in formalina e inclusione in paraffina, pur preservando l’architettura e la morfologia del tessuto, complica l’estrazione di acidi nucleici e proteine di alta qualità. La formalina induce la formazione di legami crociati tra acidi nucleici e proteine, causando frammentazione molecolare e modificazioni chimiche. Scoprite come il sonicatore a elevata capacità di trattamento UIP400MTP supera le sfide della preparazione dei campioni FFPE!
Sonicatore per una preparazione efficiente dei campioni FFPE
- Flusso di lavoro facile da usare: processi semplificati e intuitivi.
- Deparaffinizzazione, estrazione delle proteine, taglio di DNA / RNA
- Trattamento rapido con elevata capacità di trattamento dei campioni: gestione efficiente delle piastre multipozzetto.
- Deparaffinizzazione efficace: migliore solubilizzazione delle proteine.
- Solventi non tossici: evita l’uso di solventi organici nocivi come lo xilene.
Sonicatore UIP400MTP a elevata capacità di trattamento per il trattamento di un elevato numero di campioni FFPE in piastre multipozzetto
Progressi nelle tecniche di estrazione delle proteine dai tessuti FFPE
Hielscher Ultrasonics affronta le sfide della preparazione di campioni FFPE a elevata capacità di trattamento. La sonicazione impiega onde ultrasoniche per generare vibrazioni meccaniche e cavitazione focalizzata, disgregando efficacemente le strutture cellulari e migliorando la solubilizzazione delle biomolecole. Questa tecnica si è diffusa grazie alla sua capacità di aumentare l’efficienza e la resa dell’estrazione di acidi nucleici e proteine dai tessuti FFPE, nonché del taglio di DNA e RNA per la preparazione delle librerie. È molto importante sottolineare che la sonicazione con il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP mantiene l’integrità di queste biomolecole per le applicazioni successive.
Taglio degli acidi nucleici mediante sonicazione a elevata capacità di trattamento
Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP, destinato a contesti con elevata capacità di trattamento dei campioni, porta la preparazione dei campioni FFPE a un nuovo livello. Questo metodo di sonicazione in piastre multipozzetto offre una soluzione efficiente e affidabile per il trattamento simultaneo di più campioni. Facilita l’estrazione rapida e riproducibile di DNA, RNA e proteine, fondamentali per diverse tecniche analitiche, tra cui il sequenziamento di nuova generazione (NGS), la PCR quantitativa e le analisi proteomiche. L’ottimizzazione dei parametri di sonicazione, come ampiezza, durata e temperatura, migliora ulteriormente la qualità e la quantità delle biomolecole estratte.
Il sonicatore UIP400MTP per piastre multipozzetto offre vantaggi significativi per la frammentazione e il taglio di DNA e RNA da tessuti FFPE. Una delle caratteristiche più rilevanti di questo sistema è la sua capacità di ottenere frammenti di DNA e RNA con una distribuzione dimensionale ristretta, consentendo di regolare con precisione l’intensità della sonicazione per ottenere frammenti corti di 150–200 coppie di basi (bp) o frammenti più lunghi di 15–20 kilocoppie di basi (kbp). Questa versatilità rende UIP400MTP indispensabile sia per le applicazioni di sequenziamento a letture corte sia per quelle a letture lunghe, garantendo risultati di alta qualità per il sequenziamento di nuova generazione (NGS) e il sequenziamento dell’intero genoma (WGS). Il controllo preciso delle dimensioni dei frammenti è fondamentale per i ricercatori di tutti i settori della genomica, poiché consente di preparare i campioni secondo le specifiche.
Contattateci per soluzioni avanzate per i tessuti FFPE
Scoprite il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP per il recupero efficiente di biomolecole da campioni FFPE, mantenendo l’integrità degli acidi nucleici e delle proteine estratti e garantendo la riproducibilità dei risultati. Questa tecnologia si integra perfettamente con altri flussi di lavoro preparativi e analitici, semplificando e migliorando le indagini molecolari che utilizzano archivi di tessuti FFPE.
Fissativi e loro effetti
La fissazione è una fase cruciale della preparazione dei campioni che preserva le strutture cellulari, arresta le reazioni biochimiche e previene la degradazione. Si impiegano diversi fissativi a seconda dei requisiti sperimentali specifici. I due fissativi più comuni sono la formaldeide e la paraformaldeide, che formano legami crociati tra proteine e acidi nucleici, preservando la morfologia e l’antigenicità di cellule e tessuti. Altri fissativi, come etanolo, metanolo e glutaraldeide, sono utilizzati per applicazioni specifiche.
I fissativi a base di formaldeide e paraformaldeide formano ponti metilenici tra i gruppi amminici, determinando la formazione di legami crociati tra le proteine. Questo processo immobilizza efficacemente i componenti cellulari, preservandone l’integrità durante le successive fasi di analisi. Gli effetti di questi fissativi possono essere influenzati da fattori quali concentrazione, pH e temperatura; l’ottimizzazione di questi parametri è fondamentale per garantire una conservazione ottimale delle strutture cellulari.
Vantaggi della preparazione a ultrasuoni dei campioni FFPE
La sonicazione è una tecnica potente per disgregare cellule e tessuti fissati, superiore alle tecniche convenzionali. Offre diversi vantaggi rilevanti rispetto ai metodi di lisi tradizionali:
- Velocità ed efficienza: La lisi a ultrasuoni consente una rapida disgregazione di cellule e tessuti, riducendo significativamente i tempi di trattamento rispetto ai metodi di lisi meccanici o chimici. Le onde sonore ad alta frequenza generate dalla sonda a ultrasuoni creano forze meccaniche di taglio, causando la disgregazione delle strutture cellulari fissate. Questa disgregazione rapida ed efficiente consente ai ricercatori di trattare grandi volumi di campioni in tempi brevi.
- Delicatezza e regolabilità: La lisi a ultrasuoni offre un meccanismo di disgregazione delicato che riduce al minimo i danni alle biomolecole sensibili, come proteine, acidi nucleici ed enzimi. A differenza dei metodi meccanici che generano calore o forze di taglio eccessivi, la lisi a ultrasuoni utilizza la cavitazione controllata per disgregare le cellule preservando l’integrità e la funzionalità dei componenti intracellulari.
- Versatilità: La lisi a ultrasuoni può essere applicata a campioni trattati con diversi fissativi, consentendo ai ricercatori di lavorare con un’ampia gamma di campioni fissati. Che si utilizzi formaldeide, paraformaldeide o fissativi alternativi, la lisi a ultrasuoni garantisce costantemente una disgregazione efficiente, assicurando un recupero ottimale dei componenti cellulari.
- Resa e qualità elevate: La lisi a ultrasuoni facilita il recupero di componenti cellulari intatti con rese elevate grazie alla sua capacità di disgregare uniformemente cellule e tessuti fissati. Ciò consente alle applicazioni successive, come l’analisi delle proteine, l’estrazione degli acidi nucleici e i saggi enzimatici, di fornire risultati affidabili e riproducibili.
- Compatibilità con l’automazione: La lisi a ultrasuoni può essere facilmente integrata in sistemi automatizzati, consentendo un’elevata capacità di trattamento dei campioni. Questa compatibilità permette ai ricercatori di semplificare il flusso di lavoro e aumentare la produttività, soprattutto negli studi su larga scala.
Sonicatore per piastre a 96 pozzetti UIP400MTP per la sonicazione di piastre per microtitolazione e multipozzetto
La lisi a ultrasuoni ha rivoluzionato la disgregazione di cellule e tessuti fissati, offrendo numerosi vantaggi rispetto ai metodi di lisi tradizionali. La velocità, l’efficienza, la selettività, la versatilità, la resa elevata e la compatibilità con l’automazione la rendono uno strumento indispensabile nella ricerca in biologia molecolare e biotecnologia. Proponendo sia sonicatori senza contatto sia sonicatori a sonda, Hielscher Ultrasonics offre l’omogeneizzatore a ultrasuoni più adatto alla vostra applicazione nelle scienze della vita. Che desideriate trattare campioni singoli, più campioni o un numero molto elevato di campioni simultaneamente, vi offriremo il sonicatore più adatto alle vostre esigenze di ricerca e diagnostica.
Scoprite di più sui sonicatori senza contatto Hielscher per la preparazione simultanea di più campioni e con elevata capacità di trattamento!
- investimento una tantum
- utilizzate i vostri materiali di consumo
- nessun costo ricorrente per accessori e materiali di consumo proprietari
- elevata capacità di trattamento dei campioni
- controllo di precisione
- tecnologia all’avanguardia
- affidabilità e robustezza
- controllo del processo regolabile e preciso
- qualità industriale: può funzionare in continuo 24/7
- facile e sicuro da utilizzare
- manutenzione ridotta
Scoprite di più sulle applicazioni dei sonicatori nelle scienze della vita!
Sonicatore per piastre UIP400MTP per qualsiasi piastra a 96 pozzetti, piastra per microtitolazione e piastra multipozzetto.
Progettazione, produzione e consulenza – Qualità Made in Germany
I sonicatori Hielscher sono noti per i loro elevatissimi standard di qualità e progettazione. La robustezza e la facilità d’uso consentono una semplice integrazione dei nostri sonicatori negli impianti industriali. I sonicatori Hielscher affrontano con facilità condizioni difficili e ambienti impegnativi.
Hielscher Ultrasonics è un’azienda certificata ISO e pone particolare attenzione ai sonicatori ad alte prestazioni dotati di tecnologia all’avanguardia e caratterizzati dalla facilità d’uso. Naturalmente, i sonicatori Hielscher sono conformi ai requisiti CE e soddisfano i requisiti di UL, CSA e RoHs.
Contattateci! / Chiedeteci informazioni!
Sonicatore UIP400MTP: Preparazione di campioni FFPE a elevata capacità di trattamento in piastre multipozzetto
Domande frequenti
Di seguito rispondiamo alle domande frequenti relative alla preparazione dei tessuti FFPE e alla sonicazione dei campioni FFPE.
Come si prepara il tessuto FFPE?
Fasi della preparazione dei tessuti FFPE: la manipolazione e il trattamento accurati del tessuto fresco sono fondamentali per ottenere campioni FFPE di alta qualità. Garantire la conservazione dell’architettura cellulare, degli acidi nucleici e delle proteine è essenziale per analisi successive accurate. Ogni fase – dal prelievo all’inclusione – richiede precisione per mantenere l’integrità del campione per diverse analisi, tra cui l’esame istologico, l’immunoistochimica e gli studi molecolari. Se eseguito correttamente, questo processo di fissazione e inclusione assicura che il tessuto conservato rispecchi accuratamente lo stato in vivo, consentendo risultati diagnostici e di ricerca affidabili.
Vi illustriamo le 6 fasi principali del processo di inclusione dei campioni di tessuto FFPE.
- Prelievo del tessuto
Le biopsie da mammiferi viventi e le colture tissutali sono entrambe fonti idonee per ottenere tessuto fresco per la preparazione di campioni FFPE.
È importante utilizzare una tecnica asettica: impiegate strumenti e guanti sterili per evitare contaminazioni. Idealmente, prelevate i tessuti in un ambiente sterile, come una sala operatoria o una cappa a flusso laminare.
Poiché il campione è molto fragile, è essenziale manipolarlo con delicatezza: riducete al minimo i ritardi nel trattamento e avviate le successive fasi di trattamento del tessuto immediatamente dopo l’escissione. Questo è fondamentale per prevenire autolisi e degradazione. Mantenete il tessuto a temperatura ambiente; evitate il congelamento, poiché può causare la formazione di cristalli di ghiaccio e danni al tessuto. - Fissazione del tessuto
Innanzitutto, il tessuto viene trattato con una soluzione fissativa: utilizzate formalina tamponata neutra al 10% (NBF), equivalente a formaldeide al 4% in acqua, tamponata a pH neutro.
Immergete completamente il tessuto nella formalina. Assicurate un rapporto volumetrico fissativo:tessuto di almeno 10:1. Il tempo di fissazione varia generalmente da 6 a 24 ore, a seconda del tipo e delle dimensioni del tessuto. È importante che il fissativo possa penetrare completamente nel tessuto. Tuttavia, una fissazione eccessiva può provocare la formazione di legami crociati che complicano il recupero antigenico, mentre una fissazione insufficiente può causare una scarsa conservazione del tessuto. - Rifilatura del tessuto
In secondo luogo, rifilate il tessuto fino a uno spessore di circa 3–5 mm per consentire un’adeguata penetrazione del fissativo. Assicurate il corretto orientamento del tessuto per includere le strutture istologiche rilevanti. Questo facilita il processo di estrazione quando il tessuto viene successivamente utilizzato per l’analisi.
- Trattamento del campione fissato
Ora il tessuto fissato deve essere disidratato: dopo la fissazione, il tessuto deve essere disidratato per garantire una completa penetrazione della paraffina. Fate passare il tessuto attraverso una serie di soluzioni di etanolo a concentrazione crescente (70%, 80%, 90% e 100%) per rimuovere l’acqua.
Diafanizzazione con xilene: la paraffina è insolubile in acqua, ma solubile nello xilene. Pertanto, l’acqua presente nel tessuto deve essere sostituita con xilene. Tuttavia, lo xilene stesso è insolubile in acqua ma solubile in alcol, rendendo necessaria una fase intermedia in cui l’acqua viene prima sostituita con alcol. Immergete il tessuto nello xilene o in un sostituto dello xilene per rimuovere l’etanolo e preparare il tessuto all’infiltrazione con paraffina.
Infiltrazione con paraffina: immergete il tessuto nella paraffina fusa, assicurando un’infiltrazione completa. Questa fase prevede generalmente diversi cambi di paraffina per garantire un’impregnazione completa. - Inclusione del tessuto
In questa fase, il tessuto viene inglobato in un blocchetto: posizionate il tessuto in uno stampo con l’orientamento desiderato e versatevi sopra la paraffina fusa. Lasciate solidificare la paraffina raffreddandola a temperatura ambiente o su una piastra fredda.
- Sezionamento e montaggio
Microtomia: per sezionare il tessuto incluso, utilizzate un microtomo per tagliare sezioni sottili (generalmente di 4–5 micrometri) dal blocchetto di paraffina. Il campione viene quindi montato, posizionando le sezioni su vetrini per la successiva colorazione e analisi microscopica.
Infine, controllate la qualità istologica: valutate le prime sezioni al microscopio per verificare che la fissazione e il trattamento siano corretti. Adattate i protocolli secondo necessità in base al tipo di tessuto e alla qualità osservata.
I tessuti FFPE possono essere utilizzati per recuperare RNA, DNA e proteine, nonché per individuare segni di cancro o di altre malattie. Possono essere conservati per anni e sono una risorsa essenziale per l’utilizzo dei campioni tissutali da parte di ricercatori e medici nella diagnosi e nella ricerca.
Quali sono i problemi e le sfide comuni dei tessuti FFPE?
I campioni di tessuto fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) sono ampiamente utilizzati nella ricerca e nella diagnostica, ma presentano diverse sfide e problemi comuni:
- Degradazione delle biomolecole: Una fissazione prolungata può provocare la degradazione di DNA, RNA e proteine, rendendo difficile estrarre acidi nucleici o proteine di alta qualità per le applicazioni successive. Una fissazione corretta, evitando sia quella insufficiente sia quella eccessiva, è essenziale per la conservazione del tessuto.
- Mascheramento antigenico: Il processo di fissazione può mascherare i siti antigenici, riducendo l’efficacia del legame degli anticorpi nell’immunoistochimica e in altri saggi immunologici. Ciò richiede spesso il recupero antigenico, una procedura che elimina il mascheramento di un epitopo e ripristina il legame epitopo-anticorpo. Tuttavia, non sempre è possibile ripristinare completamente l’antigenicità.
- Qualità variabile della fissazione: Le differenze nei tempi e nelle condizioni di fissazione possono determinare una qualità non uniforme dei campioni, compromettendo la riproducibilità e la comparabilità dei risultati. Utilizzate protocolli di fissazione affidabili ed evitate una fissazione insufficiente o eccessiva.
- Danni e frammentazione del DNA: La fissazione in formalina dei campioni FFPE può causare diversi tipi di danni al DNA, tra cui la deaminazione della citosina (mutazioni da C a T), danni ossidativi (ad esempio, 8-oxo-guanina che determina mutazioni da G a T), nonché alterazioni fisiche come interruzioni a singolo filamento, lacune e siti abasici che ostacolano l’attività della DNA polimerasi. Il processo di fissazione in formalina può causare la frammentazione del DNA, complicando analisi genetiche e genomiche come la PCR e il sequenziamento.
- Qualità dell’RNA: L’RNA estratto dai tessuti FFPE è spesso frammentato e modificato chimicamente, rendendo difficile eseguire analisi trascrittomiche di alta qualità.
- Modificazioni delle proteine: La formalina può indurre modificazioni chimiche nelle proteine, alterandone la struttura e la funzione, con possibili interferenze nelle analisi proteomiche.
- Artefatti del trattamento dei campioni: Durante il processo di inclusione e sezionamento, le sollecitazioni meccaniche e il calore possono introdurre artefatti e causare ulteriori danni al tessuto.
- Variabilità tra lotti: Le variazioni nei protocolli di fissazione e inclusione tra lotti diversi possono determinare una variabilità significativa dei risultati, complicando i confronti tra studi.
- Problemi di conservazione: La conservazione a lungo termine dei blocchetti FFPE può provocare nel tempo ulteriore degradazione e perdita dell’integrità degli acidi nucleici, compromettendo l’idoneità dei campioni d’archivio per gli studi retrospettivi.
Formazione di legami crociati: La fissazione in formalina provoca la formazione di legami crociati tra proteine e acidi nucleici, che possono ostacolare l’analisi molecolare e compromettere l’accuratezza dell’immunoistochimica e di altri saggi.
L’utilizzo di protocolli ottimizzati, la manipolazione accurata dei campioni e l’applicazione di tecniche avanzate contribuiscono a migliorare la qualità e l’affidabilità dei dati ottenuti dai tessuti FFPE.
Qual è la differenza tra tessuto FFPE e tessuto congelato?
Il tessuto FFPE (fissato in formalina e incluso in paraffina) viene conservato utilizzando la formalina per fissare il tessuto e successivamente includendolo in paraffina, consentendo la conservazione a lungo termine a temperatura ambiente e mantenendo la morfologia tissutale. Il tessuto congelato, invece, viene rapidamente conservato mediante congelamento, che preserva meglio l’integrità degli acidi nucleici e delle proteine, ma richiede la conservazione a temperature molto basse.
Quali sostanze chimiche vengono utilizzate per l’inclusione FFPE?
Le sostanze chimiche utilizzate per l’inclusione FFPE comprendono normalmente la formalina per la fissazione e la paraffina per l’inclusione. Per l’inclusione FFPE, i tessuti vengono generalmente fissati utilizzando formalina tamponata neutra al 10% (v/v) (FA) oppure una soluzione di formaldeide al 4% (w/v) (PFA), preparata di fresco a partire da paraformaldeide in polvere. La formalina, una soluzione di formaldeide in acqua, viene tamponata a pH neutro per preservare la morfologia tissutale e prevenire una formazione eccessiva di legami crociati. Anche la soluzione a base di paraformaldeide garantisce una fissazione efficace mediante la formazione di legami crociati tra le proteine, stabilizzando così la struttura del tessuto per la successiva inclusione in paraffina. Queste sostanze chimiche sono essenziali per mantenere l’integrità e la morfologia del tessuto durante il processo di fissazione e inclusione.
Come si rimuove la paraffina dai campioni FFPE?
Per rimuovere la paraffina dai campioni FFPE, le sezioni tissutali vengono generalmente sottoposte a una serie di lavaggi con xilene, seguiti dalla reidratazione attraverso una serie di alcoli a concentrazione decrescente e infine acqua. Poiché lo xilene è altamente tossico e comporta rischi per la salute, come problemi respiratori, irritazione cutanea e potenziali effetti a lungo termine in caso di esposizione ripetuta, la rimozione della paraffina mediante ultrasuoni sta emergendo come un’alternativa promettente in molti laboratori. Questo metodo utilizza onde ultrasoniche intense per rimuovere la paraffina in modo efficiente e sicuro senza ricorrere a solventi tossici come lo xilene, riducendo così il rischio per il personale di laboratorio e creando un ambiente di lavoro più sicuro.
Per quanto tempo devo fissare i tessuti per ottenere campioni FFPE di buona qualità?
Le raccomandazioni generali sulla durata della fissazione suggeriscono solitamente di fissare i campioni tissutali in formalina per 24–48 ore. Questa durata è generalmente sufficiente per preservare la morfologia tissutale e le strutture cellulari, riducendo al minimo la fissazione eccessiva, che può provocare un’eccessiva formazione di legami crociati e la degradazione degli acidi nucleici e delle proteine. Tuttavia, il tempo di fissazione ottimale può variare a seconda delle dimensioni e del tipo di tessuto, con campioni più piccoli o più delicati che richiedono tempi di fissazione più brevi. È fondamentale bilanciare una fissazione adeguata a prevenire l’autolisi e la degradazione del tessuto con la necessità di evitare una fissazione prolungata che potrebbe complicare le successive analisi molecolari.