Ultraheli abil toimuv valgu ekstraheerimine kasvajakoest – protokoll

See protokoll kirjeldab ultraheli abil toimuvat valgu ekstraheerimise meetodit kasvajakoe jaoks, mis täiendab standardset CPTAC uurea lüüsi töövoogu kontrollitud sondiga ultraheli töötluse (sonikeerimise) etapiga koe desintegreerimisel. Tuginedes väljakujunenud sügavaulatuslikule CPTAC proteoomi ja fosfoproteoomi proovide ettevalmistamise strateegiale, parandab see muudatus rakkude ja subtsellulaarsete struktuuride lõhkumist, vähendab proovi viskoossust ja soodustab selliste valkude vabanemist, mida on ainult uurea lüüsiga tavaliselt raskem kätte saada, eriti membraaniga seotud ning DNA-d siduvate või tuumaga seotud valkude vabanemist. Aluseks olnud uuringus suurendas ultraheli abil toimuv töövoog nii valkude kui ka fosfopeptiidide tuvastamist, säilitades samal ajal ühilduvuse järgnevate CPTAC-stiilis seedimise, TMT märgistamise, fraktsioneerimise, fosfopeptiidide rikastamise ja LC-MS/MS analüüsi etappidega.

Ultraheli abil toimuv valgu ekstraheerimine kasvajakoest sügavaulatuslikuks proteoomseks ja fosfoproteoomseks analüüsiks

Järgnev protokoll on optimeeritud valkude ekstraheerimiseks krüopulveriseeritud kasvajakoest 8 M uurea lüüsipuhvris: lisatud sondtüüpi ultraheli töötluse etapp parandab raskesti kättesaadavate valguklasside, eriti membraaniga seotud ning DNA-ga/tuumaga seotud valkude saagist enne seedimist ja järgnevat LC-MS/MS analüüsi. Li et al. (2025) aluseks olnud uuringus suurendas ultraheli töötluse lisamine membraaniga ja tuumaga seotud valkude tuvastamist ning toetas nende töövoo puhul sügavaulatuslikku katvust: >12 000 valku ja >25 000 fosfopeptiidi.

Protokolli kasutusala

Kasutage seda protseduuri järgmiseks:

• värskelt külmutatud, krüopulveriseeritud kasvajakude
• rakusademed või muud bioloogilised proovid, mille puhul on uureapõhine ekstraheerimine juba väljakujunenud
• globaalse proteoomika ja fosfoproteoomika töövood, kus kasutatakse trüptilist seedimist ja valikuliselt TMT märgistamist

Li et al. (2025) uuring väidab, et töövoog on kohaldatav ka teist tüüpi proovidele, näiteks rakuliinidele, verele ja uriinile, kuid proovi tüübist sõltuvalt võib olla vajalik optimeerimine.

Optimeeritud proovide ettevalmistamise töövoog rakendatud ultraheli töötluse etapiga. Optimeeritud töövoog ja katsekavand põhinevad CPTAC proovide ettevalmistamise protokollil globaalseks proteoomseks ja fosfoproteoomseks analüüsiks.
Uuring ja skeem: ©Li et al., 2025

Tööpõhimõte

Algses uuringus lisati standardsele CPTAC uurea lüüsi töövoole ultraheli töötlus ning leiti, et membraanide ja tuumadega seotud valkude tuvastamine paranes. Autorid märgivad, et ultraheli töötluse parameetreid tuleb täpselt häälestada vastavalt proovi suurusele/kontsentratsioonile – valides sonotroodi suuruse, energiasisendi ja impulsside ajastuse.

Näitena tähendab see Hielscheri UP200Ht ja UP200St puhul järgmist:

• kasutage peamiste juhtmuutujatena amplituudi ja impulssrežiimi
• hoidke proove kogu aeg külmana (nt jääl)
• alustage konservatiivsete seadistustega
• optimeerige proovi selguse, temperatuuri, valgusaagise ja järgneva peptiidikvaliteedi alusel

Mõlemad Hielscheri 200-vatised sonikaatori mudelid UP200Ht ja UP200St on mõeldud väikestele ja keskmistele proovimahtudele, reguleeritava amplituudi ja impulsiseadistustega; mõlemad ultraheli homogenisaatorid pakuvad digitaalset puuteekraaniga juhtimist täpseks parameetrite seadistamiseks, automaatset andmete salvestamist, ühendatavat temperatuuriandurit, kaugjuhtimist ja proovi valgustust.

Reagendid ultraheli abil toimuvaks valgu ekstraheerimiseks

Uurea lüüsipuhver

Valmistage värskelt vahetult enne kasutamist:

• 8 M uurea
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotiniin
• 10 µg/mL leupeptiin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Fosfataasi inhibiitorite kokteil 2, 1:100 (v/v)
• Fosfataasi inhibiitorite kokteil 3, 1:100 (v/v)

Uurea peab olema enne lisandite lisamist täielikult lahustunud; inhibiitorid tuleks lisada vahetult enne kasutamist; puhvrit tuleks hoida jääl; ning pärast lisandite lisamist on soovitatav lahust õrnalt keerutada, mitte jõuliselt vortekssegada.

Lisareagendid:

• BCA valgutesti reagendid
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jodoatsetamiid
• LysC
• Trüpsiin
• Sipelhape
• TMT reagendid, kui kasutatakse multipleksset kvantitatiivset proteoomikat
• IMAC reagendid, kui teostatakse fosfopeptiidide rikastamist

Seadmed ultraheli abil toimuvaks valgu ekstraheerimiseks

Vajalik

Soovitatav sondi valik

Proovide puhul, mille maht on umbes 200–1000 µL, kasuta väikese läbimõõduga sonotroodi, mis sobib väikeste mahtude otseseks suure intensiivsusega töötluseks. Hielscher pakub mitut sonotroodi läbimõõtu ning väiksema läbimõõduga otsad tagavad otsa juures suurema intensiivsuse.

Praktiline märkus: kasuta väikseimat sondi, mis tagab tõhusa segunemise ilma liigse vahutamise või anuma seinaga kokkupuuteta.

Kui töötad korraga mitme proovi kallal, võid kaaluda mitme tuubi sonikaatorit VialTweeter või mikroplaadi sonikaatorit UIP400MTP!

Samm-sammulised juhised: ultraheli abil toimuva valgu ekstraheerimise protseduur

A. Eelnev jahutamine ja ettevalmistus

1. Jahuta tsentrifuug temperatuurini 4°C.
2. Valmista värske uurea lüüsipuhver ja hoia seda jääl.
3. Paigalda UP200Ht või UP200St statiivile helikaitsekambri sees.
4. Valmista ette jäävann, mis on piisavalt suur, et hoida proovituubid püsti ja stabiilselt.

Värske puhvri valmistamine ja külmana käsitsemine on kriitilise tähtsusega.

B. Esialgne uurea ekstraktsioon

1. Hoia krüopulveriseeritud kude jääl.
2. Lisa 200 µL jahutatud uurea lüüsipuhvrit 50 mg märja koe kohta.
3. Vortexi 5–10 s suurel kiirusel.
4. Inkubeeri 15 min temperatuuril 4°C.
5. Korda vortexi ja inkubeerimise sammu veel üks kord.
6. Tsentrifuugi 20 000g juures 10 min temperatuuril 4°C.
7. Tõsta lüsaat/supernatant puhtasse vähese seondumisega tuubi.

C. Ultraheli töötlus (sonikeerimine) sonikaatoriga UP200Ht või UP200St

Ultraheli töötluse algtingimused

• Amplituud: alusta 20–30%-lt
• Pulsi kestus: 5 s sees
• Jahutamine: 2 min jääl pulsside vahel
• Tsüklite arv: 4 tsüklit
• Aktiivse ultraheli töötluse koguaeg: 20 s
• Protsessi koguaeg koos jahutamisega: umbes 8–10 min

Ultraheli töötluse sammud

1. Tõsta lüsaat ultraheli töötluseks sobivasse tuubi. Kasuta kitsast õhukese seinaga tuubi, mis võimaldab head soojusvahetust ja sondi ohutut sukeldamist.
2. Aseta tuub jäävanni. Artikkel määratleb jahutamise ultraheli töötluse ajal kriitilisena kuumakahjustuse vältimiseks.
3. Sukelda sondi ots proovi. Hoia ots piisavalt sügavalt sukeldatuna stabiilse kavitatsiooni tagamiseks, kuid ära lase sel puutuda vastu tuubi seina ega põhja.
4. Tee üks 5 s pulss algamplituudil.
5. Pane proov kohe täielikult tagasi jääle 2 minutiks.
6. Korda, kuni 4 tsüklit on lõpule viidud.
7. Kontrolli lüsaati pärast tsüklit.
8. Jätka ainult vajaduse korral, kasutades korraga üht lisapulssi 5 s, millele järgneb alati täielik jahutamine.
9. Lõpeta, kui lüsaat muutub ühtlasemaks ja vähem tõmbleväks/viskoosseks.
   Lõpp-punktiks on läbipaistvam lüsaat, mis moodustab tilku, mitte pidevat viskoosset voolu.
10. Tsentrifuugi umbes 16 000g juures 15 min temperatuuril 4°C.
11. Tõsta selitunud supernatant uude tuubi ja mõõda valgukontsentratsioon.

Globaalse proteoomika ja fosfoproteoomika võrdlus ultraheli abil töödeldud ja töötlemata proovide vahel.
a. Tuvastatud valkude arv (globaalne proteoomika) kõigis PDX-kasvajakudedes ultraheli töötlusega või ilma. b. Tuvastatud fosfopeptiidide arv (IMAC-rikastamine) kõigis PDX-kasvajakudedes ultraheli töötlusega või ilma. Arvesse võeti ainult valgud ja fosfopeptiidid, mille ohtruse suhe oli suurem või võrdne 25. protsentiiliga. Ohtruse suhe arvutati samat tüüpi proovide vahel.
Uuring ja graafikud: ©Li et al., 2025

Järgnev lagundamine ja analüüs

Pärast ultraheli töötlust ja selitamist jätka nii, nagu on kirjeldatud algses CPTAC-stiilis töövoos:

1. Lahjenda lüsaati suhtega 1:3 (v/v) 50 mM Tris-HCl-ga pH 8,0, et vähendada uurea sisaldust alla 2 M.
2. Lisa LysC 1 mAU 50 µg valgu kohta ja inkubeeri 2 h temperatuuril 25°C.
3. Lisa trüpsiin suhtega 1:49 ensüüm:substraat (w/w) ja lagunda üleöö temperatuuril 25°C.
4. Peata reaktsioon sipelhappega lõppkontsentratsioonini 1%.
5. Jätkake vastavalt vajadusele soolade eemaldamise, TMT märgistamise, fraktsioneerimise, fosfopeptiidide rikastamise ja LC-MS/MS analüüsiga.

Fosfopeptiidide diferentsiaalne ekspressioon TMT-märgistatud MS puhul.
a. Basaalne alatüüp, kus on esile tõstetud mõned inimese fosfopeptiidid (valgujärjestuse algus ja lõpp), mille ekspressioon on ultraheliga töödeldud proovides kõrgem kui ultraheliga töötlemata proovides. b. Luminaalne alatüüp, kus on esile tõstetud mõned inimese fosfopeptiidid (protein_sequence algus ja lõpp), mille ekspressioon on ultraheliga töödeldud proovides kõrgem kui ultraheliga töötlemata proovides. c. Rikastatud KEGG-rajad, mis põhinevad ultraheliga töödeldud basaalse alatüübi kasvajates ülesreguleeritud fosfopeptiidide valkudel. d. Rikastatud KEGG-rajad, mis põhinevad ultraheliga töödeldud luminaalse alatüübi kasvajates ülesreguleeritud fosfopeptiidide valkudel.
Uuring ja graafikud: ©Li et al., 2025

Projekteerimine, tootmine ja nõustamine – Saksamaal valmistatud kvaliteet

Hielscheri ultraheliseadmed on tuntud oma kõrgeima kvaliteedi ja disainistandardite poolest. Töökindlus ja lihtne kasutus võimaldavad meie ultraheliseadmeid sujuvalt integreerida tööstusrajatistesse. Hielscheri ultraheliseadmed tulevad hõlpsasti toime karmide tingimuste ja nõudlike keskkondadega.

Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifitseeritud ettevõte ja pöörab erilist tähelepanu suure jõudlusega ultraheliseadmetele, mis ühendavad tipptehnoloogia ja kasutajasõbralikkuse. Loomulikult vastavad Hielscheri ultraheliseadmed CE nõuetele ning UL-i, CSA ja RoHs nõuetele.

Kirjandus / viited

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.