Sonication a lízishez: sejtbontás és extrakció
A sejtek szétesése vagy lízise a biotechnológiai laboratóriumokban a napi mintaelőkészítés gyakori része. A lízis célja a sejtfal részeinek vagy a teljes sejtnek a megzavarása a biológiai molekulák felszabadítása érdekében. Az ultrahangos homogenizátorokat széles körben használják a sikeres sejtlízishez. A kifinomult ultrahangos készülékek fő előnye a folyamatparaméterek, például az intenzitás és a hőmérséklet pontos ellenőrzése, amely lehetővé teszi a gyengéd, mégis rendkívül hatékony sejtbontást és extrakciót.
Sejtlízis ultrahanggal
Az ultrahangos sejtlízis és extrakció olyan módszer, amelyet a nyitott sejtek megszakítására és a tartalom nagyfrekvenciás hanghullámokkal, azaz ultrahanggal történő kivonására használnak. A szonikálás egy lízis technika, amelyet széles körben használnak a sejtek megzavarásának és az intracelluláris anyag extrakciójának megalapozott és megbízható módszereként. Az ultrahangos lízis megbízható technika a lizátum ccontaining előállítására, pl. plazmid, receptorvizsgálatok, fehérjék, DNS, RNS stb. Mivel az ultrahangos intenzitás kiegyenlíthető a folyamatparaméterek beállításával, az optimális szonikációs intenzitás nagyon lágytól intenzívig külön-külön beállítható minden egyes anyagra és közegre, hogy megfeleljen az adott alkalmazási követelményeknek. A lízis következő lépései a frakcionálás, az organellák izolálása vagy/és a fehérje extrakciója és tisztítása. A kivont anyagot (= lizátumot) el kell különíteni, és további vizsgálatoknak vagy alkalmazásoknak kell alávetni, például proteomikai kutatás céljából.
Ultrahangos homogenizátorok UP100H (100 watt) és UP400St (400 watt) a minta előkészítéséhez, például lízishez és extrakcióhoz.
Más sejtlízishez és extrakciós módszerekhez képest az ultrahangos sejt lízisnek számos előnye van:
- Sebesség: Az ultrahangos sejtek lízise és extrakciója egy gyors módszer, amely másodpercek alatt megszakíthatja a nyitott sejteket. Ez sokkal gyorsabb, mint más módszerek, mint például a homogenizálás, a fagyasztás-felolvasztás vagy a gyöngymarás.
- Hatékonyság: Az ultrahangos sejtek lízise és extrakciója felhasználható kis, nagy vagy több minta kezelésére egyszerre, így hatékonyabb, mint más módszerek, amelyek kis minták egyedi feldolgozását igénylik.
- Vegyszermentes: Az ultrahangos sejtlízis és extrakció nem invazív módszer, amely nem igényel kemény vegyi anyagokat vagy enzimeket. Ez ideálissá teszi olyan alkalmazásokhoz, ahol a cellatartalom integritását fenn kell tartani. A minták nem kívánt szennyeződése elkerülhető.
- Nagy hozam: Az ultrahangos sejtlízis és extrakció nagy hozamú sejttartalmat vonhat ki, beleértve a DNS-t, az RNS-t és a fehérjéket. Ennek az az oka, hogy a nagyfrekvenciás hanghullámok feltörik a sejtfalakat, és a tartalmat a környező oldatba engedik.
- Hőmérséklet-szabályozás: A kifinomult ultrasonciators lehetővé teszi a minta pontos hőmérséklet-szabályozását. A Hielscher digitális ultrahangos készülék dugaszolható hőmérséklet-érzékelővel és hőmérséklet-ellenőrző szoftverrel van felszerelve.
- Ismételhető: Az ultrahangos sejtlízis protokolljai könnyen reprodukálhatók, sőt egy egyszerű lineáris felskálázással akár különböző nagyobb vagy kisebb mintamennyiségekhez is illeszthetők.
- Sokoldalú: Az ultrahangos sejtlízis és extrakció a sejttípusok széles skálájának kivonására használható, beleértve a baktériumokat, élesztőt, gombákat, növényi és emlős sejteket. Különböző típusú molekulák kivonására is használható, beleértve a fehérjéket, a DNS-t, az RNS-t és a lipideket.
- Számos minta egyidejű előkészítése: A Hielscher Ultrasonics számos megoldást kínál számos minta kényelmes feldolgozására pontosan azonos folyamatfeltételek mellett. Ez rendkívül hatékonnyá és időtakarékossá teszi a lízis és extrakció mintaelőkészítési lépését.
- Könnyen használható: Az ultrahangos sejtlízis és az extrakciós berendezések könnyen kezelhetők és minimális képzést igényelnek. A berendezés gazdaságos is, mivel egyetlen beruházásról van szó, és nincs szükség az ártalmatlanítások újbóli megvásárlására. Ez vonzóvá teszi a kutatók és laboratóriumok széles köre számára.
Összességében az ultrahangos sejtlízis és extrakció gyors, hatékony, pontosan szabályozható és sokoldalú módszer a sejttartalom kivonására. Az alternatív módszerekkel szembeni előnyei vonzó választássá teszik a kutatási és ipari alkalmazások széles körében.
Az ultrahangos sejtlízis működési elve
Az ultrahangos sejtlízis és extrakció nagyfrekvenciás hanghullámokat használ a sejtek megzavarására és tartalmuk kivonására. A hanghullámok nyomásváltozásokat hoznak létre a környező folyadékban, ami kis buborékok kialakulását és összeomlását okozza a kavitáció néven ismert folyamatban. Ezek a buborékok lokalizált, rendkívül intenzív mechanikai erőket generálnak, amelyek megtörhetik a nyitott sejteket, és tartalmukat a környező oldatba engedhetik.
A sejtek lízise ultrahangos készülékkel általában a következő lépéseket foglalja magában:
- A mintát folyadékpufferrel ellátott csőbe vagy tartályba helyezzük.
- Ultrahangos szondát helyezünk a mintába, és kb. 20-30 kHz-es nagyfrekvenciás hanghullámokat alkalmazunk.
- Az ultrahanghullámok oszcillációt és kavitációt okoznak a környező folyadékban, lokalizált erőket generálva, amelyek megszakítják a nyitott sejteket és felszabadítják azok tartalmát.
- A mintát centrifugálják vagy szűrik, hogy eltávolítsák a sejttörmeléket, és a kivont tartalmat összegyűjtik a későbbi elemzéshez.
Az erős ultrahanghullámok megzavarják a biológiai struktúrák sejtmátrixát és felszabadítják a bioaktív vegyületeket. A növényi anyag és az oldószer (pl. puffer) közötti tömegátadás fokozódik. (grafika: ©Vilkhu et al., 2006)
A közös lízismódszerek hátrányai
A laboratóriumokban végzett munkája során már tapasztalhatta a sejtlízis gondjait a hagyományos mechanikai vagy kémiai lízisprotokollok alkalmazásával.
- Mechanikus lízis: A mechanikus lízismódszerek, mint például a habarccsal és mozsártörővel történő őrlés vagy a francia prés, gyöngymalom vagy rotor-állórész rendszerrel történő homogenizálás, gyakran nem rendelkeznek precice ellenőrzési és beállítási lehetőségekkel. Ez azt jelenti, hogy az őrlés és az őrlés használata gyorsan hőt és nyíróerőket generálhat, amelyek károsíthatják a mintát és a denaturált fehérjéket. Időigényesek is lehetnek, és nagy mennyiségű kiindulási anyagot igényelhetnek.
- Kémiai lízis: A kémiai lízis módszerek, mint például a mosószer alapú lízis, károsíthatják a mintát a lipid kettősréteg és a denaturáló fehérjék megzavarásával. Több lépést is igényelhetnek, és olyan maradványszennyeződéseket hagyhatnak maguk után, amelyek zavarják a downstream alkalmazásokat. A mosószer optimális adagjának megtalálása további kihívást jelent.
- Fagyasztási-olvadási ciklusok: A fagyasztási-olvadási ciklusok a sejtmembránok szakadását okozhatják, de az ismételt ciklusok fehérje denaturációt és lebomlást is okozhatnak. Ez a módszer több ciklust is igényelhet, ami időigényes lehet, és gyakran alacsonyabb hozamot eredményez.
- Enzimatikus lízis: Az enzimatikus lízis módszerek specifikusak lehetnek bizonyos sejttípusokra, és több lépést igényelnek, így időigényesek. Hulladékot is termelnek, és gondos optimalizálást igényelnek a minta lebomlásának elkerülése érdekében. Az enzimatikus líziskészletek gyakran drágák. Ha a jelenlegi enzimatikus lízis eljárás nem ad elegendő eredményt, szonikálás, mint szinergikus módszer alkalmazható a sejtzavarok fokozására.
A hagyományos mechanikai és kémiai sejtlízis módszerekkel ellentétben az ultrahangos kezelés nagyon hatékony és megbízható eszköz a sejtek szétesésére, amely lehetővé teszi az ultrahangos paraméterek teljes ellenőrzését. Ez biztosítja az anyagok kibocsátásának és a termék tisztaságának magas szelektivitását. [vö. Balasundaram et al., 2009]
Minden sejttípusra alkalmas, és könnyen alkalmazható kis és nagy méretekben – mindig ellenőrzött körülmények között. Az ultrahangos készülékek könnyen tisztíthatók. Az ultrahangos homogenizátor mindig clean-in-place (CIP) és sterilize-in-place (SIP) funkcióval rendelkezik. A sonotrode egy masszív titán szarvból áll, amely vízzel vagy oldószerrel törölhető vagy öblíthető (a munkaközegtől függően). Az ultrahangos készülékek karbantartása robusztusságuk miatt szinte elhanyagolható.
Ultrahangos lízis és sejtzavar
Általában a laboratóriumi minták lízise 15 másodperc és 2 perc között tart. Mivel az ultrahang-intenzitás intenzitása nagyon egyszerű az amplitúdó beállításával, az ultrahangos idő beállításával, valamint a megfelelő berendezés kiválasztásával, a sejtmembránok nagyon finoman vagy nagyon hirtelen megszakadhatnak, a sejtszerkezettől és a lízis céljától függően ( pl. a DNS extrakcióhoz puhább szonikációra van szükség, a baktériumok teljes fehérje-extrakciójához intenzívebb ultrahangkezelés szükséges). A folyamat során a hőmérsékletet integrált hőmérséklet-érzékelő figyelemmel kíséri, és hűtéssel (jeges fürdővel vagy hűtőkabátokkal rendelkező áramlási cellákkal) vagy impulzusos üzemmódú ultrahanggal vezérelhető. Impulzus üzemmódú szonikáció alatt rövid, 1-15 másodperces időtartamú ultrahangos törés ciklusok lehetővé teszik a hőelvezetést és a hűtést a hosszabb időszakokban.
Minden ultrahang-vezérelt folyamatok teljesen reprodukálható és lineárisan skálázható.
A VialTweeter egy ultrahangos homogenizátor számos minta egyidejű, egyenletes és gyors steril előkészítéséhez.
Ultrahangos homogenizátorok a sejtek líziséhez és extrakciójához
Különböző típusú ultrahangos készülékek lehetővé teszik a mintaelőkészítési cél elérését, valamint a felhasználóbarát és a működési kényelem biztosítását. A szonda típusú ultrahangos készülékek a leggyakoribb eszközök a laboratóriumban. Ezek a legmegfelelőbbek kis és közepes méretű minták előállítására, amelyek térfogata 0,1 ml és 1000 ml között van. Különböző teljesítményméretek és szonotródák lehetővé teszik az ultrahangos készülék adaptálását a minta térfogatához és az edényhez a leghatékonyabb és leghatékonyabb ultrahangos eredmények érdekében. Az ultrahangos szonda készülék a legjobb választás, ha egyedi mintákat kell készíteni.
Ha több mintát kell készíteni, pl. 8-10 injekciós üveg sejtoldat, intenzív közvetett ultrahangos kezelés ultrahangos rendszerekkel, például a VialTweeter vagy ultrahangos cuphorn a legmegfelelőbb homogenizálási módszer a hatékony lízishez. Több injekciós üveget ultrahanggal kezelnek egyszerre, azonos intenzitással. Ez nemcsak időt takarít meg, hanem biztosítja az összes minta azonos kezelését is, ami megbízhatóvá és összehasonlíthatóvá teszi a minták eredményeit. Továbbá, közvetett szonikálás során a keresztszennyeződés az ultrahangos sonotrode (más néven ultrahangos szonda, kürt, hegy vagy ujj) merülésével elkerülhető. Mivel külön-külön a mintamérethez igazított injekciós üvegeket használnak, az edények dekantálása miatti időigényes tisztítás és mintaveszteség kimarad. A multiwell vagy mikrotiter lemezek egyenletes szonikálásához Hielscher kínálja az UIP400MTP-t.
Nagyobb mennyiségek, például a kereskedelmi termelés sejtextraktumok, folyamatos ultrahangos rendszerek egy áramlási cella reaktor a legalkalmasabbak. A folyamatos és egyenletes átáramlását a feldolgozott anyag biztosítja az egyenletes szonikálással. Minden paraméter az ultrahangos dezintegrációs folyamat optimalizálható, és beállítani, hogy a követelményeknek a kérelem és a specifikus sejt anyagot.
Példaként eljárás ultrahangos lizáló bakteriális sejtek:
- Előállítása A sejtszuszpenzió: sejtüledékeket teljesen el kell függeszteni a puffer-oldatban homogenizáljuk (válassza ki a pufferoldat kompatibilis következő elemzés, például specifikus kromatográfiás módszer). Hozzáadása lizozimek és / vagy egyéb adalékanyagokat, ha szükséges (kell lenniük is kompatibilis elválasztási / tisztítási módszerekkel). Keverjük / homogenizáljuk az oldatot óvatosan enyhe szonikálással, amíg a teljes szuszpenziót nem kapunk.
- Ultrahangos lízis: A mintát jeges fürdőben. Sejtzúzáshoz, sonicate a felfüggesztés 60-90 másodpercig tartó (az Ön ultraszonizálót pulzusát módban).
- Separation: Centrifuga a lizátum (például 10 perc. 10000 x g; a 4degC). Elválasztjuk a felülúszót a sejtüledéket gondosan. A felülúszót a teljes sejtlizátum. Szűrés után a felülúszó, akkor szerezzen egy tisztított folyadékot a sejtek oldható fehérje.
A leggyakoribb alkalmazások ultrasonicators a biológia és a biotechnológia:
- Sejtkivonat készítésére
- Az élesztő, a baktériumok, a növényi sejtek, a lágy vagy kemény sejtszövet, a nuklein anyag zavara
- fehérje extrakció
- Előállítása és izolálása enzimek
- Termelés antigének
- DNS-extrahálás és / vagy célzott fragmentáció
- liposzómakészítmény
A sejtbontás a szonda típusú ultrahangos készülékkel hatékony mintaelőkészítési módszer.
Az alábbi táblázat áttekintést nyújt az ultrahangos készülékeinkről a sejtek megzavarására és kivonására. Kattintson az eszköz típusára, hogy további információkat kapjon az egyes ultrahangos homogenizátorokról. Jól képzett és hosszú távú tapasztalataink technikai személyzete örömmel segít kiválasztani a mintákhoz legmegfelelőbb ultrahangos készüléket!
| Kötegelt mennyiség | Áramlási sebesség | Ajánlott eszközök |
|---|---|---|
| legfeljebb 10 injekciós üveg vagy tubus | na | VialTweeter |
| többwell / mikrotiter lemezek | na | UIP400MTP |
| több cső / edény | na | Cuphorn |
| 1 - 500 ml | 10-200 ml / perc | UP100H |
| 10 és 1000 ml között | 20–200 ml/perc | Uf200 ः t, UP200St |
| 10-2000 ml | 20-400 ml / perc | UP400St |
A sokrétű alkalmazási ultrahang ágazik ki a szektorokban a biotechnológia, Bioengineering, mikrobiológiai, molekuláris biológia, biokémia, immunológia, bakteriológiai, virológia, proteomika, genetika, fiziológia, sejtbiológia, hematológia, és a botanika.
Lyalízis: A sejtstruktúrák megtörése
A sejteket védi féligáteresztő plazmamembrán, amely abból áll, hogy a foszfo-lipid kettősréteg (szintén protein-lipid kettősréteg; által alkotott hidrofób lipidek és hidrofil foszfor molekulák beágyazott fehérje molekulák), és létrehoz egy gátat képez a sejt belső (citoplazma) és az extracelluláris környezetbe. Növényi sejtek és a prokarióta sejtek körül egy sejtfal. Mivel a több réteg vastag sejtfal cellulóz, növényi sejteket nehezebb lizálják, mint állati sejtek. A sejt belső, mint például organellumok, mag, mitokondrium, stabilizáljuk a citoszkeleton.
A sejtek lizálásával, az arra irányul, kitermelése és elválasztjuk a organellumok, proteinek, DNS-t, mRNS-t vagy más biomolekulák.
A sejtlízis hagyományos módszerei és hátrányai
Számos módszer a lizátum sejtek, amelyek osztható mechanikai és kémiai módszerek, amelyek magukban foglalják a mosó- vagy oldószereket, a kérelmet a nagy nyomás, vagy a használata egy golyós malomban vagy egy French press. A legproblematikusabb hátránya ezeknek a módszereknek a nehéz ellenőrzését és beállítását a folyamat paramétereinek, és ezáltal hatással.
Az alábbi táblázat a közös lízismódszerek főbb hátrányait mutatja be:
Táblázat: A szokásos módszerek sejtlízis fő hátránya
A lízis eljárása
Lysis egy érzékeny folyamat. A lízis védelmére sejthártya elpusztul, de az inaktiválás, denaturáció és lebontása az extrahált fehérjék egy nem fiziológiás környezetben (eltérés a pH-érték) meg kell akadályozni. Ezért általában lízis végezzük pufferoldatban. A legtöbb nehézségek merülnek fel ellenőrizetlen sejtroncsoláshoz eredményez egy nem célzott felszabadulását az összes intracelluláris anyag és / vagy a denaturáció a céltermék.
Irodalom / References
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.