Ultraheli filtriga toetatud proovide ettevalmistus (FASP): proteoomika töövoogude täiustamine arenenud ultraheli töötlusega

Ultraheli filtriga toetatud proovide ettevalmistus (FASP) on kujunemas tänapäevases proteoomikas väga tõhusaks ja korratavaks meetodiks. Kui kontrollitud ultraheli töötlus (sonikeerimine) integreeritakse väljakujunenud FASP-töövoogudesse, saavad teadlased oluliselt parandada valkude ekstraktsiooni, seedimise efektiivsust ja andmete üldist kvaliteeti. Kasvava nõudluse tõttu suure läbilaskevõimega ja korratava proovide ettevalmistuse järele on fokuseeritud sonikaatorid, näiteks mikroplaadi sonikaator UIP400MTP, üha olulisemad nii teaduslikult kui ka praktiliselt.

Teaduslik taust: miks FASP on proteoomikas oluline

Filtriga toetatud proovide ettevalmistusest (FASP) on saanud bottom-up proteoomika kuldstandard, kuna see võimaldab eemaldada detergente, soolasid ja muid saasteaineid ning tagab samal ajal tõhusa ensümaatilise seedimise. Klassikalistel FASP-protokollidel on aga sageli piirangud, mis on seotud mittetäieliku lüüsi, ebaühtlase seedimise ja proovide varieeruvusega – eriti keeruliste või vastupidavate bioloogiliste rakkude või kudede puhul.
Siin pakub fokuseeritud ultrahelienergia (ultraheli töötlus) otsustavat eelist. Mehaaniliste nihkejõudude ja kavitatsiooni tekitamisega parandab ultraheli töötlus mitut FASP-töövoo kriitilist etappi, kahjustamata valgu terviklikkust.

Ultraheli töötluse positiivsed mõjud ultraheli FASP-is

Ultraheli töötlus tekitab kontrollitud akustilist kavitatsiooni – mikroskoopiliste mullide teket ja kollapsit –, mis põhjustab lokaalseid nihkejõude ja mikrovoolusid.
Ultraheli töötlus parandab ultraheli FASP-is nii alküleerimis- kui ka seedimisetappi, sest see parandab massiülekannet ja kiirendab reaktsioonikineetikat. Ultrahelienergia rakendamine tekitab kavitatsiooni, mis põhjustab lokaalseid mikrovoolusid ja mööduvaid nihkejõude, mis soodustavad kiiret segunemist ja reagentide tõhusat tungimist valgumaatriksisse või filtri keskkonda. Alküleerimisel toob see kaasa tsüsteiinijääkide ühtlasema ja kiirema modifitseerimise jodoatsetamiidiga. Seedimisetapis suurendab ultraheli töötlus proteolüütiliste lõikekohtade kättesaadavust ning parandab ensüümi ja substraadi vastasmõjusid, kiirendades seeläbi trüpsiini aktiivsust ja tõstes seedimise efektiivsust. Üldiselt lühendab ultraheli töötlemine protsessi kestust, säilitades või parandades samal ajal reaktsiooni täielikkust ja korratavust.

Proteoomika proovide ettevalmistuses tähendab ultraheli FASP järgmist:

• Tõhusam rakkude lõhkumine (desintegreerimine) ja valkude ekstraktsioon isegi tugevates kudedes või mikroobiproovides
• Valkude parem solubiliseerimine
• Ensüümi parem ligipääsetavus seedimise ajal
• Lühem töötlemisaeg ja suurem korratavus

Erinevalt tavapärastest mehaanilistest või keemilistest lüüsimeetoditest on ultraheli töötlemine hästi kontrollitav ja skaleeritav, mistõttu sobib see eriti hästi standardiseeritud proteoomika töövoogudesse.

Ultraheli FASP-i eelised tavapäraste meetoditega võrreldes

Sonikeerimise integreerimine FASP-protokollidesse annab mõõdetavaid eeliseid, mis mõjutavad otseselt järgneva massispektromeetria tulemusi.
Ultraheli FASP võimaldab valke täielikumalt taastada, eriti keerukatest proovidest, näiteks kiulistest kudedest või biokiledest. Ühtlane energiajaotus tagab korduste vahel järjepideva töötluse ja vähendab varieeruvust – see on kvantitatiivse proteoomika jaoks hädavajalik nõue.
Lisaks kiirendab ultraheli töötlus seedimise kineetikat, parandades ensüümi ja substraadi vastasmõju. Selle tulemusel lüheneb seedimisaeg sageli ja peptiidide saagis suureneb, säilitades samal ajal järjestuse katvuse.
Töövoo seisukohast vähendavad ultraheli süsteemid käsitsi sekkumist ja kõrvaldavad vajaduse agressiivsete keemiliste töötluste järele, säilitades proovi terviklikkuse ja lihtsustades protokolli standardiseerimist.

Venni diagramm, mis näitab ultraheli FASP-iga identifitseeritud valkude suuremat arvu võrreldes üleöö-FASP-iga
Pilt ja uuring: ©Carvalho et al., 2020

Protokoll: suure läbilaskevõimega ultraheli-FASP seadmega UIP400MTP

Suuri proovikohortide töötlevatele laboritele võimaldab mikroplaadi sonikaator UIP400MTP standardsete mitme süvendiga plaatide (nt 96-süvendilised plaadid) samaaegset ultraheli töötlust, mis suurendab oluliselt läbilaskevõimet ja reprodutseeritavust.
Selles formaadis valmistatakse proovid (tavaliselt 50–200 µL süvendi kohta) ette otse mikroplaatides, mis sobivad ultrafiltratsiooniks või järgnevaks töötlemiseks. Lüüsipuhvrid on sarnased tavapärastes FASP-protokollides kasutatavatega.

UIP400MTP rakendab ühtlast ultraheli energiat kõigis süvendites. Ultraheli töötlus (sonikeerimine) toimub tavaliselt 60–80% amplituudil 2–4 minutit, olenevalt proovi tüübist. Jälgige temperatuuri ühendatava temperatuurianduri abil. Kasutage pulseerivat ultraheli töötlust ja soovi korral laborikülmutit.

Näidisprotokoll:

1. Alküleerimisetapis sonikeeritakse proove mikroplaadi sonikaatoriga (UIP400MTP) 40% amplituudil 7 tsükli jooksul (30 s sees, 15 s väljas; ultraheli töötluse kogukestus: 5 min 45 s).
2. Pärast ultraheli töötlust eemaldatakse jodoatseetamiidi (IAA) lahus tsentrifuugimisega. Enne trüpsiiniga lagundamist tuleb proove pesta, et eemaldada jääkkarbamiid, tugev kaotroopne aine, mis pärsib ensümaatilist aktiivsust. Seetõttu pestakse proove kaks korda 200 μL 25 mM ammooniumvesinikkarbonaadiga (AmBic).
3. Seejärel lisatakse 100 μL trüpsiinilahust (ensüümi ja valgu suhe 1:30), mis on valmistatud 12,5 mM ammooniumvesinikkarbonaadis. Valkude lagundamine viiakse seejärel läbi seadmega UIP400MTP samadel ultraheli töötluse tingimustel (40% amplituud, 7 tsüklit, 30 s sees / 15 s väljas; kogukestus: 5 min 45 s).
4. Pärast ultraheli töötlust kantakse proovid üle filterplaatidele või töödeldakse plaadipõhiste FASP-süsteemidega. Redutseerimis- ja alküleerimisetapid viiakse läbi plaadil, säilitades sujuva töövoo.
5. Trüpsiiniga lagundamine toimub kontrollitud tingimustel (nt 37°C, 4–16 tundi), võimaldades vajadusel lühiajalist ultraheli stimulatsiooni ensümaatilise aktiivsuse kiirendamiseks ja peptiidide saagise parandamiseks.
6. Peptiidid kogutakse tsentrifuugimisega ja need on valmis LC-MS/MS analüüsiks.

Selle süsteemi peamine eelis seisneb võimes tagada identsed töötlustingimused kõigis süvendites, mis minimeerib partiiefekte ja võimaldab usaldusväärseid kvantitatiivseid võrdlusi ulatuslikes proteoomika uuringutes.

Disain, tootmine ja nõustamine – Saksamaal valmistatud kvaliteet

Hielscheri ultrahelitöötlusseadmed on tuntud oma kõrgeima kvaliteedi ja disainistandardite poolest. Töökindlus ja lihtne kasutamine võimaldavad meie ultrahelitöötlusseadmeid sujuvalt tööstusrajatistesse integreerida. Hielscheri ultrahelitöötlusseadmed tulevad kergesti toime rasketes tingimustes ja nõudlikes keskkondades.

Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifitseeritud ettevõte ja pöörab erilist tähelepanu suure jõudlusega ultrahelitöötlusseadmetele, mis on varustatud tipptasemel tehnoloogia ja kasutajasõbralikkusega. Loomulikult vastavad Hielscheri ultrahelitöötlusseadmed CE nõuetele ning UL-i, CSA ja RoHs nõuetele.

Kirjandus / viited

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).