Valgupelletite ultraheli lahustamine
Proteoomikas ei ole proovi ettevalmistamine kunagi väike detail. See on alus, millele tuginevad identifitseerimise täpsus, kvantifitseerimise usaldusväärsus ja reprodutseeritavus. Üheks kõige püsivamaks probleemiks valguproovide ettevalmistamisel on valgupellete tõhus uuesti lahustamine pärast sadestamist või kontsentreerimist. Siinkohal on valgupellete ultraheli lahustamine muutunud üha olulisemaks. Kontrollitud sonikatsiooni rakendades saavad laborid parandada valkude taastamist, kiirendada pelletite lahustamist ja valmistada proove tõhusamalt ette järgnevaks massispektromeetriaks ja biokeemiliseks analüüsiks.
Valgu lahustumine: Miks sonikatsioon on oluline kaasaegses proteoomikas
Atsetooni, etanooli, metanool-kloroformi, ammooniumsulfaadi või TCA sadestamisel moodustuvad sageli valgu graanulid. Neid tööprotsesse kasutatakse laialdaselt saasteainete eemaldamiseks, valkude kontsentreerimiseks ja ekstraktide puhastamiseks enne analüüsi. Kuid kui sadestamine on lõpetatud, võib saadud pelletit olla raske uuesti lahustada. Tihedad agregaadid, hüdrofoobsed domeenid, membraaniga seotud valgud ja tugevalt interakteeruvad valgukompleksid on sageli vastupidavad tavapärasele segamisele või keerutamisele. Ebatäielik solubiliseerimine võib põhjustada proovi kadumist, valkude kallutatud esindatust ja halba reprodutseeritavust eri katsete puhul.
Soniseerimine tegeleb just selle kitsaskohaga. Mehhaanilise energia tekitamisega vedelas keskkonnas lõhub sonikatsioon kompaktsed pelletistruktuurid, soodustab puhvri läbitungimist ja hajutab agregeeritud materjali lahusesse. Tulemuseks on valkude kiirem ja sageli täielikum taastamine, mis on eriti väärtuslik piiratud proovide, keeruliste lüsaatide või keeruliste proteoomiliste sihtmärkidega töötamisel.
Mikroplaadi sonikaatori UIP400MTP valkude ekstraheerimiseks ja graanulite lahustamiseks
Miks valgupelleteid on raske lahustada
Valgu sadestamine on tõhus, sest see sunnib valgud lahusest välja. Kuid sama protsess, mis muudab sadestamise kasulikuks, tekitab ka pelletite taaskasutamise probleemi. Pärast pelletiseerimist võivad valgud muutuda tihedalt pakitud ja osaliselt denatureerunud. Hüdrofoobsed vastastikmõjud võivad tugevneda, molekulidevaheline side võib suureneda ja mõned valgud võivad lõksutada soolasid, lipiide, nukleiinhappeid või muid maatriksi komponente. Isegi kui kasutatakse tugevat solubiliseerimispuhvrit, on passiivne resuspensioon sageli aeglane ja ebatäielik.
Proteoomika puhul on see oluline, sest graanulite mittetäielik lahustumine ei vähenda ainult kogusaagist. See võib selektiivselt välistada teatavad valguklassid, eriti membraanvalgud, struktuurivalgud või agregatsioonile kalduvad liigid. See tähendab, et lõplik analüüsitulemus ei pruugi enam kajastada algse proovi tegelikku koostist. Kõrgresolutsioonilise proteoomika puhul, kus peened erinevused arvukuses või translatsioonijärgses modifikatsioonis võivad olla bioloogiliselt otsustavad, on selline ettevalmistuse kõrvalekalle tõsine piirang.
Kuidas sonikatsioon parandab valgupellete lahustamist
Ultrahelitöötlus parandab lahustumist, viies proovi sisse kõrgsageduslikku mehaanilist energiat. See energia aitab lõhkuda kompaktset pelletimaterjali ja suurendab kontakti solubiliseerimispuhvri ja varjatud valkude vahel. Selle asemel, et tugineda ainult difusioonile ja käsitsi segamisele, hajutab protsess pelleti aktiivselt väiksemateks fraktsioonideks, mida on lihtsam lahustada.
Praktiline mõju on märkimisväärne. Soniseerimine võib:
- kiirendab tihedate või kangekaelsete valkudega graanulite lahustumist
- parandada raskesti lahustuvate ja agregeerunud valkude tagasisaamist
- vähendada ettevalmistusaega proteoomika töövoogudes
- toetada homogeensemaid proove lagundamiseks ja analüüsiks
Selline tõhustatud dispersioon on eriti kasulik, kui graanulid resuspenseeritakse puhvrites, mis sisaldavad karbamiidi, tiokarbamiidi, detergente, šotroope või muid proteoomikas tavaliselt kasutatavaid reaktiive. Soniseerimine aitab neil komponentidel tõhusamalt pelletile jõuda ja seda lahustada, mille tulemuseks on ühtlasem proovilahus.
Ultraheli solubiliseerimise eelised proteoomikas
Ultraheli solubiliseerimise peamine eelis on see, et see muudab sageli alahinnatud ettevalmistusetapi kontrollitavaks ja tõhusaks protsessiks. Proteoomikas on sellel otsesed analüütilised tagajärjed.
- Esiteks, parem lahustumine suurendab tõenäosust, et ensümaatilisse lagundamisse sisenev proov esindab kogu valgupopulatsiooni. Näiteks trüpsiini lagundamine sõltub sellest, kas valgud on piisavalt lahustunud ja kättesaadavad lahuses. Kui osa pelletist jääb lahustumata, on need valgud peptiidide tekkimisest ja seega ka avastamisest kõrvale jäetud.
- Teiseks võib sonikatsioon parandada reprodutseeritavust. Käsitsi toimuv pelletite resuspensioon on loomupäraselt muutlik, eriti kui tegemist on erinevate operaatorite, pelletite suuruse või proovi maatriksiga. Kontrollitud ultrahelitöötlus standardiseerib proovile rakendatava füüsikalise energia, mis võib vähendada erinevusi preparaatide vahel ja parandada järjepidevust järgnevates LC-MS- või geelipõhistes töövoogudes.
- Kolmandaks on ultraheliuuring väga väärtuslik vähese sisendiga ja väärtuslike proovide puhul. Kliiniline proteoomika, biomarkerite avastamine, rakukultuuride katsed ja koeuuringud tuginevad sageli piiratud materjalile. Iga valgu kadu solubiliseerimise ajal vähendab proovi informatiivset väärtust. Tõhus ultraheli-taaselahustumine aitab säilitada võimalikult palju analüütikumi.
- Lõpuks toetab sonikatsioon tööprotsessi kiirust. Proteoomikalaborid, mis töötlevad mitmeid proove, vajavad kindlaid ja ajasäästlikke ettevalmistusmeetodeid. Kiiresti ja täielikult lahustuv pellet ei ole lihtsalt mugav; see vähendab viivitusi, vähendab käitlemisvigade riski ja parandab läbilaskevõimet.
Sonikatsioon vs tavapärased resuspensiooni meetodid
Traditsioonilised pelletite resuspensiooni meetodid hõlmavad tavaliselt pipettimist, segamist, keerutamist, pikemat inkubatsiooni või korduvat kuumutamist. Kuigi need meetodid võivad toimida lõdvalt pakitud graanulite puhul, on need sageli raskendatud väga kompaktse või hüdrofoobse valgumaterjali puhul. Ainult mehaaniline segamine ei pruugi täielikult lagundada graanulite struktuuri, jättes maha nähtavad osakesed või nähtamatud lahustumatud fraktsioonid.
Sonikatsioon võimaldab aktiivsemat ja sihipärasemat lähenemist. Selle asemel, et tugineda aeglasele puhverdifusioonile, lõhub see graanuli füüsiliselt ja soodustab kiiret homogeniseerimist. See ei välista vajadust sobiva resuspensioonipuhvri järele, kuid suurendab oluliselt selle puhvri jõudlust.
Võrreldes puhtalt manuaalsete meetoditega pakub ultraheli solubiliseerimine sageli paremat protsessi kontrolli, suuremat tõhusust ja paremat sobivust nõudlike proteoomika rakenduste jaoks. Laborite jaoks, kes otsivad nii analüütilist kvaliteeti kui ka töökindlust, teeb see sonikatsioonist veenva valiku.
Parimad kasutusjuhud ultraheli valgupellete lahustamiseks
Ultraheli solubiliseerimine on eriti kasulik tööprotsessides, mis hõlmavad:
- valkude sadestamine enne massispektromeetriat,
- rakulüsaatidest või koeekstraktidest saadud pelletite taastamine,
- membraanirikaste või agregatsioonile kalduvate valkude taastamine,
- ja proovide ettevalmistamine kvantitatiivse proteoomika jaoks, kus reprodutseeritavus on oluline.
See on väga oluline ka siis, kui graanulid on ladustatud, liiga tugevalt kuivatatud või toodetud keerulistest bioloogilistest matriitsidest. Sellistel juhtudel võib passiivne resuspensioon muutuda eriti ebatõhusaks, samas kui soniseerimine aitab taastada proovi kasutatavuse väiksema käsitsi sekkumisega.
VialTweeter sonikaator 10 proovi samaaegseks sonikatsiooniks, nt valkude ekstraheerimiseks ja solubiliseerimiseks.
Leia parim Sonicator oma valkude lahustamise töövoogude jaoks!
Hielscheri tootevalikus on mitmeid sonikatsioonivorminguid, mida saab täpselt tööprotsessile kohandada, et kasutada laboratooriumides, mis töötavad väärtusliku proovi, madala sisendiga materjali või suure läbilaskevõimega proteoomika valdkonnas.
Kas te valite Hielscheri sonditüüpi sonikaatori, VialTweeter Multi-Tube Sonicator või UIP400MTP mikroplaadi sonikaatori. – Iga ultrahelistaja mudel on suunatud erinevatele proovide ettevalmistamise stsenaariumidele, kuid neil on sama peamine eelis: reprodutseeritav ultraheli energia proovide tõhusaks ja kontrollitud töötlemiseks.
Sondi tüüpi sonikaatorid
Ultrahelisondid, nagu UP200Ht, sobivad eriti hästi üksikute proovide otseseks soniseerimiseks. Proteoomika laborite jaoks on UP200Ht tugev valik, kui valgu pelletid vajavad intensiivset resuspensiooni väikestes ja keskmise suurusega mahtudes, eriti kui oluline on meetodi kontroll ja korratavus. Otsene proovi sonikatsioon võib kiiresti lõhkuda kompaktset pelletimaterjali ja aidata solubiliseerimispuhvritel pääseda ligi valkudele, mis muidu jääksid osaliselt lahustumata.
Ülevaade kõigist sonditüüpi sonikaatoritest!
VialTweeter Multi-Tube Sonicator
Kui mitut suletud viaali tuleb töödelda ühesugustes tingimustes, pakub Multi-Tube Sonicator VialTweeter selgeid eeliseid. VialTweeter võimaldab väikeste mahtude intensiivset sonikatsiooni, millega sonikeeritakse mitu suletud viaali steriilsetes tingimustes. Samaaegne proovi ettevalmistamine mitmes katseklaasis samades tingimustes, samuti väiksem ristsaastumise, proovi kadumise ja aerosooli tekkimise oht suletud viaali töötlemisel teevad VialTweeterist usaldusväärse vahendi proovide ettevalmistamiseks. Proteoomika puhul on see väga oluline mitme korduse või kliiniliste proovide väärtuslike graanulite käitlemisel, kus järjepidevus erinevate torude vahel on kriitilise tähtsusega.
Lisateave VialTweeteri kohta!
Mikroplaadi sonikaatori UIP400MTP
Suure läbilaskevõimega laboratooriumide jaoks laiendab UIP400MTP mikroplaatide sonikaator sonikatsiooni eeliseid plaatidel põhinevatesse tööprotsessidesse. UIP400MTP kui mikroplaatide ja mitme süvendi plaatide sonikaator võimaldab ühetaolist ultrahelitöötlust standardplaatidel, sealhulgas 96 süvendi formaadis, ning rõhutab selle sobivust automatiseeritud proovide ettevalmistamiseks sellistes valdkondades nagu proteoomika, diagnostika ja ravimite avastamine. Platvorm on mõeldud paljude proovide samaaegseks töötlemiseks, mille eelised on näiteks vähenenud ristsaastumisoht, väiksem töömaht, parem proovide taastamine ja integreerimine automatiseeritud töövoogudesse.
Praktilises proteoomikas tähendab see, et pelletite solubiliseerimist, rakkude lüüsi, ekstraheerimist ja sellega seotud ettevalmistusetappe saab palju tõhusamalt skaleerida. Selle asemel, et töödelda proove ükshaaval, saavad laborid sonikaatoriga töödelda terveid plaate ühtlase energiasisaldusega. See on väärtuslik alati, kui töövoogude puhul on vaja ühendada läbilaskevõime ja analüütiline rangus, näiteks sõeluuringute, kvantitatiivse proteoomika või standardiseeritud proovide ettevalmistamise torustike puhul. UIP400MTP ei ole seega lihtsalt mugav tööriist; see on platvorm, mis toetab laiemat suundumust automatiseerimise, reprodutseeritavuse ja tugeva kõrge läbilaskevõimega proteoomika suunas.
Lisateave UIP400MTP mikroplaatide sonikaatori kohta!
VialTweeter külmutuskambris – kontrollitud protsessiparameetrid sonikatsiooni ajal.
Valgu ekstraheerimine ja solubiliseerimine suure läbilaskevõimega koos mikroplaatide sonikaatoriga UIP400MTP
Disain, tootmine ja nõustamine – Kvaliteet Valmistatud Saksamaal
Hielscheri ultrasonikaatorid on tuntud oma kõrgeimate kvaliteedi- ja disainistandardite poolest. Vastupidavus ja lihtne kasutamine võimaldavad meie ultrasonikaatorite sujuvat integreerimist tööstusrajatistesse. Hielscheri ultrasonikaatorid saavad kergesti käsitseda karmid tingimused ja nõudlikud keskkonnad.
Hielscher Ultrasonics on ISO sertifitseeritud ettevõte ja paneb erilist rõhku suure jõudlusega ultrasonikaatoritele, millel on tipptasemel tehnoloogia ja kasutajasõbralikkus. Loomulikult on Hielscheri ultrasonikaatorid CE-nõuetele vastavad ja vastavad UL, CSA ja RoHs nõuetele.
Kirjandus / Viited
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Susana Jorge, Kevin Pereira, Hugo López-Fernández, William LaFramboise, Rajiv Dhir, Javier Fernández-Lodeiro, Carlos Lodeiro, Hugo M. Santos, Jose L. Capelo-Martínez (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, Volume 206, 2020.
- Lindemann C, Lupilova N, Müller A, Warscheid B, Meyer HE, Kuhlmann K, Eisenacher M, Leichert LI. (2013): Redox proteomics uncovers peroxynitrite-sensitive proteins that help Escherichia coli to overcome nitrosative stress. Journal of Biological Chemistry 288(27); 2013. 19698-714.
- Gonçalo Martins, Javier Fernández-Lodeiro, Jamila Djafari, Carlos Lodeiro, J.L. Capelo, Hugo M. Santos (2019): Label-free protein quantification after ultrafast digestion of complex proteomes using ultrasonic energy and immobilized-trypsin magnetic nanoparticles. Talanta, Volume 196, 2019. 262-270.
Korduma kippuvad küsimused
Miks ei sobi ultrahelivannid valkude lahustamiseks?
Ultrahelivannides toimub sonikatsiooni tööpõhimõte, kavitatsioon, mis on väga ebaühtlane, kui proovid on suunatud erinevatele sonikatsiooniprotseduuridele. Sõltuvalt proovitorude asendist ultrahelivannis mõjutavad iga proovi erinevad intensiivsused. Proteoomika sõltub võrreldavusest. Kui üks graanulid on ebatäielikult lahustunud, samas kui teine on täielikult resuspendeeritud, võivad saadud andmed kajastada pigem ettevalmistamise kallutatust kui tõelist bioloogiat. Erinevalt ultrahelivannidest toetavad kontaktivaba sonikaatorid, nagu VialTweeter või Microplate Sonicator UIP400MTP, standardsemat käitlemist, võimaldades mitmete proovide paralleelset töötlemist sobivate ultrahelitingimuste all, mis võib aidata parandada katsete reprodutseeritavust. See on eriti kasulik biomarkerite uuringutes, võrdlevas proteoomikas ja töövoogudes, kus on mitu bioloogilist või tehnilist kordust.
Millised on kõige levinumad analüüsid proteoomikas?
Proteoomika kõige levinumad analüüsid on valkude kvantifitseerimise analüüsid ja valkude iseloomustamise meetodid, mida kasutatakse proovide ettevalmistamisel ja analüüsimisel. Sageli kasutatavad analüüsid on Bradfordi analüüs, BCA analüüs, Lowry analüüs ja UV-absorptsioon 280 nm juures valgu kontsentratsiooni mõõtmiseks. Laiemas proteoomika töövoogudes kasutatakse laialdaselt ka SDS-PAGE, Western blotting, ELISA, in-gel digestioon ja massispektromeetrial põhinevaid analüüse, et hinnata valkude arvukust, puhtust, molekulmassi ja identiteeti.
Mis on Coomassie Brilliant Blue?
Coomassie Brilliant Blue on trifenüülmetaanvärv, mida kasutatakse laialdaselt valguteaduses valkude värvimiseks geelides ja valkude kolorimeetriliseks kvantifitseerimiseks. See seondub peamiselt aluseliste ja aromaatsete aminohappejääkidega, eriti arginiiniga, ning teeb valkudega seondumisel läbi spektraalse nihke. See omadus muudab selle kasulikuks nii valkude visualiseerimiseks pärast elektroforeesi kui ka Bradfordi valkude määramiseks.
Kuidas Bradfordi analüüs toimib?
Bradfordi analüüs toimib valgu proovi segamisel Coomassie Brilliant Blue värvainega happelistes tingimustes. Kui värvaine seondub valkudega, nihkub selle neeldumise maksimum umbes 465 nm-lt 595 nm-le, põhjustades mõõdetava värvimuutuse punakaspruunist siniseks. Neelduvuse suurenemine 595 nm juures on proportsionaalne valgu kontsentratsiooniga kindlaksmääratud vahemikus, mis võimaldab kvantifitseerimist, võrreldes seda standardkõveraga, mis tavaliselt valmistatakse veiste seerumi albumiiniga.
Proovide fookustatud sonikatsioon mitmeväljalistes plaatides
Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid alates Lab kuni tööstuslik suurus.