Sonikatsiooni abil toimuv valkude ekstraheerimine kasvajakudedest – protokoll

Käesolevas protokollis kirjeldatakse sonikatsiooniga toetatud valkude ekstraheerimise meetodit kasvajakudede jaoks, mis täiendab standardset CPTAC uurea lüüsi tööprotsessi, lisades kontrollitud sondide sonikatsiooni sammu koe lõhkumise ajal. Tuginedes väljakujunenud sügavale CPTAC-proteoomi ja fosfoproteoomi ettevalmistusstrateegiale, parandab see muudatus rakkude ja alamrakkude struktuuri lõhkumist, vähendab proovi viskoossust ja suurendab selliste valkude eraldumist, mida on tavaliselt raskem taastada ainult karbamiidilüüsiga, eriti membraaniga seotud ja DNA-siduvate või tuumaga seotud valkude puhul. Aluseks olevas uuringus suurendas sonikatsiooniga tööprotsess nii valkude kui ka fosfopeptiidide avastamist, säilitades samal ajal ühilduvuse järgnevate CPTAC-stiilis seedimise, TMT-märgistamise, fraktsioneerimise, fosfopeptiidide rikastamise ja LC-MS/MS-analüüsi torujuhtme vahel.

Sonikatsiooni abil toimuv valkude ekstraheerimine kasvajakudedest sügavproteoomiliseks ja fosfoproteoomiliseks analüüsiks

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Protokolli rakendusala

Kasutage seda protseduuri:

• värskelt külmutatud, krüopulveriseeritud kasvajakude
• rakupelletid või muud bioloogilised proovid, mille puhul on juba kehtestatud karbamiidipõhine ekstraheerimine
• globaalsed proteoomika ja fosfoproteoomika töövood, kasutades trüptilist lagundamist ja valikulist TMT-märgistamist

Li et al. (2025) uuringus märgitakse, et tööprotsess on kohaldatav ka teiste proovitüüpide, näiteks rakuliinide, vere ja uriini puhul, kuid seda võib olla vaja optimeerida vastavalt proovi tüübile.

Optimeeritud proovi ettevalmistamise tööprotsess koos rakendatud sonikatsioonietapiga. Optimeeritud tööprotsess ja katsekava põhinevad CPTAC-proovide ettevalmistamise protokollil globaalse proteoomilise ja fosfoproteoomilise analüüsi jaoks.
Uuring ja skeem: ©Li et al., 2025

Tööpõhimõte

Esialgses uuringus lisati sonikatsioon CPTACi standardse karbamiidlüüsi tööprotsessile ja leiti, et membraanide ja tuumadega seotud valkude tuvastamine on paranenud. Autorid märgivad, et sonikatsiooniparameetrid peavad olema peenhäälestatud proovi suuruse/kontsentratsiooni suhtes. – valides sonotroodi suuruse, energia sisendi ja impulsi ajastuse.

Näiteks Hielscher UP200Ht ja UP200St puhul tähendab see järgmist:

• kasutada amplituudi ja impulssrežiimi kui peamisi kontrollmuutujaid.
• hoida proovid kogu aeg külmas (st jääl).
• alustada konservatiivsete seadetega
• optimeerida proovi selguse, temperatuuri, valgu saagise ja järgneva peptiidi kvaliteedi suhtes.

 
Mõlemad Hielscheri 200 vatise sonikaatori mudelid UP200Ht ja UP200St on mõeldud väikeste ja keskmise suurusega proovide jaoks, reguleeritava amplituudi ja impulsside seadetega; mõlemad ultraheli homogenisaatorid pakuvad digitaalset puutetundlikku juhtimist parameetrite täpseks reguleerimiseks, automaatset andmete salvestamist, ühendatavat temperatuuriandurit, kaugjuhtimist, proovi valgustust.
 

Reaktiivid sonikatsiooniga toimuvaks valkude ekstraheerimiseks

Uurea lüüsipuhver

Valmistage värskelt vahetult enne kasutamist:

• 8 M uurea
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/ml aprotiniini
• 10 µg/ml leupeptiini
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Fosfataasi inhibiitorite kokteil 2, 1:100 (v/v)
• Fosfataasi inhibiitorite kokteil 3, 1:100 (v/v)

Enne lisaainete lisamist peab karbamiid olema täielikult lahustatud; inhibiitorid tuleb lisada vahetult enne kasutamist; puhvrit tuleb hoida jääl; ja pärast lisaainete lisamist on soovitatav pigem keerutada kui tugevalt keerutada.
 

Täiendavad reaktiivid:

• BCA valguanalüüsi reaktiivid
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jodoatsetamiid
• LysC
• Trüpsiini
• Sipelghape
• TMT-reaktiivid, kui kasutatakse multipleksitud kvantitatiivset proteoomikat
• IMAC-reaktiivid, kui viiakse läbi fosfopeptiidide rikastamine

Seadmed sonikatsiooni abil toimuvaks valkude ekstraheerimiseks

Nõutav

Soovitatav sondi valik

Umbes 200-1000 µl proovide puhul kasutage väikese läbimõõduga sonotroodi, mis sobib väikeste mahtude otseseks suure intensiivsusega töötlemiseks. Hielscher pakub mitut sonotroodi läbimõõtu ning väiksema läbimõõduga otsad tagavad suurema intensiivsuse otsas.

Praktiline märkus: kasutage väikseimat sondi, mis tagab tõhusa segamise ilma liigse vahutamise või anuma seintega kokkupuutumiseta.

Kui töötate korraga mitme prooviga, võite kaaluda järgmist Multi-Tube Sonicator VialTweeter või Microplate Sonicator UIP400MTP!

Samm-sammult juhised: Protseduur Sonikatsiooni abil toimuv valkude ekstraheerimine: Juhised: Sonikatsiooni abil toimuv valkude ekstraheerimine

A. Eeljahutamine ja ettevalmistamine

1. Jahutage tsentrifuugi temperatuurini 4 °C.
2. Valmistage värske uurea lüüsipuhver ja hoidke seda jääl.
3. Seadke UP200Ht või UP200St püsti helikarbi sees asuvale statiivile.
4. Valmistage ette piisavalt suur jäävann, et hoida proovitorusid püsti ja stabiilselt.

Värske puhvri ettevalmistamine ja külmtöötlemine on kriitilise tähtsusega.

B. Esialgne karbamiidi ekstraheerimine

1. Hoidke krüopulberiseeritud koe jääl.
2. Lisage 200 µl jahutatud uurea lüüsipuhvrit 50 mg märja koe kohta.
3. Vortex 5-10 s suurel kiirusel.
4. Inkubeerige 15 minutit 4 °C juures.
5. Korrake vortex-pluss-inkubatsiooni sammu veel kord.
6. Tsentrifuugige 10 minutit 4 °C juures 20 000 g juures.
7. Viige lüsaat/supernatant puhtasse madala sidumisvõimega katseklaasi.

C. Soniseerimine, kasutades UP200Ht või UP200St

Sonikatsiooni alustamise tingimused

• Amplituud: alates 20-30%.
• Impulsi pikkus: 5 s ON
• Jahutamine: 2 minutit jääl impulsside vahel.
• Tsüklite arv: Tsüklid: 4 tsüklit
• Aktiivse sonikatsiooni koguaeg: 20 s
• Protsessi koguaeg koos jahutusega: umbes 8-10 min.

Sonikatsiooni sammud

1. Viige lüsaat üle sonikatsiooni jaoks sobivasse torusse. Kasutage kitsaid, õhukese seinaga torusid, mis võimaldavad head soojusvahetust ja ohutut sondide sukeldumist.
2. Asetage toru jäävanni. Dokumendis on märgitud, et jahutamine sonikatsiooni ajal on kuumakahjustuste vältimiseks kriitilise tähtsusega.
3. Sukelduge sondi ots proovi. Hoidke otsa piisavalt sukeldatuna, et tagada stabiilne kavitatsioon, kuid ärge laske sellel puudutada toru seina või põhja.
4. Käivitage üks 5 s pikkune impulss algamplituudiga.
5. Viige proov kohe täielikult jääle 2 minutiks.
6. Korrake, kuni 4 tsüklit on läbitud.
7. Kontrollige lüsaati pärast tsüklit.
8. Jätkake ainult vajaduse korral, kasutades iga kord veel ühe 5 s pikkuse impulsi, millele järgneb alati täielik jahutamine.
9. Lõpetage, kui lüsaat muutub ühtlasemaks ja vähem viskoosseks.
   Lõpptulemus on läbipaistvam lüsaat, mis moodustab pigem tilkasid kui pidevat viskoosset voolu.
10. Tsentrifuugige umbes 16 000 g juures 15 minutit 4 °C juures.
11. Viige selitatud supernatant uude katseklaasi ja mõõtke valgu kontsentratsioon.

Globaalse proteoomika ja fosfoproteoomika võrdlus soniseeritud ja mittesooniseeritud proovide vahel.
a. Identifitseeritud valkude arv (globaalne proteoomika) kõigis PDX-tuumorikudedes koos sonikatsiooniga või ilma. b. Identifitseeritud fosfopeptiidide arv (IMAC-rikastamine) kõigis PDX-tuumorikudedes koos sonikatsiooniga või ilma. Arvesse võeti ainult need valgud ja fosfopeptiidid, mille arvukuse suhe on suurem või võrdne 25. protsentiiliga. Arvutati arvukuse suhe sama tüüpi proovide vahel.
Uuring ja graafikud: ©Li et al., 2025

Edasine seedimine ja analüüs

Pärast sonikatsiooni ja selgitustööd jätkatakse vastavalt algsele CPTAC-stiilis tööprotsessile:

1. Lahjendatakse lüsaat 1:3 (v/v) 50 mM Tris-HCl pH 8,0-ga, et vähendada karbamiidi sisaldust kuni <2 M.
2. Lisage LysC 1 mAU 50 µg valgu kohta ja inkubeerige 2 tundi 25 °C juures.
3. Lisage trüpsiini 1:49 ensüüm:substraat (massiprotsent) ja digestaage üleöö 25 °C juures.
4. Kustutatakse sipelghappega kuni 1% lõpuni.
5. Jätkatakse soolatustamise, TMT-märgistamise, fraktsioneerimise, fosfopeptiidide rikastamise ja LC-MS/MS-ga vastavalt vajadusele.

TMT-ga märgistatud MS fosfopeptiidide diferentseeritud ekspressioon.
a. Basaalne alamtüüp, mis tõstab esile mõned inimese fosfopeptiidid (valgu_järjestuse algus ja lõpp), mis on soniseeritud proovides võrreldes nonsooniseeritud proovidega ülesreguleeritud. b. Luminaalne alamtüüp, mis tõstab esile mõned inimese fosfopeptiidid (valgu_järjestuse algus ja lõpp), mis on soniseeritud proovides võrreldes nonsooniseeritud proovidega ülesreguleeritud. c. Rikastatud KEGG-radad, mis põhinevad ülesreguleeritud fosfopeptiidide valkudel soniseeritud basaalses alatüübis kasvajatel. d. Rikastatud KEGG-radad, mis põhinevad ülesreguleeritud fosfopeptiidide valkudel soniseeritud luminaalses alatüübis kasvajatel.
Uuring ja graafikud: ©Li et al., 2025

Disain, tootmine ja nõustamine – Kvaliteet Valmistatud Saksamaal

Hielscheri ultrasonikaatorid on tuntud oma kõrgeimate kvaliteedi- ja disainistandardite poolest. Vastupidavus ja lihtne kasutamine võimaldavad meie ultrasonikaatorite sujuvat integreerimist tööstusrajatistesse. Hielscheri ultrasonikaatorid saavad kergesti käsitseda karmid tingimused ja nõudlikud keskkonnad.

Hielscher Ultrasonics on ISO sertifitseeritud ettevõte ja paneb erilist rõhku suure jõudlusega ultrasonikaatoritele, millel on tipptasemel tehnoloogia ja kasutajasõbralikkus. Loomulikult on Hielscheri ultrasonikaatorid CE-nõuetele vastavad ja vastavad UL, CSA ja RoHs nõuetele.

Kirjandus / Viited