Ultrahangos kezelés a sejtlízishez: sejtfeltárás és extrakció
Az ultrahangos sejtlízis a modern biotechnológiai laboratóriumokban széles körben alkalmazott minta-előkészítési technika. Elsődleges célja a sejtmembránok vagy a teljes sejtek feltárása az intracelluláris összetevők, például fehérjék, nukleinsavak vagy sejtalkotók felszabadítása érdekében. A mindennapi laboratóriumi munkában ez azt jelenti, hogy az ultrahangos kezelés a szabályozott sejtfeltárás és a biomolekulák hatékony extrakciójának standard módszere. Az ultrahangos kezelőberendezések legfontosabb előnye, hogy pontosan szabályozhatók velük a kritikus folyamatparaméterek, köztük az ultrahang intenzitása, az impulzusüzem és a hőmérséklet-szabályozás. Ez a szabályozhatóság lehetővé teszi a kutatók számára a megbízható lízis elérését, miközben minimálisra csökkenti az érzékeny biomolekulák termikus vagy mechanikai károsodását, így kíméletes, mégis rendkívül hatékony extrakciós folyamatot eredményez.
Sejtlízis ultrahangos kezelőberendezésekkel
Az ultrahangos sejtlízis akusztikus kavitációval tárja fel a sejtmembránokat és szabadítja fel az intracelluláris molekulákat. A Hielscher Ultrasonics a klasszikus szondás ultrahangos kezelőberendezés mellett többminta-kezelő ultrahangos berendezéseket is kínál steril feldolgozáshoz: a VialTweeter több cső és fiola kezelésére, a 96 lyukú lemezekhez készült UIP400MTP ultrahangos kezelőberendezés pedig standard mikrolemezekhez használható.
A Hielscher Ultrasonics nagy teljesítményű, érintkezésmentes ultrahangos kezelőberendezéseket kínál minta-előkészítéshez és klinikai elemzéshez. A többlyukú lemezekhez készült UIP400MTP ultrahangos kezelőberendezés, a VialTweeter, a CupHorn és a GDmini2 átfolyó rendszerű ultrahangos kezelőberendezés steril körülmények között dolgozzák fel a mintákat.
UP100H (100 watt) és UP400St (400 watt) ultrahangos homogenizátorok: ultrahangos kezelés sejtlízishez és extrakcióhoz.
Ultrahangos homogenizátorok sejtlízishez és extrakcióhoz
| Az ultrahangos készülék típusa | Fő alkalmazási terület | Mintatérfogat | Jellemző felhasználás | Előnyök | Példák a modellekre |
|---|---|---|---|---|---|
| Szondás ultrahangos kezelőberendezések | Egyetlen minta ultrahangos kezelése | 0,1 mL-től ~1000 mL-ig | Sejtlízis, fehérjeextrakció, DNS/RNS-fragmentálás | Az energia pontos szabályozása; különféle szonotródák; optimális kis és közepes méretű mintákhoz | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Több lezárt fiola párhuzamos feldolgozása | 8–10 fiola (egyenként ~1–20 mL) | Több sejtszuszpenzió standardizált lízise | Egyenletes ultrahangos kezelés; elkerüli a keresztszennyeződést; reprodukálható eredmények | VialTweeter, CupHorn |
| Ultrahangos kezelőberendezés 96 lyukú lemezekhez | Többlyukú és mikrotiterlemezek ultrahangos kezelése | Mikrolemez-formátum | Nagy mintaáteresztő képességű szűrővizsgálatok, proteomika, sejtvizsgálatok | Egyidejű, egyenletes ultrahangos kezelés a lyukakban; ideális több mintát feldolgozó munkafolyamatokhoz | UIP400MTP |
| Átfolyó cellás reaktorok | Folyamatos ultrahangos kezelés nagyobb térfogatokhoz | >1 L, méretezhető | Ipari léptékű sejtfeltárás, kivonatok előállítása | Folyamatos feldolgozás; méretezhető; teljes folyamatszabályozás (amplitúdó, nyomás, hőmérséklet) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + átfolyó cella |
| Steril / közvetett ultrahangos kezelőrendszerek | Szennyeződésmentes mintafeldolgozás | A fiolától/csőtől/mikrolemeztől függ | Érzékeny minták, steril környezetek, szabályozási előírások hatálya alá tartozó környezetek | Nincs érintkezés a szondával; elkerüli a minták közötti anyagátvitelt; minimális tisztítási ráfordítás | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Az ultrahangos kezelés előnyei a sejtlízisben
Más sejtlízis- és extrakciós módszerekkel összehasonlítva az ultrahangos sejtlízis számos előnnyel rendelkezik:
- Gyorsaság: Az ultrahangos sejtlízis és extrakció gyors módszer, amely másodpercek alatt képes feltárni a sejteket. Ez sokkal gyorsabb más módszereknél, például a homogenizálásnál, a fagyasztás–felolvasztásnál vagy a gyöngyös őrlésnél.
- Hatékonyság: Az ultrahangos sejtlízis és extrakció kis vagy nagy minták, illetve több minta egyidejű kezelésére is használható, így hatékonyabb azoknál a módszereknél, amelyek kis minták egyenkénti feldolgozását igénylik.
- Vegyszermentesség: Az ultrahangos sejtlízis és extrakció nem invazív módszer, amely nem igényel agresszív vegyszereket vagy enzimeket. Ez ideálissá teszi olyan alkalmazásokhoz, amelyekben meg kell őrizni a sejttartalom épségét. A minták nem kívánt szennyeződése elkerülhető.
- Nagy hozam: Az ultrahangos sejtlízis és extrakció nagy hozammal képes kinyerni a sejttartalmat, beleértve a DNS-t, az RNS-t és a fehérjéket. Ennek oka, hogy a nagyfrekvenciás hanghullámok feltárják a sejtfalakat, és a sejttartalmat a környező oldatba szabadítják fel.
- Hőmérséklet-szabályozás: A fejlett ultrahangos kezelőberendezések lehetővé teszik a minta hőmérsékletének pontos szabályozását. A Hielscher digitális ultrahangos kezelőberendezései csatlakoztatható hőmérséklet-érzékelővel és hőmérséklet-monitorozó szoftverrel vannak felszerelve.
- Reprodukálhatóság: Az ultrahangos sejtlízis protokolljai könnyen reprodukálhatók, és egyszerű lineáris léptéknöveléssel akár eltérő, nagyobb vagy kisebb mintatérfogatokhoz is hozzáigazíthatók.
- Sokoldalúság: Az ultrahangos sejtlízis és extrakció számos sejttípus extrakciójára használható, beleértve a baktériumokat, élesztőket, gombákat, növényi és emlőssejteket. Különféle molekulatípusok, többek között fehérjék, DNS, RNS és lipidek extrakciójára is alkalmazható.
- Számos minta egyidejű előkészítése: A Hielscher Ultrasonics több megoldást kínál számos minta kényelmes feldolgozására, pontosan azonos folyamatkörülmények között. Ez rendkívül hatékonnyá és időtakarékossá teszi a lízist és extrakciót magában foglaló minta-előkészítési lépést.
- Egyszerű használat: Az ultrahangos sejtlízishez és extrakcióhoz használt berendezések könnyen kezelhetők, és minimális betanítást igényelnek. A berendezések gazdaságosak is, mivel egyszeri beruházást jelentenek, és nincs szükség az eldobható fogyóeszközök ismételt beszerzésére. Ez a kutatók és laboratóriumok széles köre számára teszi vonzóvá őket.
Összességében az ultrahangos sejtlízis és extrakció gyors, hatékony, pontosan szabályozható és sokoldalú módszer a sejttartalom kinyerésére. Az alternatív módszerekkel szembeni előnyei vonzó választássá teszik számos kutatási és ipari alkalmazáshoz.
Az ultrahangos sejtlízis működési elve
Az ultrahangos sejtlízis és extrakció nagyfrekvenciás hanghullámokkal tárja fel a sejteket és nyeri ki azok tartalmát. A hanghullámok nyomásváltozásokat hoznak létre a környező folyadékban, amelyek hatására apró buborékok képződnek és omlanak össze a kavitációnak nevezett folyamat során. Ezek a buborékok helyileg rendkívül intenzív mechanikai erőket keltenek, amelyek képesek feltárni a sejteket és azok tartalmát a környező oldatba felszabadítani.
Az ultrahangos kezelőberendezéssel végzett sejtlízis rendszerint a következő lépésekből áll:
- A mintát folyékony puffert tartalmazó csőbe vagy edénybe helyezik.
- Ultrahangos szondát merítenek a mintába, és körülbelül 20–30 kHz frekvenciájú hanghullámokat alkalmaznak.
- Az ultrahanghullámok rezgést és kavitációt okoznak a környező folyadékban, helyi erőket keltve, amelyek feltárják a sejteket és felszabadítják azok tartalmát.
- A mintát centrifugálják vagy szűrik a sejttörmelék eltávolítására, és a kinyert sejttartalmat összegyűjtik a további elemzéshez.
A gyakori lízismódszerek hátrányai
Laboratóriumi munkája során talán már megtapasztalta a hagyományos mechanikai vagy kémiai lízisprotokollokkal végzett sejtlízis nehézségeit.
- Mechanikai lízis: A mechanikai lízismódszereknél, például a mozsárban, mozsártörővel végzett őrlésnél vagy a French-press, gyöngymalom, illetve rotor–sztátor rendszer segítségével végzett homogenizálásnál gyakran hiányoznak a pontos szabályozási és beállítási lehetőségek. Ez azt jelenti, hogy az őrlés és aprítás gyorsan hőt és nyíróerőket kelthet, amelyek károsíthatják a mintát és denaturálhatják a fehérjéket. Ezek a módszerek időigényesek is lehetnek, és nagy mennyiségű kiindulási anyagot igényelhetnek.
- Kémiai lízis: A kémiai lízismódszerek, például a detergensalapú lízis, a lipid kettősréteg megbontásával és a fehérjék denaturálásával károsíthatják a mintát. Több lépést is igényelhetnek, és visszamaradó szennyező anyagokat hagyhatnak, amelyek zavarják a későbbi alkalmazásokat. A detergens optimális adagjának meghatározása további kihívást jelent.
- Fagyasztási–felolvasztási ciklusok: A fagyasztási–felolvasztási ciklusok a sejtmembránok felszakadását okozhatják, az ismételt ciklusok azonban a fehérjék denaturálódását és lebomlását is előidézhetik. Ez a módszer több ciklust is igényelhet, ami időigényes lehet, és gyakran kisebb hozamot eredményez.
- Enzimatikus lízis: Az enzimatikus lízismódszerek bizonyos sejttípusokra lehetnek specifikusak, és több lépést igényelhetnek, ami időigényessé teszi őket. Hulladékot is termelnek, és gondos optimalizálást igényelnek a minta lebomlásának elkerülésére. Az enzimatikus líziskészletek gyakran drágák. Ha a jelenlegi enzimatikus líziseljárása nem ad megfelelő eredményt, az ultrahangos kezelés szinergikus módszerként alkalmazható a sejtfeltárás fokozására.
A hagyományos mechanikai és kémiai sejtlízismódszerekkel összehasonlítva az ultrahangos kezelés rendkívül hatékony és megbízható eszköz a sejtek szétesésének előidézésére, amely lehetővé teszi az ultrahangos kezelési paraméterek teljes szabályozását. Ez nagy szelektivitást biztosít az anyagok felszabadításában és nagy terméktisztaságot eredményez. [vö. Balasundaram et al., 2009]
Minden sejttípushoz alkalmas, és kis és nagy léptékben egyaránt könnyen alkalmazható – mindig szabályozott körülmények között. Az ultrahangos kezelőberendezések könnyen tisztíthatók. Az ultrahangos homogenizátor mindig rendelkezik helyben tisztítási (CIP) és helyben sterilizálási (SIP) funkcióval. A szonotróda tömör titán rezgőtestből áll, amely letörölhető, illetve vízzel vagy oldószerrel átöblíthető (a munkaközegtől függően). Az ultrahangos kezelőberendezések karbantartási igénye robusztus kialakításuknak köszönhetően szinte elhanyagolható.
Ultrahangos lízis és sejtfeltárás
A laboratóriumi minták lízise általában 15 másodperc és 2 perc közötti időt vesz igénybe. Mivel az ultrahangos kezelés intenzitása az amplitúdó és a kezelési idő beállításával, valamint a megfelelő berendezés kiválasztásával nagyon könnyen módosítható, a sejtmembránok a sejtszerkezettől és a lízis céljától függően nagyon kíméletesen vagy nagyon hirtelen is feltárhatók (például a DNS-extrakció kíméletesebb ultrahangos kezelést igényel, míg a baktériumok teljes fehérjeextrakciójához intenzívebb ultrahangos kezelés szükséges). A folyamat hőmérséklete beépített hőmérséklet-érzékelővel monitorozható, és hűtéssel (jégfürdővel vagy hűtőköpennyel ellátott átfolyó cellákkal), illetve impulzusüzemű ultrahangos kezeléssel könnyen szabályozható. Impulzusüzemű ultrahangos kezelés során a rövid, 1–15 másodperc időtartamú ultrahangos impulzusciklusok lehetővé teszik a hő elvezetését és a hűlést a hosszabb köztes szünetekben.
Minden ultrahanggal végzett folyamat teljes mértékben reprodukálható és lineárisan méretezhető.
A VialTweeter egy ultrahangos homogenizátor számos minta egyidejű, egyenletes és gyors, steril előkészítéséhez.
- A sejtszuszpenzió előkészítése: A sejtüledéket homogenizálással teljesen szuszpendálni kell pufferoldatban (olyan pufferoldatot válasszon, amely kompatibilis a későbbi elemzéssel, például az adott kromatográfiás módszerrel). Szükség esetén adjon hozzá lizozimeket és/vagy egyéb adalékokat (ezeknek az elválasztási/tisztítási módszerekkel is kompatibilisnek kell lenniük). Kíméletes ultrahangos kezelés mellett óvatosan keverje/homogenizálja az oldatot, amíg teljes szuszpenzió nem jön létre.
Tudjon meg többet a lizozimek és az ultrahangos kezelés kombinációjának szinergikus hatásairól! - Ultrahangos lízis: Helyezze a mintát jégfürdőbe. A sejtfeltáráshoz kezelje ultrahanggal a szuszpenziót 60–90 másodperces impulzusokban (az ultrahangos kezelőberendezés impulzusüzemét használva).
- Elválasztás: Centrifugálja a lizátumot (például 10 percig, 10 000 x g mellett; 4degC hőmérsékleten). Óvatosan válassza el a felülúszót a sejtüledéktől. A felülúszó a teljes sejtlizátum. A felülúszó szűrése után az oldható sejtfehérjét tartalmazó tisztított folyadékot kap.
Az ultrahangos kezelőberendezések leggyakoribb alkalmazásai a biológiában és a biotechnológiában:
- Sejtkivonat előkészítése
- Élesztők, baktériumok, növényi sejtek, lágy vagy kemény sejtszövetek, nukleinsavanyag feltárása
- Fehérjeextrakció
- Enzimek előkészítése és izolálása
- Antigének előállítása
- DNS-extrakció és/vagy célzott fragmentálás
- Liposzómák előkészítése
A szondás ultrahangos kezelőberendezéssel végzett sejtfeltárás hatékony minta-előkészítési módszer.
Az ultrahang sokrétű alkalmazásai kiterjednek a biotechnológia, a biomérnöki tudományok, a mikrobiológia, a molekuláris biológia, a biokémia, az immunológia, a bakteriológia, a virológia, a proteomika, a genetika, a fiziológia, a sejtbiológia, a hematológia és a botanika területére.
Lízis: a sejtszerkezetek megbontása
A sejteket félig áteresztő plazmamembrán védi, amely foszfolipid kettősrétegből áll (más néven fehérje–lipid kettősréteg; hidrofób lipidek és hidrofil foszformolekulák alkotják, beágyazott fehérjemolekulákkal), és határt képez a sejt belseje (citoplazma) és az extracelluláris környezet között. A növényi és a prokarióta sejteket sejtfal veszi körül. A több réteg vastagságú, cellulózból álló sejtfal miatt a növényi sejtek nehezebben lizálhatók, mint az állati sejtek. A sejt belső részeit, például a sejtalkotókat, a sejtmagot és a mitokondriumot a sejtváz stabilizálja.
A sejtek lízisének célja a sejtalkotók, fehérjék, DNS, mRNS vagy más biomolekulák kinyerése és elválasztása.
A sejtlízis hagyományos módszerei és hátrányaik
A sejtek lizálására számos módszer létezik, amelyek mechanikai és kémiai módszerekre oszthatók. Ezek közé tartozik a detergensek vagy oldószerek használata, a nagy nyomás alkalmazása, valamint a gyöngymalom vagy a French-press használata. E módszerek leginkább problémás hátránya a folyamatparaméterek és ezáltal a hatás nehézkes szabályozása és beállítása.
Az alábbi táblázat a gyakori lízismódszerek fő hátrányait mutatja be:
Táblázat: A sejtlízis hagyományos módszereinek jelentős hátrányai vannak
A lízis menete
A lízis érzékeny folyamat. A lízis során megszűnik a sejtmembrán nyújtotta védelem, ugyanakkor meg kell akadályozni, hogy a nem fiziológiás környezet (a pH-értéktől való eltérés) a kinyert fehérjék inaktiválódását, denaturálódását és lebomlását okozza. Ezért a lízist általában pufferoldatban végzik. A legtöbb nehézség a szabályozatlan sejtfeltárásból ered, amely az összes intracelluláris anyag nem célzott felszabadulását és/vagy a céltermék denaturálódását eredményezi.
Gyakran ismételt kérdések az ultrahangos kezelésről és a sejtlízisről
- Lizálhatók a sejtek ultrahangos kezeléssel? Igen, az ultrahangos kezelés hatékonyan lizálja a sejteket nagyfrekvenciás ultrahanghullámokkal, amelyek kavitációt idéznek elő. E jelenség során apró gőzbuborékok képződnek és hevesen összeomlanak a sejtszuszpenzióban. Az így keletkező mechanikai erők megbontják a sejtmembránokat, és elősegítik az intracelluláris összetevők felszabadulását a folyadékba.
- Hogyan használható az ultrahangos kezelőberendezés sejtlízishez? Az ultrahangos kezelőberendezés sejtlízishez történő használata során a berendezés szondáját sejtszuszpenzióba merítik, és beállítják az olyan paramétereket, mint az amplitúdó és az impulzus időtartama. A folyamatot szorosan nyomon kell követni a sejtfeltárás optimalizálása, valamint a fehérjedenaturáció és az enziminaktiválódás minimálisra csökkentése érdekében.
- Mi az ultrahangos sejtlízis elve? Az ultrahangos kezelés az akusztikus kavitáció elvén működik. Az ultrahang energiája a folyékony közegbe jut, és gyors nyomásingadozásokat okoz, amelyek mikrobuborékok képződéséhez és befelé történő összeomlásához vezetnek. Ezek az összeomlások intenzív nyíróerőket és helyileg magas hőmérsékletet hoznak létre, megbontva a sejtszerkezeteket és javítva a lizátum homogenitását.
- Mennyi ideig tart a sejtlízishez alkalmazott ultrahangos kezelés? A sejtlízishez alkalmazott ultrahangos kezelés időtartama jelentősen eltérhet olyan tényezőktől függően, mint a sejttípus, a sejtsűrűség, az ultrahangos kezelőberendezés teljesítménye és az alkalmazott protokoll. A jellemző eljárások néhány másodperctől néhány percig tarthatnak, és gyakran ciklusokban végzik őket a hőképződés szabályozása és az egyenletes sejtfeltárás biztosítása érdekében.
- Mi az ultrahangos kezelés célja a fehérjeextrakcióban? A fehérjeextrakcióban az ultrahangos kezelés a sejtmembránok hatékony felszakítását és a fehérjék oldatba vitelét szolgálja. Ez a módszer különösen hasznos a sejten belüli kompartmentekben található fehérjék felszabadítására, ezért nélkülözhetetlen olyan lizátumok előkészítéséhez, amelyekből fehérjéket kívánnak tisztítani vagy elemezni.
- Miért alkalmaznak ultrahangos kezelést extrakcióhoz? Az ultrahangos kezelést gyors hatása és célzott energiaközlési képessége miatt részesítik előnyben az extrakcióban. A sejtszerkezetek megbontásával agresszív kémiai kezelések alkalmazása nélkül szabadítja fel a bioaktív molekulákat, így megőrzi a kinyert vegyületek funkcionális épségét.
- Megbontja az ultrahangos kezelés a fehérje–fehérje kölcsönhatásokat? Bár az ultrahangos kezelés hatékonyan megbontja a sejtmembránokat, a fehérje–fehérje kölcsönhatásokat is megbonthatja. A megbontás mértéke az ultrahangos kezelés intenzitásától és a kitettség időtartamától függ, és a fehérjekomplexek denaturálódásához vagy disszociációjához vezethet, ami befolyásolhatja a későbbi analitikai vagy funkcionális vizsgálatokat.
- Alkalmazható ultrahangos kezelés az E. coli lizálására? A Hielscher ultrahangos kezelőberendezései különösen hatékonyak a baktériumsejtek, például az erős sejtfalú E. coli lizálásában. A technika fizikai módszert biztosít a sejtfal és a sejtmembrán nyírásos feltárására, így előnyben részesített módszer a baktériumlizátumok előkészítésére a molekuláris biológiai és biokémiai laboratóriumokban.
- Milyen további folyamatok követik az ultrahangos kezelési lépést?
Az ultrahangos lízist követő lépések jellemzően magukban foglalják a lizátum frakcionálását, a sejtalkotók célzott izolálását és a további fehérjeextrakciót vagy -tisztítást.
A feldolgozott lizátumot ezután elválasztják és előkészítik analitikai vagy funkcionális alkalmazásokhoz, például nagy felbontású proteomikai, transzkriptomikai vagy receptorkötődési vizsgálatokhoz.
Szakirodalom/Hivatkozások
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.