Sonication a sejtlízishez: sejtzavar és extrakció
Az ultrahangos sejtlízis széles körben alkalmazott mintaelőkészítési technika a modern biotechnológiai laboratóriumokban. Elsődleges célja a sejtmembránok vagy egész sejtek megbontása az intracelluláris összetevők, például fehérjék, nukleinsavak vagy organellák felszabadítása érdekében. A mindennapi laboratóriumi munkában ez azt jelenti, hogy a szonikáció a sejtek ellenőrzött bontásának és a biomolekulák hatékony extrakciójának standard módszere. A szonikátorok legfontosabb előnye abban rejlik, hogy képesek a kritikus folyamatparaméterek pontos módosítására, beleértve az ultrahang intenzitását, a pulzációt és a hőmérséklet-szabályozást. Ez a szabályozás lehetővé teszi a kutatók számára, hogy megbízható lízist érjenek el, miközben minimalizálják az érzékeny biomolekulák hő- vagy mechanikai károsodását, ami kíméletes, mégis rendkívül hatékony extrakciós folyamatot eredményez.
Sejtlízis szonátorok használatával
Az ultrahangos sejtlízis akusztikus kavitációt használ a sejtmembránok megbontására és a sejten belüli molekulák felszabadítására. A Hielscher Ultrasonics kínálja a klasszikus szonda típusú szonikátort, valamint a steril feldolgozáshoz több mintát tartalmazó szonikátorokat: a VialTweeter több csőhöz és ampullához, valamint a 96 lyukú lemez szonikátor UIP400MTP szabványos mikrolemezekhez.
A Hielscher Ultrasonics erőteljes érintésmentes szonikátorokat szállít a minta előkészítéséhez és a klinikai elemzéshez. A többlyukú lemezes szonikátor UIP400MTP, A VialTweeter, a CupHorn és a GDmini2 áramlási szonikátor a mintákat steril körülmények között dolgozza fel.
Ultrahangos homogenizátorok UP100H (100 watt) és UP400St (400 watt): Sonication a sejtlízis és extrakció.
Ultrahangos homogenizátorok sejtlízishez és extrakcióhoz
| Ultrahangos eszköz típusa | Alkalmazás fókusz | Minta térfogata | Tipikus felhasználási eset | Előnye | Példa modellek |
|---|---|---|---|---|---|
| Szonda típusú szonikátorok | Egymintás szonikáció | 0.1 ml-től ~1000 ml-ig | Sejtlízis, fehérjeextrakció, DNS/RNS-fragmentálás | Pontos energiaszabályozás; különböző szonotródák; optimális kis és közepes mintákhoz | UP100H, UP200St, UP400ST |
| VialTweeter / CupHorn | Több lezárt fiola párhuzamos feldolgozása | 8-10 injekciós üveg (~1-20 ml egyenként) | Többszörös sejtszuszpenziók standardizált lízise | Egyenletes szonikálás; keresztszennyeződés elkerülése; reprodukálható eredmények | VialMagassugárzó, Cuphorn |
| 96-lyukú lemez szonikátor | Többcsöves és mikrotiteres lemezek szonikálása | Mikrolemez formátum | Nagy áteresztőképességű szűrés, proteomika, sejtvizsgálatok | Egyidejű, egyenletes szonikálás a kutak között; ideális több mintát tartalmazó munkafolyamatokhoz | UIP400MTP |
| áramlási cellás reaktorok | Folyamatos szonikálás nagyobb mennyiségekhez | >1 L, méretezhető | Ipari méretű sejtbontás, kivonatgyártás | Folyamatos feldolgozás; méretezhető; teljes folyamatszabályozás (amplitúdó, nyomás, hőmérséklet) | UIP1000hdt, UIP2000hdT + áramlási cella |
| Steril / közvetett szonikációs rendszerek | Szennyeződésmentes mintafeldolgozás | Üveg/cső/mikrolemez függő | Érzékeny minták, steril környezetek, szabályozási környezetek | Nem érintkezik a szondával; elkerülhető az átvitel; minimális tisztítási erőfeszítés | VialMagassugárzó, Cuphorn, UIP400MTP |
A szonikálás előnyei: sejtlízis
Más sejtlízishez és extrakciós módszerekhez képest az ultrahangos sejtlízisnek számos előnye van:
- Sebesség: Az ultrahangos sejtlízis és extrakció egy gyors módszer, amely másodpercek alatt megszakíthatja a nyitott sejteket. Ez sokkal gyorsabb, mint más módszerek, például homogenizálás, fagyasztva olvasztás vagy gyöngyőrlés.
- Hatékonyság: Az ultrahangos sejtlízis és extrakció kis, nagy vagy több minta kezelésére használható egyszerre, így hatékonyabb, mint más módszerek, amelyek kis minták egyedi feldolgozását igénylik.
- Vegyszermentes: Az ultrahangos sejtlízis és extrakció nem invazív módszer, amely nem igényel kemény vegyszereket vagy enzimeket. Ez ideálissá teszi olyan alkalmazásokhoz, ahol a cellatartalom integritását fenn kell tartani. A minták nem kívánt szennyeződése elkerülhető.
- Nagy hozam: Az ultrahangos sejtlízis és extrakció nagy mennyiségű sejttartalmat nyerhet ki, beleértve a DNS-t, az RNS-t és a fehérjéket. Ez azért van, mert a nagyfrekvenciás hanghullámok feltörik a sejtfalakat, és felszabadítják a tartalmat a környező oldatba.
- Hőmérséklet-szabályozás: A kifinomult ultrahangok lehetővé teszik a minta pontos hőmérséklet-szabályozását. A Hielscher digitális szonikátorok dugaszolható hőmérséklet-érzékelővel és hőmérséklet-ellenőrző szoftverrel vannak felszerelve.
- Ismételhető: Az ultrahangos sejtlízis protokolljai könnyen reprodukálhatók, és akár különböző nagyobb vagy kisebb mintatérfogatokhoz is illeszthetők egy egyszerű lineáris méretnöveléssel.
- Sokoldalú: Az ultrahangos sejtlízis és extrakció a sejttípusok széles skálájának kivonására használható, beleértve a baktériumokat, élesztőt, gombákat, növényi és emlős sejteket. Különböző típusú molekulák, köztük fehérjék, DNS, RNS és lipidek kivonására is használható.
- Számos minta egyidejű előkészítése: A Hielscher Ultrasonics számos megoldást kínál számos minta kényelmes feldolgozására pontosan ugyanazon folyamatfeltételek mellett. Ez rendkívül hatékonnyá és időtakarékossá teszi a lízis és extrakció minta-előkészítési lépését.
- Könnyen használható: Az ultrahangos sejtlízis és extrakciós berendezések könnyen kezelhetők és minimális képzést igényelnek. A berendezés gazdaságos is, mivel egyetlen beruházásról van szó, amely nem igényli az ártalmatlanítás visszavásárlását. Ez vonzóvá teszi a kutatók és laboratóriumok széles köre számára.
Összességében az ultrahangos sejtlízis és extrakció gyors, hatékony, pontosan szabályozható és sokoldalú módszer a sejttartalom kivonására. Előnyei az alternatív módszerekkel szemben vonzó választássá teszik a kutatási és ipari alkalmazások széles körében.
Az ultrahangos sejtlízis működési elve
Az ultrahangos sejtlízis és extrakció nagyfrekvenciás hanghullámokat használ a sejtek megzavarására és tartalmuk kivonására. A hanghullámok nyomásváltozásokat hoznak létre a környező folyadékban, ami kis buborékok kialakulását és összeomlását okozza a kavitáció néven ismert folyamatban. Ezek a buborékok lokalizált, rendkívül intenzív mechanikai erőket generálnak, amelyek megtörhetik a nyitott sejteket, és tartalmukat a környező oldatba engedhetik.
Az ultrahangos készüléket használó sejtlízis általában a következő lépéseket tartalmazza:
- A mintát folyadékpufferrel ellátott csőbe vagy tartályba helyezzük.
- Ultrahangos szondát helyezünk a mintába, és kb. 20-30 kHz-es nagyfrekvenciás hanghullámokat alkalmazunk.
- Az ultrahanghullámok oszcillációt és kavitációt okoznak a környező folyadékban, lokalizált erőket generálva, amelyek megtörik a nyitott sejteket és felszabadítják tartalmukat.
- A mintát centrifugáljuk vagy szűrjük a sejttörmelék eltávolítása érdekében, és az extrahált tartalmat összegyűjtjük a későbbi elemzéshez.
A közös lízis módszerek hátrányai
A laboratóriumokban végzett munkája során már megtapasztalta a sejtlízis problémáját a hagyományos mechanikai vagy kémiai lízis protokollok alkalmazásával.
- Mechanikai lízis: A mechanikus lízis módszerek, mint például a habarccsal és mozsártörővel történő őrlés vagy a francia préssel, gyöngymalommal vagy rotor-állórész rendszerrel történő homogenizálás gyakran nem rendelkeznek pontos vezérlési és beállítási lehetőségekkel. Ez azt jelenti, hogy az őrlés és őrlés használata gyorsan hőt és nyíróerőket generálhat, amelyek károsíthatják a mintát és denaturálhatják a fehérjéket. Időigényesek is lehetnek, és nagy mennyiségű kiindulási anyagot igényelhetnek.
- Kémiai lízis: A kémiai lízis módszerek, mint például a mosószer alapú lízis, károsíthatják a mintát a lipid kettős réteg és a denaturáló fehérjék megzavarásával. Több lépést is igényelhetnek, és maradék szennyeződéseket hagyhatnak maguk után, amelyek zavarják a későbbi alkalmazásokat. A mosószer optimális adagolásának megtalálása további kihívást jelent.
- Fagyasztási-olvadási ciklusok: A fagyasztási-olvadási ciklusok a sejtmembránok szakadását okozhatják, de az ismétlődő ciklusok fehérje denaturációt és lebomlást is okozhatnak. Ez a módszer több ciklust is igényelhet, ami időigényes lehet, és gyakran alacsonyabb hozamot eredményez.
- Enzimatikus lízis: Az enzimatikus lízis módszerek specifikusak lehetnek bizonyos sejttípusokra, és több lépést igényelnek, így időigényesek. Hulladékot is termelnek, és gondos optimalizálást igényelnek a minta lebomlásának elkerülése érdekében. Az enzimatikus líziskészletek gyakran drágák. Ha a jelenlegi enzimatikus lízis eljárás nem ad elegendő eredményt, szonikálás, mint szinergikus módszer alkalmazható a sejtzavarok fokozására.
Ellentétben a hagyományos mechanikai és kémiai sejtlízis módszerekkel, az ultrahangos kezelés egy nagyon hatékony és megbízható eszköz a sejt széteséséhez, amely lehetővé teszi az ultrahangos paraméterek teljes ellenőrzését. Ez biztosítja az anyagok kibocsátásának és a termék tisztaságának nagy szelektivitását. [vö. Balasundaram et al., 2009]
Minden sejttípusra alkalmas, és könnyen alkalmazható kis és nagy léptékben – mindig ellenőrzött körülmények között. Az ultrahangos készülékek könnyen tisztíthatók. Az ultrahangos homogenizátor mindig rendelkezik helyben tisztítási (CIP) és sterilizálási (SIP) funkcióval. A sonotrode egy masszív titán kürtből áll, amely vízben vagy oldószerben törölhető vagy öblíthető (a munkaközegtől függően). Az ultrahangos készülékek karbantartása robusztusságuk miatt szinte elhanyagolható.
Ultrahangos lízis és sejtzavar
Általában a minták lízise a laboratóriumban 15 másodperc és 2 perc között tart. Mivel az ultrahangos kezelés intenzitása nagyon könnyen beállítható amplitúdóval, szonikációs idő beállításával, valamint a megfelelő berendezés kiválasztásával, a sejtmembránokat nagyon óvatosan vagy nagyon hirtelen meg lehet zavarni, a sejtszerkezettől és a lízis céljától függően (pl. A DNS-extrakció lágyabb szonikációt igényel, a baktériumok teljes fehérjekivonása intenzívebb ultrahangkezelést igényel). A folyamat során a hőmérséklet integrált hőmérséklet-érzékelővel ellenőrizhető, és könnyen szabályozható hűtéssel (jégfürdő vagy áramlási cellák hűtőköpenyekkel) vagy ultrahangos kezeléssel impulzusos üzemmódban. Az impulzus-üzemmódú szonikálás során az 1-15 másodperces rövid ultrahangos kitörési ciklusok lehetővé teszik a hőelvezetést és a hűtést a hosszabb szakaszos időszakok alatt.
Minden ultrahang-vezérelt folyamat teljesen reprodukálható és lineárisan skálázható.
A VialTweeter ultrahangos homogenizátor számos minta egyidejű, egyenletes és gyors steril előkészítéséhez.
- A sejtszuszpenzió elkészítése: A sejtpelleteket homogenizálással pufferoldatban teljesen szuszpendálni kell (válassza ki a következő elemzéssel, pl. specifikus kromatográfiás módszerrel kompatibilis pufferoldatot). Szükség esetén adjon hozzá lizozimokat és/vagy egyéb adalékanyagokat (ezeknek kompatibilisnek kell lenniük az elválasztó/tisztító eszközökkel is). Keverjük össze / homogenizáljuk az oldatot óvatosan enyhe ultrahangos kezelés alatt, amíg a teljes szuszpenziót el nem érjük.
Olvasson többet a szonikációval kombinált lizozimek szinergiáiról! - Ultrahangos lízis: Helyezze a mintát jégfürdőbe. A sejt megzavarásához szonikálja a szuszpenziót 60-90 másodperces sorozatokban (az ultrahangos impulzus módjával).
- Elválasztás: Centrifugáljuk a lizátumot (pl. 10 perc 10 000 × g-on; 4°C-on). Óvatosan válasszuk le a felülúszót a sejtpelletről. A felülúszó az összes sejtlizátum. A felülúszó szűrése után az oldható sejtfehérje tisztított folyadékát kapjuk.
A biológia és a biotechnológia ultrahangos készülékeinek leggyakoribb alkalmazásai a következők:
- Sejtkivonat előkészítése
- Élesztő, baktériumok, növényi sejtek, lágy vagy keménysejtszövet, nukleinsav anyag megzavarása
- fehérje extrakció
- Enzimek előállítása és izolálása
- Antigének előállítása
- DNS-extrakció és/vagy célzott fragmentáció
- liposzóma készítmény
A szonda típusú ultrahangos készülékkel történő sejtmegszakítás hatékony minta-előkészítési módszer.
Az ultrahang sokrétű alkalmazásai a biotechnológia, a biomérnökség, a mikrobiológia, a molekuláris biológia, a biokémia, az immunológia, a bakteriológia, a virológia, a proteomika, a genetika, az élettan, a sejtbiológia, a hematológia és a botanika területén ágaznak el.
Lízis: Sejtszerkezetek törése
A sejteket egy félig áteresztő plazmamembrán védi, amely foszfolipid kettősrétegből áll (szintén fehérje-lipid kettősréteg; hidrofób lipidek és hidrofil foszformolekulák alkotják beágyazott fehérjemolekulákkal), és akadályt hoz létre a sejtbelső (citoplazma) és az extracelluláris környezet között. A növényi sejteket és a prokarióta sejteket sejtfal veszi körül. A cellulóz többrétegű vastag sejtfala miatt a növényi sejteket nehezebb lizálni, mint az állati sejteket. A sejtbelsőt, mint például az organellák, a mag, a mitokondrium, a citoszkeleton stabilizálja.
A sejtek lizálásával célja az organellák, fehérjék, DNS, mRNS vagy más biomolekulák kivonása és elválasztása.
A sejtlízis hagyományos módszerei és hátrányai
A sejtek lizálására számos módszer létezik, amelyek mechanikai és kémiai módszerekre oszthatók, amelyek magukban foglalják a mosószerek vagy oldószerek használatát, a nagynyomás alkalmazását, vagy gyöngymalom vagy francia sajtó használatát. Ezeknek a módszereknek a legproblematikusabb hátránya a folyamatparaméterek és ezáltal a hatás nehéz ellenőrzése és beállítása.
Az alábbi táblázat a gyakori lízismódszerek fő hátrányait mutatja be:
Táblázat: A sejtlízis hagyományos módszereinek jelentős hátrányai vannak
A lízis eljárása
A lízis érzékeny folyamat. A lízis során a sejtmembrán védelme megsemmisül, azonban meg kell akadályozni a kivont fehérjék inaktiválását, denaturációját és fiziológiátlan környezetben történő lebomlását (pH-értéktől való eltérés). Ezért általában a lízist pufferoldatban végezzük. A legtöbb nehézség az ellenőrizetlen sejtzavarokból ered, amelyek az összes intracelluláris anyag nem célzott felszabadulását és/vagy a céltermék denaturációját eredményezik.
Gyakran ismételt kérdések az ultrahangos kezelésről és a sejtlízisről
- Lehet-e lyse sejteket szonikálással? Igen, az ultrahangos kezelés hatékonyan lizálja a sejteket nagyfrekvenciás ultrahangos hullámokkal, amelyek kavitációt indukálnak, olyan jelenség, ahol apró gőzbuborékok képződnek és hevesen összeomlanak a sejtszuszpenzióban. A keletkező mechanikai erők megzavarják a sejtmembránokat és megkönnyítik az intracelluláris komponensek felszabadulását a folyadékba.
- Hogyan kell használni egy szonikátort a sejtlízishez? A szonikátor használata a sejtlízishez magában foglalja az ultrahangos szonda sejtszuszpenzióba merítését és olyan paraméterek beállítását, mint az amplitúdó és az impulzus időtartama. A folyamatot szorosan figyelemmel kell kísérni a sejtzavarok optimalizálása érdekében, miközben minimalizálják a fehérje denaturációját és az enzim inaktiválását.
- Mi az ultrahangos kezelés elve a sejtlízishez? Az ultrahangos kezelés az akusztikus kavitáció elvén működik. Az ultrahangos energiát a folyékony közegbe továbbítják, ami gyors nyomásingadozásokat okoz, ami mikrobuborékok kialakulásához és összeomlásához vezet. Ezek az implóziók intenzív nyíróerőket és lokalizált magas hőmérsékleteket hoznak létre, megzavarják a sejtszerkezeteket és fokozzák a lizátum homogenitását.
- Mennyi ideig tart a sejtlízis szonikációja? A sejtlízis szonikálásának időtartama jelentősen változhat olyan tényezőktől függően, mint a sejttípus, a sejtsűrűség, az szonikátor teljesítménye és az alkalmazott specifikus protokoll. A tipikus eljárások néhány másodperctől néhány percig terjedhetnek, gyakran ciklusokban hajtják végre a hőtermelés kezelése és az egyenletes cellazavarás biztosítása érdekében.
- Mi a célja az ultrahangos kezelésnek a fehérje extrakcióban? A fehérje extrakció során az ultrahangozás a sejtmembránok hatékony szakadására és a fehérjék oldására szolgál. Ez a módszer különösen hasznos fehérjék felszabadítására a sejtkompartmentekből, ami elengedhetetlenné teszi a lizátumok előállításához, amelyekből a fehérjéket tisztítani vagy elemezni kell.
- Miért használják szonikációt az extrakcióhoz? A szonikálást előnyben részesítik az extrakcióhoz, mivel gyors hatása és képes célzott energiát alkalmazni, lebontja a sejtszerkezeteket, hogy felszabadítsa a bioaktív molekulákat kemény kémiai kezelések alkalmazása nélkül, ezáltal megőrizve az extrahált vegyületek funkcionális integritását.
- Az ultrahangos kezelés megzavarja a fehérje-fehérje kölcsönhatásokat? Míg az ultrahangos kezelés hatékonyan megzavarhatja a sejtmembránokat, megzavarhatja a fehérje-fehérje kölcsönhatásokat is. A zavar szintje az ultrahangos intenzitástól és az expozíció időtartamától függ, ami potenciálisan a fehérje komplexek denaturációjához vagy disszociációjához vezethet, ami befolyásolhatja a későbbi analitikai vagy funkcionális vizsgálatokat.
- Lehet-e szonikációt használni az E. coli lizálására? A Hielscher szonikátorok különösen hatékonyak olyan baktériumsejtek lizálására, mint az E. coli, amelyek robusztus sejtfalakkal rendelkeznek. A technika fizikai módszert biztosít a sejtfal és a membrán nyírására, így előnyös módszer a bakteriális lizátumok előállítására molekuláris biológiai és biokémiai laboratóriumokban.
- Milyen további folyamatok követik a szonikációs lépést?
Az ultrahangos lízist követő további lépések jellemzően a lizátum frakcionálása, a szervsejtek célzott izolálása és további fehérjeextrakció vagy tisztítás.
A feldolgozott lizátumot ezután szétválasztják és előkészítik analitikai vagy funkcionális alkalmazásokhoz, például nagy felbontású proteomikai, transzkriptomikai vagy receptor-kötődési vizsgálatokhoz.
Irodalom/Hivatkozások
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.