Estrazione della matrice extracellulare con il sonicatore per piastre a 96 pozzetti UIP400MTP

I metodi tradizionali di estrazione della matrice extracellulare (EM) spesso prevedono più passaggi per disgregare la matrice del biofilm. Tuttavia, queste tecniche possono richiedere molto tempo e fornire risultati poco uniformi, determinando una variabilità dei risultati. Con il sonicatore per piastre a 96 pozzetti UIP400MTP, il processo di estrazione dell’EM è notevolmente facilitato e consente una disgregazione del biofilm altamente efficiente, precisa e uniforme in formati a elevata capacità di trattamento dei campioni. L’UIP400MTP utilizza ultrasuoni focalizzati per generare una cavitazione controllata, disgregando efficacemente la matrice del biofilm e preservando al contempo la vitalità e l’integrità delle cellule inglobate nel biofilm. L’utilizzo dell’UIP400MTP migliora la riproducibilità e l’accuratezza dei saggi successivi, quali analisi metabolomiche e proteomiche, test di vitalità e studi di sensibilità agli antimicrobici. Semplificando l’estrazione dell’EM, l’UIP400MTP consente ai ricercatori di ottenere risultati uniformi e di alta qualità, offrendo una comprensione più approfondita delle dinamiche del biofilm e delle sue interazioni con agenti esterni.

Estrazione della matrice extracellulare

La matrice extracellulare (EM) è un componente fondamentale dei biofilm formati da microrganismi come Candida albicans. Composta da polisaccaridi, proteine, lipidi e DNA extracellulare, l’EM conferisce integrità strutturale, media l’adesione alle superfici e contribuisce significativamente alla resistenza agli antimicrobici. L’estrazione e l’analisi dell’EM sono essenziali per comprendere la biologia del biofilm, chiarire i meccanismi di resistenza ai farmaci e identificare nuovi bersagli terapeutici.

Protocollo per l’estrazione della matrice extracellulare (EM) dai biofilm di Candida albicans mediante UIP400MTP

Questo protocollo si concentra sull’estrazione della matrice extracellulare (EM) dei biofilm statici di Candida albicans. Prevede l’integrazione del sonicatore UIP400MTP per sostituire i passaggi tradizionali di raschiamento o trattamento enzimatico, migliorando l’efficienza e la riproducibilità.

Materiali necessari

Istruzioni passo passo per l’estrazione dell’EM

1. Formazione del biofilm statico
   Per i biofilm statici, inoculare C. albicans nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti utilizzando il terreno RPMI-1640. Ogni pozzetto deve contenere lo stesso volume di inoculo (ad esempio, 200 µL per pozzetto).
   Incubare la piastra a 37°C in condizioni statiche per 24 ore per consentire la formazione del biofilm sulle superfici dei pozzetti.
2. Preparazione del biofilm per l’estrazione
   Dopo l’incubazione, aspirare delicatamente ed eliminare il terreno esausto da ciascun pozzetto senza alterare il biofilm.
   Risciacquare accuratamente ogni pozzetto con PBS sterile (ad esempio, 200 µL) per rimuovere le cellule debolmente aderenti e i detriti planctonici. Ripetere questo passaggio due volte.
   Aggiungere PBS fresco o il tampone di estrazione (ad esempio, 200 µL) a ciascun pozzetto per prepararlo alla sonicazione.
3. Sonicazione con UIP400MTP
   Posizionare la piastra a 96 pozzetti contenente PBS o tampone di estrazione nella vaschetta del sonicatore UIP400MTP. Per posizionare correttamente la piastra multipozzetto, seguire le istruzioni del manuale.
   Sonicare per 5–6 minuti con un’impostazione delicata (ampiezza del 60%, modalità a impulsi), assicurando una disgregazione uniforme della struttura del biofilm e il rilascio dei componenti dell’EM.
   Utilizzare il controllo della temperatura del sonicatore UIP400MTP (sensore di temperatura e relative impostazioni) per evitare un riscaldamento eccessivo o danni ai campioni.
4. Trattamento con resina a scambio cationico (CER)
   Trasferire il liquido sonicato da ciascun pozzetto in una nuova piastra a 96 pozzetti.
   Aggiungere a ciascun pozzetto un volume doppio di sospensione di CER (preparata in PBS o tampone) (ad esempio, 400 µL di volume totale per pozzetto).
   Sigillare la piastra e incubarla su un agitatore o un rotatore per piastre a 400 rpm per 3 ore per consentire il legame e l’isolamento dei componenti dell’EM.
5. Separazione e filtrazione
   Centrifugare la piastra a 2.000 × g per 10 minuti per separare la resina e le cellule dal surnatante.
   Trasferire con attenzione il surnatante contenente l’EM da ciascun pozzetto in una nuova piastra a 96 pozzetti.
   Filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,22 µm utilizzando un sistema con collettore per filtrazione sottovuoto per piastre o un sistema equivalente, per ottenere un estratto di EM pulito.
6. Analisi dell’EM
   Utilizzare tecniche come UPLC-Q-TOF-MS per la profilazione non mirata dei metaboliti, oppure impiegare saggi specifici (ad esempio, BCA per le proteine e kit per la quantificazione di trigliceridi e carboidrati) per caratterizzare i componenti dell’EM.

Estrazione della matrice extracellulare a elevata capacità di trattamento dei campioni

L’elevata efficienza dell’estrazione della matrice extracellulare (EM) con il sonicatore UIP400MTP ha rivoluzionato la preparazione dei campioni per saggi che richiedono un’analisi accurata delle proprietà del biofilm. L’UIP400MTP utilizza onde ultrasoniche per disgregare in modo preciso e uniforme la matrice del biofilm, consentendo il rilascio efficace dei componenti dell’EM e preservando al contempo la vitalità e l’integrità delle cellule. Questo approccio migliora significativamente l’affidabilità di saggi quali test di vitalità del biofilm, studi proteomici e metabolomici e valutazioni della sensibilità agli antimicrobici.

Per i saggi di recupero del biofilm, come il conteggio delle unità formanti colonia (CFU), l’estrazione dell’EM con l’UIP400MTP garantisce un accesso senza ostacoli dei reagenti alle cellule inglobate nel biofilm. Analogamente, le analisi proteomiche e metabolomiche, come UPLC-Q-TOF-MS, beneficiano dell’isolamento ad alta resa di proteine, lipidi e metaboliti. L’UIP400MTP supporta inoltre test precisi di sensibilità agli antimicrobici, consentendo una determinazione accurata dei valori di MIC e MBEC del biofilm. Inoltre, l’estrazione efficiente facilitata dall’UIP400MTP agevola i saggi di attività enzimatica, la quantificazione dei componenti e gli studi strutturali, offrendo informazioni preziose sul ruolo delle matrici extracellulari nell’architettura del biofilm, nell’adesione e nei meccanismi di resistenza.

Questo metodo di estrazione riproducibile, a elevata capacità di trattamento dei campioni, ottimizza la preparazione dell’EM, garantendo risultati superiori in un’ampia gamma di saggi relativi al biofilm.