Ultrahangos alkalmazások a majomhimlővírussal kapcsolatban
Az ultrahangos kezelés fontos feldolgozási módszer a majomhimlővírus (MPXV) analitikai mintákból történő izolálásához, a vírus DNS-ének fragmentálásához, valamint a majomhimlő elleni vakcinák gyártásában. A diagnosztikai vizsgálatokat és az elemzést (PCR, ELISA stb.) megelőző minta-előkészítés során ultrahangos kezeléssel lizálják a sejteket, hogy kiszabadítsák a majomhimlővírust a sejtek belsejéből és / vagy fragmentálják a DNS-t. A vakcinagyártásban az alkalmazások a vírusrészecskék / DNS előkészítésétől a gyógyszerhordozókba történő kapszulázásig és az inokulumok formulálásáig terjednek.
Az alábbiakban részletes információkat talál a majomhimlővírust tartalmazó minták ultrahangos előkészítéséről, valamint az ultrahanggal támogatott MPXV-vakcinagyártásról.
Az oldal tartalma:
- Ultrahangos lízis a majomhimlővírus kinyeréséhez
- A majomhimlővírus DNS-ének ultrahangos fragmentálása
- Ultrahangos alkalmazások az MPXV-vakcinák gyártásában
Ezt a folyamatos átfolyásos üzemre szolgáló, 2x 1kW teljesítményű ultrahangos készülékből álló rendszert egy vakcinagyártó létesítményben telepítették.
Ultrahangos lízis és DNS-fragmentálás a polimeráz-láncreakció (PCR) előtt
A majomhimlővírus-fertőzést nukleinsav-amplifikációs vizsgálattal (NAAT), valós idejű vagy hagyományos polimeráz-láncreakcióval (PCR) mutatják ki, a vírus DNS-ének egyedi szekvenciáit detektálva. A minta (például orrgarati törletből vagy bőrbiopsziából) a sejtekben tartalmazza a vírust.
Az elemzéshez a vírust ki kell szabadítani a sejtekből, és a vírus DNS-ét fragmentálni kell a PCR-hez.
Ultrahangos lízis:
Az ultrahangos sejtfeltárás / lízis megbízható és hatékony módszer a vírusok sejtmintákból történő izolálására, ezért előnyösebb technika az olyan vegyi anyagoknál, mint a lizozim, a proteináz K és a különféle detergensek, amelyeket alternatív megoldásként használnak a sejtlízis és a DNS felszabadításának elérésére.
Az ilyen kémiai reagensek használata azonban a PCR-elemzés előtt időigényes, több lépésből álló minta-előkészítést igényel a PCR-reakció gátlásának elkerülése érdekében. Mivel a PCR-inhibitorok befolyásolják az amplifikáció hatékonyságát, az el nem távolított inhibitorok mennyiségének kis eltérései nagy eltérésekhez vezethetnek a PCR-termék amplifikációjában (Diaco, 1995).
Az ultrahangos lízis előnye abban rejlik, hogy kívánatos a sejtstruktúrák teljes feltárása és a DNS felszabadítása lizáló reagensek és időigényes minta-előkészítés szükségessége nélkül. (vö. Fykse et al., 2003)
Ultrahangos DNS-fragmentálás:
Az ultrahangos DNS-fragmentálás egyszerű és megbízható, mivel szabályozható hosszúságú DNS-fragmentumokat hoz létre (bázispárok, bp). Ultrahanggal a DNS hatékonyan fragmentálható a megcélzott DNS-hosszúságra. Az ultrahangos paraméterek pontos szabályozása és a fejlett hűtési lehetőségek megakadályozzák a DNS degradációját.
Tudjon meg többet az ultrahangos DNS-fragmentálásról!
Ultrahangos alkalmazások a majomhimlővírus elleni vakcináknál
A majomhimlővírus ellen jelenleg alkalmazott vakcinák élő vírust tartalmazó vakcinák. Az újonnan kifejlesztett vakcinák más platformokat is használhatnak, például DNS-alapú… Jelenleg módosított Vaccinia Ankara vírust, egy attenuált, nem replikálódó orthopoxvírust tartalmaz. Trist (trisz-aminometán) és nátrium-kloridot is tartalmaz. A vakcina kis mennyiségben tartalmazhat a vakcinavírus szaporításához használt csirkeembrió-fibroblaszt sejtekből származó DNS-t és fehérjét, benzonázt, valamint antibiotikus vegyületeket, például gentamicint és ciprofloxacint is.
Az ultrahangos homogenizálást élő, attenuált vírust tartalmazó vakcinák, DNS-vakcinák, multivalens DNS-koktélok, mRNS-vakcinák, rekombináns fehérjevakcinák, vírusszerű részecskéket tartalmazó vakcinák stb. gyártásában alkalmazzák.
- vírusrészecskék és anyagok diszpergálása
- emulgeálás
- vírusok inaktiválása
- gyógyszerhordozók formulálása (NLC, SLN)
- kapszulázás
- anyagok feloldása
- adjuvánsok előkészítése
- gázmentesítés / levegőmentesítés
Részletesebb információkat találhat az ultrahangos alkalmazásokról a vakcinagyártás javítására!
A majomhimlővírus ultrahangos izolálásának protokollja
Stittelaar kutatócsoportja (2005) ultrahangos lízist alkalmazott a majomhimlővírus felszabadítására a szaporításhoz használt gazdasejt-tenyészetből, valamint a fertőzött főemlősökből toroktörlettel nyert sejtekből.
A majomhimlő elleni vakcina előkészítése:
A majomhimlő vírusokat specifikus kórokozóktól mentes csirke embrió fibroblaszt sejteken tenyésztették. 1–2 napos inkubálást követően a vírussejt-szuszpenziót egy fagyasztva kiolvasztott körrel gyűjtöttük be, majd centrifugálással sűrítettük. A pelletet újra szuszpendáltuk, és több ultrahangos homogenizálásnak vetettük alá.
A majomhimlővírus izolálása vakcinázott makákókból:
A mintákat háromszor fagyasztottuk fel, és ultrahangos CupHornban ultrahanggal kezeltük. Két hígítást (1:10 és 1:100) alkalmaztunk szállítóközegben, 1% magzati szarvasmarhaszérummal kiegészítve a Vero sejt egyrétegű beoltására hatlyukú lemezeken. 1 órás, 37 °C-on végzett inkubálás után az inokulumot eltávolítottuk, és 1%-os magzati szarvasmarhaszérummal kiegészített táptalajjal helyettesítettük. Az egyrétegű rétegeket 5 napig tenyésztettük 37 °C-on, és kristályibolya-oldattal megfestettük.
(cf. Stittelaar et al., 2005)
Ultrahangos készülékek víruselemzéshez és vakcinagyártáshoz
A Hielscher Ultrasonics széles termékportfóliója ideális ultrahangos készüléket kínál kutató- és analitikai laboratóriumok számára, valamint ipari vakcinagyártáshoz.
A Hielscher Ultrasonics kutató- és analitikai laboratóriumokban használható, valamint ipari vakcinagyártásba beépíthető nagy teljesítményű ultrahangos készülékek és ultrahangos bioreaktorok tervezésére, gyártására és forgalmazására szakosodott (pl. vakcinák, gyógyszerhatóanyagok).
Az ultrahangos kezelés nyitott edényekben, zárt, folyamatosan kevert reaktorokban és folyamatos átfolyásos reaktorokban alkalmazható. Az ultrahangos rendszerek folyékony közeggel érintkező összes alkatrésze rozsdamentes acélból, titánból vagy üvegből készül. Az autoklávozható alkatrészek és a higiénikus szerelvények biztosítják, hogy a gyártás gyógyszeripari minőségi követelményeknek megfelelő körülmények között történjen.
Automatikus adatrögzítés: Az intelligens szoftver az ultrahangos kezelési folyamat paramétereit automatikusan rögzíti a beépített SD-memóriakártyán. Az összes folyamatparaméter pontos szabályozása biztosítja a reprodukálhatóságot, a gyártás szabványosítását, és megkönnyíti a gyógyszeripari termékbiztonsági szabványok teljesítését.
A Hielscher Ultrasonics ultrahangos processzorai rendkívül megbízhatók és pontosan szabályozhatók. Minden ipari ultrahangos készülék beállítható úgy, hogy az alacsonyabbtól a nagyon magas amplitúdókig terjedő teljes tartományt biztosítsa. A Hielscher ultrahangos rendszereinek robusztus kialakítása lehetővé teszi a 24/7 üzemelést nagy terhelés mellett és nagy igénybevételt jelentő környezetben.
Az alábbi táblázat tájékoztatást nyújt ultrahangos készülékeink hozzávetőleges feldolgozási kapacitásáról:
| Sarzs térfogata | Térfogatáram | Ajánlott készülékek |
|---|---|---|
| többlyukú / mikrotiter lemezek | n/a | UIP400MTP |
| 1–500mL | 10–200mL/min | UP100H |
| 10–2000mL | 20–400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1–20L | 0,2–4L/min | UIP2000hdT |
| 10–100L | 2–10L/min | UIP4000hdT |
| n/a | 10–100L/min | UIP16000 |
| n/a | nagyobb | csoportba kapcsolt készülékek: UIP16000 |
Lépjen kapcsolatba velünk! / Kérdezzen tőlünk!
Ultrahangos DNS-nyírás
Jkwchui munkája alapján átdolgozva, CC-BY-SA.03 licenc alatt
Szakirodalom / Hivatkozások
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Tudnivalók
Majomhimlővírus
A majomhimlővírus (MPV, MPXV vagy hMPXV) egy kettős szálú DNS-vírusfaj, amely vírusos zoonózist okoz. Ez a betegség majomhimlő-fertőzés néven ismert, és emberekben és állatokban is előfordulhat. A Poxviridae család Orthopoxvirus nemzetségébe tartozik. A majomhimlővírus az embert fertőző orthopoxvírusok egyike, a variola (VARV), a tehénhimlő (CPX) és a vaccinia (VACV) vírusai mellett. Az orthopoxvírusokra nagyméretű, tégla alakú vírusrészecskék jellemzők, amelyek körülbelül 200 000 bp hosszúságú, kettős szálú DNS-genomot tartalmaznak.
ELISA-vizsgálat
Az ELISA az enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat rövidítése, és olyan jelzett immunvizsgálat, amelyet az immunvizsgálatok arany standardjának tekintenek. Az ELISA nagy diagnosztikai érzékenysége miatt nagyra értékelt immunológiai vizsgálat, amelyet molekulák, köztük antitestek, antigének, fehérjék, glikoproteinek és hormonok kimutatására és mennyiségi meghatározására használnak. Az ELISA elve az antigén–antitest kölcsönhatáson alapul. E kölcsönhatás révén a specifikus antitestek a célantigénjükhöz kötődnek. A szubsztrát csak akkor kötődhet az enzimhez, ha a kölcsönhatás létrejön, és ezt követően a szubsztrát átalakulása figyelhető meg, ami pozitív eredményt jelent.
A Hielscher Ultrasonics nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorokat gyárt a laboratóriumi mérettől az ipari méretig.