Ultraheli filtri abil toimuv proovide ettevalmistamine (FASP): proteoomika töövoogude täiustamine täiustatud sonikatsiooniga
Ultraheli filtri abil toimuv proovide ettevalmistamine (FASP) on kujunemas väga tõhusaks ja korratavaks meetodiks kaasaegses proteoomikas. Integreerides kontrollitud sonikatsiooni väljakujunenud FASP-tööprotsessidesse, saavad teadlased märkimisväärselt parandada valkude ekstraheerimist, lagundamise tõhusust ja üldist andmete kvaliteeti. Seoses kasvava nõudlusega suure läbilaskevõimega ja korratava proovide ettevalmistamise järele on teaduslik ja praktiline tähtsus suurenemas sihipärastatud sonikaatorite, nagu mikroplaatide sonikaator UIP400MTP, abil.
Teaduslik kontekst: Miks FASP on proteoomikas oluline?
Filtri abil toimuvast proovide ettevalmistamisest (FASP) on saanud alt-üles proteoomika kuldstandard, kuna see võimaldab eemaldada detergendid, soolad ja muud saasteained, võimaldades samal ajal tõhusat ensümaatilist lagundamist. Siiski on klassikaliste FASP-protokollide puhul sageli piirangud, mis on seotud mittetäieliku lüüsi, ebajärjekindla seedimisega ja proovi varieeruvusega. – especially when dealing with complex or resilient biological cells or tissues.
See on koht, kus keskendunud ultraheli energia (sonikatsioon) annab otsustava eelise. Mehhaaniliste nihkejõudude ja kavitatsiooni abil parandab sonikatsioon mitmeid kriitilisi etappe FASP-tööprotsessis, ilma et see kahjustaks valkude terviklikkust.
Mitme kaevuga plaadi sonikaatori UIP400MTP hõlbustab filtri abil toimuvat proovide ettevalmistamist (FASP)
Sonikatsiooni positiivne mõju ultraheli FASP-süsteemis
Sonikatsioon toob kaasa kontrollitud akustilise kavitatsiooni. – mikroskoopiline mullide moodustumine ja kokkuvarisemine – mis tekitab lokaalseid nihkejõude ja mikrovoolu.
Soniseerimine tõhustab ultraheli-FASPs nii alküülimise kui ka lagundamise etappe, parandades massiülekannet ja kiirendades reaktsiooni kineetikat. Ultraheli energia rakendamine tekitab kavitatsiooni, mis viib lokaalse mikrovoolu ja ajutiste nihkejõudude tekkimiseni, mis soodustavad kiiret segunemist ja reaktiivide tõhusat tungimist valgu maatriksisse või filtrikeskkonda. Alkülimise ajal toob see kaasa tsüsteiini jääkide ühtlasema ja kiirema modifitseerimise jodoatsetamiidiga. Digestiooni etapis suurendab sonikatsioon proteolüütiliste lõhustamiskohtade kättesaadavust ja parandab ensüümi ja substraadi vastastikmõju, kiirendades seeläbi trüpsiini aktiivsust ja suurendades digestiooni tõhusust. Üldiselt vähendab ultrahelitöötlus töötlemisaega, säilitades või parandades samas reaktsiooni täielikkust ja reprodutseeritavust.
Proteoomika proovide ettevalmistamisel tähendab ultraheli FASP:
- Tõhusam rakkude lõhkumine ja valkude ekstraheerimine, isegi rasketes kudedes või mikroobiproovides.
- Valkude tõhustatud solubiliseerimine
- Parem ensüümide kättesaadavus seedimise ajal
- Vähendatud töötlemisaeg ja suurem reprodutseeritavus
Erinevalt tavapärastest mehaanilistest või keemilistest lüüsimeetoditest on ultrahelitöötlus väga hästi kontrollitav ja skaleeritav, mistõttu sobib see eriti hästi standardiseeritud proteoomika töövoogude jaoks.
UIP400MTP ei ole ultraheli vann. See on kõrge intensiivsusega tassisarv keskendunud ultrahelitöötluseks. See võimas kontaktivaba sonikaator tagab ühtlase ultrahelitöötluse teie standardse kaevuplaadi kõigis kaevudes. Teil on täpne kontroll amplituudi, võimsuse ja pulseerimise üle. Sisseehitatud taimer ja temperatuuriandur tagavad ühtlased tulemused. Plaadi sonikaatori UIP400MTP jahutab proove veevanniga (väline jahuti valikuline).
Ultraheli FASP eelised tavapäraste meetodite ees
Sonikatsiooni integreerimine FASP-protokollidesse annab mõõdetavaid eeliseid, mis mõjutavad otseselt järgneva etapi massispektromeetria tulemusi.
Ultraheli FASP võimaldab täielikumat valkude taastamist, eriti sellistest keerulistest proovidest nagu kiulised koed või biokiled. Ühetaoline energiajaotus tagab järjepideva töötlemise korduste lõikes, vähendades varieeruvust. – kvantitatiivse proteoomika oluline nõue.
Lisaks kiirendab sonikatsioon seedimise kineetikat, parandades ensüümi ja substraadi vastastikmõju. Selle tulemuseks on sageli lühemad lagundamisajad ja suurem peptiidide saagis, säilitades samas järjestuse katvuse.
Töökorralduse seisukohast vähendavad ultrahelisüsteemid käsitsi sekkumist ja kõrvaldavad vajaduse agressiivse keemilise töötlemise järele, säilitades proovi terviklikkuse ja lihtsustades protokolli standardimist.
Venn diagramm, mis näitab ultraheli FASP abil tuvastatud valkude arvu suurenemist võrreldes üleöö FASP-ga.
Pilt ja uuring: ©Carvalho et al., 2020
UIP400MTP mitme süvendi plaadi sonikaator filtri abil toimuvaks proovide ettevalmistamiseks (FASP)
Protokoll: UIP400MTP abil läbiviidav ultraheli FASP.
For laboratories processing large sample cohorts, the UIP400MTP microplate sonicator enables simultaneous sonication of standard multi-well plates (e.g., 96-well plates), significantly increasing throughput and reproducibility.
Selles formaadis valmistatakse proovid (tavaliselt 50-200 µl kaevu kohta) otse mikroplaatides, mis sobivad ultrafiltreerimise või järeltöötlusega. Lüüsipuhvrid on sarnased standardsetes FASP-protokollides kasutatavatele puhvritele.
UIP400MTP rakendab ühtlast ultraheli energiat kõigis kaevudes. Soniseerimine toimub tavaliselt 60-80% amplituudiga 2-4 minutit, sõltuvalt proovi tüübist. Jälgige temperatuuri, kasutades ühendatavat temperatuuriandurit. Kasutades pulseeritud sonikatsiooni ja valikuliselt laboratooriumi jahutusseadet.
Näidisprotokoll:
- For the alkylation step, samples are sonicated using the microplate sonicator (UIP400MTP) at 40% amplitude for 7 cycles (30 s ON, 15 s OFF; total sonication time: 5 min 45 s).
- Pärast sonikatsiooni eemaldatakse jodoatsetamiidi (IAA) lahus tsentrifuugimise teel. Enne trüpsiini lagundamist tuleb proovid pesta, et eemaldada karbamiidijäägid, mis on tugev kaotroopne aine, mis inhibeerib ensüümset aktiivsust. Seetõttu pestakse proovid kaks korda 200 μl 25 mM ammooniumvesinikkarbonaadiga (AmBic).
- Seejärel lisatakse 100 μl trüpsiini lahust (ensüümi ja valgu suhe 1:30), mis on valmistatud 12,5 mM ammooniumvesinikkarbonaadis. Seejärel toimub valkude lagundamine UIP400MTP abil samades sonikatsioonitingimustes (40% amplituud, 7 tsüklit, 30 s ON / 15 s OFF; koguaeg: 5 min 45 s).
- Pärast sonikatsiooni kantakse proovid üle filtriplaatidele või töödeldakse plaatidel põhinevate FASP-süsteemide abil. Redutseerimise ja alküülimise etapid viiakse läbi plaatides, säilitades sujuvama töövoo.
- Trüpsiini lagundamine toimub kontrollitud tingimustes (nt 37 °C, 4-16 tundi), kusjuures ensüümide aktiivsuse kiirendamiseks ja peptiidide saagise parandamiseks on võimalik kasutada lühiajalist ultraheli stimulatsiooni.
- Peptiidid saadakse tsentrifuugimise teel tagasi ja on valmis LC-MS/MS analüüsiks.
Selle süsteemi peamine eelis seisneb selles, et see suudab tagada ühesugused töötlemistingimused kõigis puuraukudes, minimeerides partiide mõju ja võimaldades ulatuslikes proteoomika-uuringutes usaldusväärseid kvantitatiivseid võrdlusi.
VialTweeter Multi-Tube Sonicator kiirendab ja parandab filtri abil toimuvat proovide ettevalmistamist (FASP) proteoomikas
Teaduslik tähtsus
Sonikatsiooni integreerimine FASPi töövoogudesse ei ole pelgalt tehniline täiustus. – see kujutab endast metoodilist arengut proteoomika proovide ettevalmistamisel. Kuna valdkond liigub suurema läbilaskevõime, automatiseerimise ja reprodutseeritavuse suunas, lahendavad ultrahelitehnoloogiad põhilisi kitsaskohti proovide töötlemisel.
Hiljutised uuringud rõhutavad üha enam proovide järjepideva ettevalmistamise tähtsust usaldusväärsete biomarkerite avastamiseks ja kvantitatiivseks proteoomikaks. Ultraheli FASP aitab otseselt kaasa selle eesmärgi saavutamisele, parandades ekstraheerimise tõhusust, lagundamise järjepidevust ja üldist töökorralduse usaldusväärsust.
Lisaks sellele on ultrahelisüsteemide skaleeritavus – üksikutest viaalidest VialTweeteriga kuni täielike mikroplaatideni UIP400MTP abil. – vastab kasvavale nõudlusele nii uurimuslike kui ka suurte korporatiivsete proteoomika-uuringute järele.
Hankige Sonicator, et hõlbustada oma FASPi töövoogu!
Ultraheli-filtri abil toimuv proovi ettevalmistamine ühendab FASP tõestatud tugevused sonikatsiooni füüsikaliste eelistega. Suurendades lüüsi, parandades lagundamist ja standardiseerides tööprotsesse, pakuvad ultrahelisüsteemid kaasaegse proteoomika jaoks võimsat lahendust.
Multi-Tube Sonicator VialTweeter ja Microplate Sonicator UIP400MTP näitavad, kuidas fokuseeritud ultraheli energia võib muuta rutiinse proovide ettevalmistamise tõhusamaks, korratavamaks ja teaduslikult usaldusväärsemaks protsessiks. – mis lõppkokkuvõttes viib kvaliteetsemate proteoomiliste andmete ja sügavamate bioloogiliste teadmiste saamiseni.
Valige kõige sobivam sonikaator teie filtri abil toimuva proovi ettevalmistamise jaoks
| Sonicator mudel | FASPi eelised | Parim kasutusala |
| UIP400MTP mikroplaadi sonikaator | Ühetaoline sonikatsioon kogu mikroplaatide ulatuses; väga korratav energiasisend; kiirendab alküülimist ja ensümaatilist lagundamist suure läbilaskevõimega tööprotsessides; ühildub automatiseeritud proovide ettevalmistamisega. | Suure läbilaskevõimega FASP-tööprotsessid 96-kujulises või sarnases plaadiformaadis, sealhulgas proteoomika sõeluuringurakendused. |
| VialTweeter Multi-Tube Sonicator | Mitme suletud toru samaaegne, ühtlane sonikatsioon; vähendab ristsaastumist ja proovi kadusid; suurendab reaktiivi tungimist ja segunemist, parandades alküülimise ja lagundamise tõhusust. | Mitme FASP-proovi paralleelne töötlemine mõõduka läbilaskevõime ja kõrge reprodutseeritavusega. |
| kupael (kaudne sonikatsioon) “kõrge intensiivsusega vann” suletud torude puhul) | Suure intensiivsusega kaudne sonikatsioon suletud anumate jaoks; suurepärane temperatuuri kontroll ja saastevaba töötlemine; soodustab tõhusat massiülekannet ilma otsese sondiga kokkupuuteta. | Processing of sample in various sample containers / sensitive or hazardous samples requiring closed containers and consistent energy distribution. |
| Laboratooriumi sonditüüpi sonikaatorid (otsene sonikatsioon) | Maksimaalne ultraheli intensiivsus ja energiaülekanne; kiire lõhkumine ja reaktsiooni kiirendamine; tõhus raskesti lagundatavate või väga keeruliste valguproovide puhul. | Single-sample processing, larger samples or challenging matrices where maximum power and speed are required. |
Disain, tootmine ja nõustamine – Kvaliteet Valmistatud Saksamaal
Hielscheri ultrasonikaatorid on tuntud oma kõrgeimate kvaliteedi- ja disainistandardite poolest. Vastupidavus ja lihtne kasutamine võimaldavad meie ultrasonikaatorite sujuvat integreerimist tööstusrajatistesse. Hielscheri ultrasonikaatorid saavad kergesti käsitseda karmid tingimused ja nõudlikud keskkonnad.
Hielscher Ultrasonics on ISO sertifitseeritud ettevõte ja paneb erilist rõhku suure jõudlusega ultrasonikaatoritele, millel on tipptasemel tehnoloogia ja kasutajasõbralikkus. Loomulikult on Hielscheri ultrasonikaatorid CE-nõuetele vastavad ja vastavad UL, CSA ja RoHs nõuetele.
Korduma kippuvad küsimused
Milleks kasutatakse filtri abil toimuvat proovide ettevalmistamist?
FASP (Filter-Aided Sample Preparation) kasutatakse valguproovide ettevalmistamiseks massispektromeetriapõhiseks proteoomiliseks analüüsiks. See võimaldab tõhusalt eemaldada detergendid, soolad ja muud väikese molekulmassiga saasteained, säilitades samal ajal valgud molekulmassilt piiratud filtril, kus neid saab denatureerida, redutseerida, alküülida ja ensümaatiliselt lagundada LC-MS/MS analüüsiks sobivateks peptiidideks.
Millised on FASPi eelised proteoomikas?
FASP peamised eelised proteoomikas on selle võime käsitleda keerukaid ja detergendirikkaid proove, tootes samal ajal väga puhtaid peptiidide segusid, mis sobivad massispektromeetriaga. See parandab lagundamise tõhusust ja reprodutseeritavust, kuna reaktsioonid viiakse läbi piiratud filtrikeskkonnas, vähendab proovikadu võrreldes sadestamispõhiste meetoditega ja võimaldab tõhusat puhvervahetust. Üldiselt parandab FASP peptiidide taastamist, andmete kvaliteeti ja proteoomi katvust, muutes selle usaldusväärseks ja laialdaselt kasutatavaks tööprotsessiks alt-üles proteoomikas.
Kirjandus / Viited
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
- Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
- Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).
Kontaktivaba Sonicator UIP400MTP hõlbustab FASP-i 96-kujulistes plaatides
Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid alates Lab kuni tööstuslik suurus.