Ultrahangos alkalmazások a MonkeyPox vírusban
Ultrasonication egy fontos feldolgozási módszer a majomhimlő vírus (MPXV) izolálására analitikus mintákból, a vírus DNS-fragmentációjához, valamint a majomhimlő vakcina gyártásához. A diagnosztika és elemzés előtti mintaelőkészítéshez (PCR, ELISA stb.) ultrahangos kezelést alkalmaznak a sejtek lírázására annak érdekében, hogy felszabadítsák a majomhimlő vírust a sejt belsejéből és / vagy széttöredezzék a DNS-t. A vakcinagyártásban az alkalmazások a vírusrészecske / DNS készítménytől, a gyógyszerhordozókba való kapszulázástól és az inokula kialakításától terjednek.
Az alábbiakban részletes információkat talál az ultrahangos majomhimlő vírus minta előkészítéséről, valamint az ultrahanggal segített MPXV vakcina előállításáról.
Mit talál ezen az oldalon:
- Ultrahangos lízis a majomhimlő vírus extrakciójához
- A Monkeypox vírus DNS ultrahangos töredezettsége
- Ultrahangos alkalmazások az MPXV vakcinagyártásban
Ez a rendszer 2x 1kW ultrahangos készülékek folyamatos áramlású működéshez telepítve van egy vakcinagyártó létesítményben.
Ultrahangos lízis és DNS-fragmentáció a polimeráz láncreakció (PCR) előtt
A majomhimlő vírusfertőzést nukleinsav-amplifikációs vizsgálattal (NAAT) detektáljuk, valós idejű vagy hagyományos polimeráz láncreakcióval (PCR) a vírus DNS egyedi szekvenciáinak kimutatására. A minta (pl. nasopharyngealis swapból vagy bőrbiopsziából) sejtekben tartalmazza a vírust.
Az elemzéshez a vírust ki kell szabadítani a sejtekből, és a vírus DNS-ét a PCR-hez kell töredezni.
Ultrahangos lízis:
Ultrahangos sejtzavar / lízis megbízható és hatékony módszer a vírusok izolálására a sejtmintákból, és ezáltal előnyösebb technika, mint a vegyi anyagok, például lizozim, proteináz K és különböző mosószerek, amelyeket alternatívaként használnak a sejt lízis és a DNS felszabadulásának elérésére.
Az ilyen kémiai reagensek használata azonban időigényes minta-előkészítést igényel a PCR-elemzés előtt több lépésben, hogy megakadályozzuk a PCR-reakció gátlását. Mivel a PCR-gátlók befolyásolják az amplifikáció hatékonyságát, a nem eltávolított inhibitorok mennyiségének kis változásai a PCR-termék amplifikációjának nagy változásaihoz vezethetnek (Diaco, 1995).
Az ultrahangos kezelés előnye a lízishez az, hogy a sejtszerkezetek teljes megzavarása és a DNS felszabadulása a lizáló reagensek és az időigényes mintaelőkészítés nélkül kívánatos. (vö. Fykse et al., 2003)
Ultrahangos DNS-fragmentáció:
Az ultrahangos DNS-fragmentáció egyszerű és megbízható, mivel a DNS-fragmensek hangolható hosszúságúak (basepairs, bp). Ultrahang segítségével a DNS hatékonyan töredezhető a megcélzott DNS-hosszra. Az ultrahangos paraméterek pontos ellenőrzése és a kifinomult hűtési lehetőségek megakadályozzák a DNS lebomlását.
Tudjon meg többet az ultrahangos DNS-fragmentációról!
Ultrahangos alkalmazások a Monkeypox vírus vakcinájában
A majomhimlő vírus ellen használt vakcinák jelenleg élő vírusvakcinák. Az újonnan kifejlesztett vakcinák más platformokat is használhatnak, például DNS-alapú A jelenleg egy módosított Vaccinia Ankara viurs-t, egy gyengített, nem replikált orthopoxvírust tartalmaz. Tris-t (tris-amino-metánt) és nátrium-kloridot is tartalmaz. A vakcina kis mennyiségű DNS-t és fehérjét is tartalmazhat a csirke embrió fibroblaszt sejtjeiből, amelyeket a vakcinavírus, a benzonáz és az antibiotikum vegyületek, például a gentamicin és a ciprofloxacin termesztésére használnak.
Az ultrahangos homogenizációt élő-attenuált vírusvakcinák, DNS-vakcinák, többértékű DNS-koktélok, mRNS-vakcinák, rekombináns fehérje vakcinák, vírusszerű részecskevakcinák stb. Előállítására használják.
- vírusrészecskék és -kórokozók diszperziója
- emulgeáló
- a vírusok inaktiválása
- gyógyszerhordozó készítmény (NLC, SLN)
- beágyazás
- az anyagok oldása
- adjuvánsok előkészítése
- Gáztalanítás / Levegőztetés
Részletesebb információkat találhat az ultrahangos alkalmazásokról a jobb vakcinagyártás érdekében!
Protokoll a monkeypox vírus ultrahangos izolálásához
Stittelaar kutatócsoportja (2005) ultrahangos lízissel szabadította fel a majomhimlő vírust a növekedési gazdasejttenyészetből, valamint a fertőzött főemlősök torokcseréje révén nyert sejtekből.
Majomhimlő vakcina készítmény:
A majomhimlő vírusokat specifikus kórokozóktól mentes csirke embrió fibroblaszt sejteken termesztették. Az 1-2 napos inkubálást követően a vírussejt-szuszpenziót egy fagyasztási-felolvasztási körrel betakarítottuk, majd centrifugálással sűrítettük. A pelletet újraszuszpendálták és ultrahangos homogenizációnak vetették alá.
Majomhimlő vírus izolálása vakcinázott makákóktól:
A mintákat háromszor fagyasztottuk-felolvasztottuk, és ultrahangos CupHorn-ban szonikáltuk. Két hígítást (1:10 és 1:100) használtunk fel az 1% magzati szarvasmarha szérummal kiegészített transzportközegben a Vero-sejtes egyrétegű rétegek hatkútú lemezekbe történő beoltására. 37°C-on történő 1 órás inkubálás után az inokulát eltávolítottuk, és 1% -os magzati szarvasmarha-szérummal kiegészített táptalajjal kiegészített táptalajjal helyettesített táptalajjal helyettesítettük. Az egyrétegűeket 5 napig 37°C-on tenyésztettük, és kristályliliga-oldattal megfestettük.
(vö. Stittelaar et al., 2005)
Ultrasonicators a víruselemzéshez és a vakcinagyártáshoz
Hielscher Ultrasonics széles termékportfólió ideális ultrahangos készüléket kínál kutatási és analitikai laboratóriumok, valamint ipari vakcinagyártás számára.
Hielscher Ultrasonics specializálódott a nagy teljesítményű ultrahangos készülékek és sono-bioreaktorok tervezésére, gyártására és forgalmazására a kutatási és analitikai laboratóriumokban való felhasználásra, valamint az ipari vakcinagyártásban való megvalósításra (pl. vakcinák, Api).
Az ultrahangos kezelés alkalmazható nyitott edényekre, zárt, folyamatosan kevert reaktorokra és folyamatos átfolyó reaktorokra. Az ultrahangos rendszerek minden része, amely érintkezik a folyékony közeggel, rozsdamentes acélból, titánból vagy üvegből készül. Az autoklávozható alkatrészek és a szaniter szerelvények biztosítják a gyártást gyógyszeripari minőségű állapotok.
Automatikus adatrögzítés: Értelmes szoftver hanglemezek a paraméterek-ból szonikáció folyamat gépiesen-on egységbe rendezett SD memória kártya. A folyamatparaméterek pontos vezérlése biztosítja a A reprodukálhatóság, a termelés szabványosítása, és megkönnyíti a gyógyszeripari termékbiztonsági előírások teljesítését.
Hielscher Ultrasonics’ az ultrahangos processzorok rendkívül megbízhatóak és pontosan vezérelhetők. Minden ipari ultrasonicator beállítható úgy, hogy a teljes tartományt az alacsonyabbtól a nagyon magas amplitúdókig szállítsa. A Hielscher ultrahangos rendszereinek robusztussága lehetővé teszi az 24/7 működést nagy teherbírású és igényes környezetben.
Az alábbi táblázat az ultrahangos készülékek hozzávetőleges feldolgozási kapacitását jelzi:
| Kötegelt mennyiség | Áramlási sebesség | Ajánlott eszközök |
|---|---|---|
| többkútos / mikrotiteres lemezek | N/a | UIP400MTP |
| 1 - 500 ml | 10-200 ml / perc | UP100H |
| 10-2000 ml | 20-400 ml / perc | Uf200 ः t, UP400St |
| 0.1-20L | 02 - 4 L / perc | UIP2000hdT |
| 10-100 liter | 2 - 10 l / perc | UIP4000hdT |
| N/a | 10 - 100 l / perc | UIP16000 |
| N/a | nagyobb | klaszter UIP16000 |
Lépjen kapcsolatba velünk! / Kérdezz minket!
Ultrahangos DNS nyírása
Átdolgozott Jkwchui alatt CC-BY-SA.03
Irodalom / Referenciák
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Tudni érdemes
Majomhimlő vírus
A majomhimlő (MPV, MPXV vagy hMPXV) a kettős szálú DNS-vírus egyik faja, amely vírusos zoonózisos betegséget okoz. Ezt a betegséget majomhimlő-fertőzésnek nevezik, és emberekben és állatokban is előfordulhat. A Poxviridae család Orthopoxvirus nemzetségéhez tartozik. A majomhimlő vírus az egyik emberi ortopoxvírus a variola (VARV), a cowpox (CPX) és a vaccinia (VACV) vírusok mellett. Az orthopoxvírusokat nagy tégla alakú vírusrészecskék jellemzik, amelyek kettős szálú, körülbelül 200 000 bp DNS-genomot tartalmaznak.
ELISA vizsgálat
Az ELISA az enzimhez kötött immunoszorbens assay rövidítése, és egy címkézett immunoassay, amelyet az immunvizsgálatok aranystandardjának tekintenek. Az ELISA egy immunológiai teszt, amelyet magas diagnosztikai érzékenysége miatt értékelnek, a molekulák, köztük antitestek, antigének, fehérjék, glikoproteinek és hormonok kimutatására és számszerűsítésére szolgál. Az ELISA elve egy antigén-antitest kölcsönhatáson alapul. Ezzel az antigén-antitest kölcsönhatással a specifikus antitestek kötődnek a célantigénhez. Csak akkor, ha a kölcsönhatás megtörténik, a szubsztrát kötődhet az enzimhez, és egy későbbi szubsztrát-átalakítás figyelhető meg, ami azt jelenti, hogy pozitív eredményt kapunk.
Hielscher Ultrahang gyárt nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorok Labor nak nek ipari méretben.