Ultrahangos alkalmazások a majomhimlő vírusban
Az ultrahangos kezelés fontos feldolgozási módszer a majomhimlő vírus (MPXV) izolálására analitikai mintákból, vírus DNS fragmentációra, valamint majomhimlő vakcina gyártására. A minta előkészítéséhez a diagnosztika és elemzés előtt (PCR, ELISA stb.) ultrahangosítást használnak a sejtek lizálására annak érdekében, hogy felszabadítsák a majomhimlő vírust a sejt belsejéből és / vagy a DNS fragmentálására. A vakcinagyártásban az alkalmazások a vírusrészecske / DNS előkészítésétől, a gyógyszerhordozókba történő kapszulázástól és az inokulum formulázásától terjednek.
Az alábbiakban részletes információkat talál az ultrahangos majomhimlő vírus minta előkészítéséről, valamint az ultrahanggal segített MPXV vakcina előállításáról.
Mit talál ezen az oldalon:
- Ultrahangos lízis majomhimlő vírus extrakcióhoz
- A majomhimlő vírus DNS ultrahangos töredezettsége
- Ultrahangos alkalmazások az MPXV vakcinagyártásban
Ultrahangos lízis és DNS-fragmentáció polimeráz láncreakció (PCR) előtt
A majomhimlő vírusfertőzést nukleinsav-amplifikációs vizsgálattal (NAAT) mutatják ki, valós idejű vagy hagyományos polimeráz láncreakció (PCR) alkalmazásával, a vírus DNS egyedi szekvenciáinak kimutatására. A minta (pl. orrgaratcseréből vagy bőrbiopsziából) tartalmazza a vírust a sejtekben.
Az elemzéshez a vírust fel kell szabadítani a sejtekből, és a vírus DNS-t PCR-re kell töredezni.
Ultrahangos lízis:
Az ultrahangos sejtzavar / lízis megbízható és hatékony módszer a vírusok izolálására a sejtmintákból, és ezáltal előnyösebb technika a vegyi anyagok, például lizozim, proteináz K és különböző mosószerek felett, amelyeket alternatívaként használnak a sejtlízis és a DNS felszabadítására.
Az ilyen kémiai reagensek használata azonban időigényes mintaelőkészítést igényel több lépésben a PCR-elemzés előtt, hogy megakadályozzák a PCR-reakció gátlását. Mivel a PCR-gátlók befolyásolják az amplifikáció hatékonyságát, a nem eltávolított inhibitorok mennyiségének kis változásai nagy eltérésekhez vezethetnek a PCR-termék amplifikációjában (Diaco, 1995).
A lízis ultrahangos kezelésének előnye, hogy kívánatos a sejtszerkezetek teljes megzavarása és a DNS felszabadulása anélkül, hogy lizáló reagensekre és időigényes mintaelőkészítésre lenne szükség. (vö. Fykse et al., 2003)
Ultrahangos DNS-töredezettség:
Az ultrahangos DNS-fragmentáció egyszerű és megbízható, mint a hosszú DNS-fragmensek (bázispárok, bp). Az ultrahang segítségével a DNS hatékonyan fragmentálható a megcélzott DNS-hosszra. Az ultrahangos paraméterek pontos ellenőrzése és a kifinomult hűtési lehetőségek megakadályozzák a DNS lebomlását.
További információ ultrahangos DNS-fragmentáció!
Ultrahangos alkalmazások majomhimlő vírus vakcinában
A majomhimlő vírus ellen használt vakcinák jelenleg élő vírus elleni vakcinák. Az újonnan kifejlesztett vakcinák más platformokat is használhatnak, például DNS-alapú Jelenleg módosított Vaccinia Ankara viurs-t, egy gyengített, nem replikálódó orthopoxvírust tartalmaz. Trisz-t (trisz-aminometánt) és nátrium-kloridot is tartalmaz. A vakcina kis mennyiségben tartalmazhat DNS-t és fehérjét a csirke embrió fibroblaszt sejtekből, amelyeket a vakcinavírus, a benzonáz és az antibiotikum vegyületek, például a gentamicin és a ciprofloxacin tenyésztésére használnak.
Az ultrahangos homogenizálást élő attenuált vírusvakcinák, DNS-vakcinák, többértékű DNS-koktélok, mRNS-vakcinák, rekombináns fehérje vakcinák, vírusszerű részecske-vakcinák stb. Előállítására használják.
- vírusrészecskék és -ágensek diszperziója
- Emulgeálás
- vírusok inaktiválása
- gyógyszerhordozó formuláció (NLC, SLN)
- Beágyazás
- hatóanyagok feloldása
- Adjuvánsok előállítása
- Gáztalanítás / levegőztetés
Részletesebb információkat találhat az ultrahangos alkalmazásokról a jobb vakcinagyártás érdekében!
Protokoll a majomhimlő vírus ultrahangos izolálására
Stittelaar (2005) kutatócsoportja ultrahangos lízist használt a majomhimlő vírus felszabadítására a növekedési gazdasejtkultúrából, valamint a fertőzött főemlősökből torokcsere útján nyert sejtekből.
Majomhimlő vakcina előkészítése:
A majomhimlő vírusokat specifikus kórokozóktól mentes csirke embrió fibroblaszt sejteken tenyésztették. 1–2 napos inkubálást követően a vírussejt-szuszpenziót egy fagyasztva kiolvasztott körrel gyűjtöttük be, majd centrifugálással sűrítettük. A pelletet újra szuszpendáltuk, és több ultrahangos homogenizálásnak vetettük alá.
Majomhimlő vírus izolálása vakcinázott makákókból:
A mintákat háromszor fagyasztottuk fel, és ultrahangos CupHornban ultrahanggal kezeltük. Két hígítást (1:10 és 1:100) alkalmaztunk szállítóközegben, 1% magzati szarvasmarhaszérummal kiegészítve a Vero sejt egyrétegű beoltására hatlyukú lemezeken. 1 órás, 37 °C-on végzett inkubálás után az inokulumot eltávolítottuk, és 1%-os magzati szarvasmarhaszérummal kiegészített táptalajjal helyettesítettük. Az egyrétegű rétegeket 5 napig tenyésztettük 37 °C-on, és kristályibolya-oldattal megfestettük.
(vö. Stittelaar et al., 2005)
Ultrahangos készülékek víruselemzéshez és vakcinagyártáshoz
A Hielscher Ultrasonics széles termékportfóliója ideális ultrahangos készüléket kínál kutatási és analitikai laboratóriumok, valamint ipari vakcinagyártás számára.
A Hielscher Ultrasonics nagy teljesítményű ultrahangos készülékek és szono-bioreaktorok tervezésére, gyártására és forgalmazására szakosodott, kutatási és analitikai laboratóriumokban való felhasználásra, valamint ipari vakcinagyártásban való megvalósításra (pl. Vakcinák, Api).
Szonikálás alkalmazható nyitott edényekre, zárt folyamatosan kevert reaktorokra és folyamatos átfolyó reaktorokra. Az ultrahangos rendszerek minden része, amely érintkezik a folyékony közeggel, rozsdamentes acélból, titánból vagy üvegből készül. Az autoklávozható alkatrészek és szaniter szerelvények biztosítják a gyógyszerészeti minőségű állapotok.
Automatikus adatrögzítés: Az intelligens szoftver automatikusan rögzíti az ultrahangos folyamat paramétereit az integrált SD memóriakártyán. Az összes folyamatparaméter pontos szabályozása biztosítja a Reprodukálhatóság, a termelés szabványosítása, és elősegíti a gyógyszeripari termékek biztonsági szabványainak teljesítését.
Hielscher Ultrasonics’ Az ultrahangos processzorok rendkívül megbízhatóak és pontosan vezérelhetők. Minden ipari ultrahangos készülék beállítható, hogy a teljes tartományt az alacsonyabb és a nagyon magas amplitúdók között nyújtsa. A Hielscher ultrahangos rendszereinek robusztussága lehetővé teszi az 24/7 működését nagy teherbírású és igényes környezetben.
Az alábbi táblázat jelzi ultrahangos készülékeink hozzávetőleges feldolgozási kapacitását:
Kötegelt mennyiség | Áramlási sebesség | Ajánlott eszközök |
---|---|---|
Több lyukú / mikrotiter lemezek | N/a | UIP400MTP |
1–500 ml | 10–200 ml/perc | UP100H |
10 és 2000 ml között | 20–400 ml/perc | UP200Ht, UP400ST |
0.1-től 20L-ig | 0.2-től 4 liter/percig | UIP2000hdT |
10–100 liter | 2–10 l/perc | UIP4000hdt |
N/a | 10–100 l/perc | UIP16000 |
N/a | Nagyobb | klaszter UIP16000 |
Kapcsolat! / Kérdezzen tőlünk!
Irodalom / Hivatkozások
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Tények, amelyeket érdemes tudni
majomhimlő vírus
A majomhimlő (MPV, MPXV vagy hMPXV) a kettős szálú DNS-vírus faja, amely vírusos zoonózisos betegséget okoz. Ez a betegség majomhimlő-fertőzésként ismert, és emberekben és állatokban is előfordulhat. A Poxviridae családba tartozó Orthopoxvirus nemzetséghez tartozik. A majomhimlő vírus az egyik humán orthopoxvírus a variola (VARV), a tehénhimlő (CPX) és a vakcinia (VACV) vírusokkal együtt. Az orthopoxvírusokat nagy, tégla alakú vírusrészecskék jellemzik, amelyek körülbelül 200 000 bp kettős szálú DNS-genomot tartalmaznak.
ELISA-vizsgálat
Az ELISA az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatot jelenti, és egy címkézett immunvizsgálat, amelyet az immunvizsgálatok arany standardjának tekintenek. Az ELISA egy immunológiai teszt, amelyet magas diagnosztikai érzékenysége miatt értékelnek, molekulák, köztük antitestek, antigének, fehérjék, glikoproteinek és hormonok kimutatására és mennyiségi meghatározására használják. Az ELISA elve antigén-antitest kölcsönhatáson alapul. Ezzel az antigén-antitest kölcsönhatással a specifikus antitestek kötődnek a cél antigénhez. Csak akkor, ha az interakció megtörténik, a szubsztrát kötődhet az enzimhez, és egy későbbi szubsztrát átalakulás figyelhető meg, ami pozitív eredményt jelent.

Hielscher Ultrasonics gyárt nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorok labor hoz ipari méret.