Valgukristallide ultraheliga lahustamine

Proteoomikas ei ole proovide ettevalmistus kunagi tähtsusetu detail. See on alus, millele toetuvad identifitseerimise täpsus, kvantifitseerimise usaldusväärsus ja reprodutseeritavus. Üks püsivamaid väljakutseid valgu proovide ettevalmistamisel on valgupelletite tõhus uuesti lahustamine pärast sadestamis- või kontsentreerimisetappe. Just siin on valgupelletite ultraheliga solubiliseerimine muutunud üha olulisemaks. Kontrollitud ultraheli töötluse (sonikeerimise) abil saavad laborid parandada valgu saagist, kiirendada pelleti lahustumist ja valmistada proove tõhusamalt ette järgnevaks massispektromeetriliseks ja biokeemiliseks analüüsiks.

Valgu solubiliseerimine: miks on ultraheli töötlus tänapäevases proteoomikas oluline

Valgupelletid tekivad sageli atsetooni-, etanooli-, metanool-kloroformi-, ammooniumsulfaadi- või TCA-sadestamise käigus. Neid töövooge kasutatakse laialdaselt lisandite eemaldamiseks, valkude kontsentreerimiseks ja ekstraktide puhastamiseks enne analüüsi. Kuid kui sadestamine on lõppenud, võib saadud pelletit olla raske uuesti solubiliseerida. Tihedad agregaadid, hüdrofoobsed domeenid, membraaniga seotud valgud ja tugevalt interakteeruvad valgukompleksid tavaliselt ei lahustu tavapärasel segamisel ega vortexil. Mittetäielik solubiliseerimine võib seejärel põhjustada proovikadu, valkude kallutatud esindatust ja halba reprodutseeritavust katsete vahel.
Ultraheli töötlus lahendab täpselt selle kitsaskoha. Mehaanilise energia tekitamisega vedelas keskkonnas lõhub ultraheli töötlus (sonikeerimine) pelleti kompaktseid struktuure, soodustab puhvri tungimist ja hajutab agregeerunud materjali lahusesse. Tulemuseks on valkude kiirem ja sageli täielikum taastamine lahusesse, mis on eriti väärtuslik piiratud proovide, keerukate lüsaatide või keeruliste proteoomiliste sihtmärkidega töötamisel.

Miks on valgupelleteid raske solubiliseerida

Valgu sadestamine on tõhus, sest see sunnib valgud lahusest välja. Sama protsess, mis muudab sadestamise kasulikuks, tekitab aga ka pelleti taastamise probleemi. Pelleteerituna võivad valgud muutuda tihedalt pakituks ja osaliselt denatureerunuks. Hüdrofoobsed interaktsioonid võivad tugevneda, molekulidevaheline seondumine võib suureneda ja mõned valgud võivad püüda kinni soolasid, lipiide, nukleiinhappeid või muid maatriksi komponente. Isegi tugeva solubiliseerimispuhvri kasutamisel on passiivne resuspendeerimine sageli aeglane ja mittetäielik.
Proteoomikas on see oluline, sest pelleti mittetäielik lahustumine ei vähenda mitte ainult kogusaagist. See võib valikuliselt välistada teatud valguklasse, eriti membraanivalke, struktuurvalke või agregeeruvaid liike. See tähendab, et lõplik analüütiline tulemus ei pruugi enam kajastada algse proovi tegelikku koostist. Kõrge eraldusvõimega proteoomikas, kus peened erinevused rohkuses või translatsioonijärgses modifikatsioonis võivad olla bioloogiliselt otsustavad, on selline ettevalmistuse kallutatus tõsine piirang.

Kuidas ultraheli töötlus parandab valgupelleti solubiliseerimist

Ultraheli töötlus parandab solubiliseerimist, viies proovi kõrgsageduslikku mehaanilist energiat. See energia aitab lõhkuda kompaktset pelletimaterjali ning suurendab solubiliseerimispuhvri ja pelletisse kinnistunud valkude kontakti. Selle asemel, et tugineda ainult difusioonile ja käsitsi segamisele, hajutab protsess pelleti aktiivselt väiksemateks fraktsioonideks, mida on lihtsam lahustada.

Praktiline mõju on märkimisväärne. Ultraheli töötlus (sonikeerimine) võib:

• kiirendada tihedate või visate valgupelletite lahustumist
• parandada halvasti lahustuvate ja agregeerunud valkude saagist
• lühendada proovide ettevalmistuse aega proteoomika töövoogudes
• toetada homogeensemaid proove digestsiooniks ja analüüsiks

See täiustatud dispersioon on eriti kasulik, kui sademed suspendeeritakse uuesti puhvrites, mis sisaldavad uureat, tiouureat, detergente, kaotroope või muid proteoomikas tavaliselt kasutatavaid reagente. Ultraheli töötlus (sonikeerimine) aitab neil komponentidel sademeni jõuda ja seda tõhusamalt lahustada, mille tulemusena saadakse ühtlasem proovilahus.

Ultraheli solubiliseerimise eelised proteoomikas

Ultraheli solubiliseerimise peamine eelis on see, et see muudab sageli alahinnatud ettevalmistusetapi kontrollitavaks ja tõhusaks protsessiks. Proteoomikas on sellel otsene mõju analüüsile.

1. Esiteks suurendab parem solubiliseerimine tõenäosust, et ensümaatilisse lagundamisse jõudev proov esindab kogu valgupopulatsiooni. Näiteks trüpsiinlagundamine sõltub sellest, et valgud on lahuses piisavalt lahti voldunud ja kättesaadavad. Kui osa sademest jääb lahustumata, jäetakse need valgud peptiidide tekkest ja seega ka tuvastamisest tegelikult välja.
2. Teiseks võib ultraheli töötlus (sonikeerimine) parandada reprodutseeritavust. Sademe käsitsi uuesti suspendeerimine on olemuselt muutlik, eriti kui kaasatud on erinevad operaatorid, sademete suurused või proovimaatriksid. Kontrollitud ultraheli töötlus standardiseerib proovile rakendatava füüsikalise energia, mis võib vähendada ettevalmistuste vahelist varieeruvust ja parandada järjepidevust järgnevates töövoogudes, nagu LC-MS või geelipõhised meetodid.
3. Kolmandaks on ultraheli töötlus (sonikeerimine) väga väärtuslik vähese algmaterjaliga ja väärtuslike proovide puhul. Kliiniline proteoomika, biomarkerite avastamine, rakukultuuri katsed ja koeuuringud tuginevad sageli piiratud materjalile. Iga valgukadu solubiliseerimise ajal vähendab proovi informatiivset väärtust. Tõhus ultraheliga uuesti lahustamine aitab säilitada võimalikult palju analüüdi.
4. Lõpuks toetab ultraheli töötlus (sonikeerimine) töövoo kiirust. Mitut proovi töötlevad proteoomikalaborid vajavad töökindlaid ja ajasäästlikke ettevalmistusmeetodeid. Sade, mis lahustub kiiresti ja täielikult, ei ole lihtsalt mugav; see vähendab viivitusi, madaldab käsitsemisvigade riski ja parandab läbilaskevõimet.

Ultraheli töötlus (sonikeerimine) võrreldes tavapäraste uuesti suspendeerimise meetoditega

Traditsioonilised sademe uuesti suspendeerimise meetodid hõlmavad tavaliselt pipeteerimist, segamist, vortekseerimist, pikaajalist inkubeerimist või korduvaid kuumutamisetappe. Kuigi need võtted võivad toimida lõdvalt pakitud sademete puhul, on neil sageli raskusi väga kompaktse või hüdrofoobse valgumaterjaliga. Pelgalt mehaaniline segamine ei pruugi sademe struktuuri täielikult lõhkuda, jättes maha nähtavad osakesed või nähtamatud lahustumatud fraktsioonid.
Ultraheli töötlus (sonikeerimine) pakub aktiivsemat ja sihipärasemat lähenemist. Selle asemel et tugineda aeglasele puhvri difusioonile, lõhub see sademe füüsiliselt ja soodustab kiiret homogeniseerimist. See ei kaota vajadust sobiva uuesti suspendeerimise puhvri järele, kuid suurendab oluliselt selle puhvri toimivust.
Võrreldes puhtalt käsitsi tehtavate meetoditega pakub ultraheli solubiliseerimine sageli paremat protsessi kontrolli, suuremat tõhusust ja paremat sobivust nõudlike proteoomikarakenduste jaoks. Laboritele, kes soovivad nii analüütilist kvaliteeti kui ka töökindlust, teeb see ultraheli töötlusest (sonikeerimisest) veenva valiku.

Ultraheliga valgusademete solubiliseerimise parimad kasutusjuhud

Ultraheli solubiliseerimine on eriti kasulik töövoogudes, mis hõlmavad:

• valkude sadestamist enne massispektromeetriat,
• sademete uuesti lahustamist rakulüsaatidest või koeekstraktidest,
• membraanirikaste või agregeerumisele kalduvate valkude taastamist,
• ja kvantitatiivse proteoomika proovide ettevalmistamist, kus reprodutseeritavus on oluline.

See on väga oluline ka siis, kui sadet on säilitatud, liiga tugevasti kuivatatud või see on saadud keerukatest bioloogilistest maatriksitest. Sellistel juhtudel võib passiivne uuesti suspendeerimine muutuda eriti ebatõhusaks, samas kui ultraheli töötlus (sonikeerimine) aitab taastada proovi kasutatavuse väiksema käsitsi sekkumisega.

Leidke parim sonikaator oma valkude solubiliseerimise töövoo jaoks!

Laboritele, mis töötavad väärtuslike proovide, väikese sisendkogusega materjali või suure läbilaskevõimega proteoomikaga, pakub Hielscheri tootevalik mitmeid ultraheli töötluse (sonikeerimise) vorme, mida saab töövoogu täpselt arvestades sobitada.
Olenemata sellest, kas valite Hielscheri sondtüüpi sonikaatori, mitme katseklaasi sonikaatori VialTweeter või mikroplaadi sonikaatori UIP400MTP – iga ultrahelitöötluse seade lahendab erineva proovide ettevalmistamise stsenaariumi, jagades samas sama põhieelist: reprodutseeritav ultraheli energia proovide tõhusaks ja kontrollitud töötlemiseks.

Sondtüüpi sonikaatorid

Ultraheli sondid, näiteks UP200Ht, sobivad eriti hästi üksikute proovide otseseks ultraheli töötluseks. Proteoomikalaboritele on UP200Ht tugev valik, kui valgupelletid vajavad intensiivset resuspendeerimist väikestes kuni keskmistes mahtudes, eriti kui meetodi kontroll ja korratavus on olulised. Otsene sondiga sonikeerimine võib kompaktse pelleti materjali kiiresti lõhkuda ning aidata solubiliseerimispuhvritel jõuda valkudeni, mis muidu jääksid osaliselt lahustumata.
Ülevaade kõigist sondtüüpi sonikaatoritest!
 
 
 

Mitme katseklaasi sonikaator VialTweeter

Kui mitut suletud viaali tuleb töödelda identsetes tingimustes, pakub mitme katseklaasi sonikaator VialTweeter selget eelist. VialTweeter võimaldab väikeste mahtude intensiivset ultraheli töötlust, sonikeerides mitut suletud viaali steriilsetes tingimustes. Proovide samaaegne ettevalmistamine mitmes katseklaasis samades tingimustes ning suletud viaalide töötlemisel väiksem ristsaastumise, proovikao ja aerosooli tekke risk muudavad seadme VialTweeter usaldusväärseks vahendiks proovide ettevalmistamisel. Proteoomikas on see väga oluline väärtuslike pelletite käsitlemisel mitmest replikaadist või kliinilistest proovidest, kus katseklaaside vaheline ühtlus on kriitilise tähtsusega.
Lisateave toote VialTweeter kohta!

Mikroplaadi sonikaator UIP400MTP

Suure läbilaskevõimega laboritele laiendab mikroplaadi sonikaator UIP400MTP ultraheli töötluse eeliseid plaadipõhistesse töövoogudesse. UIP400MTP kui mikroplaadi ja mitmekaevuliste plaatide sonikaator ühtlaseks ultraheli töötluseks standardplaatidel, sealjuures 96-kaevuliste formaatidega, ning rõhutab selle sobivust automatiseeritud proovide ettevalmistamiseks sellistes valdkondades nagu proteoomika, diagnostika ja ravimiavastus. Platvorm on mõeldud paljude proovide samaaegseks töötlemiseks, eelistega nagu väiksem ristsaastumise risk, väiksem tööjõuvajadus, parem proovide taastumine ja integreerimine automatiseeritud töövoogudesse.
Praktilises proteoomikas tähendab see, et pelleti solubiliseerimist, rakkude lüüsi, ekstraheerimist ja nendega seotud ettevalmistusetappe saab skaleerida palju tõhusamalt. Selle asemel et proove ükshaaval töödelda, saavad laborid sonikeerida terveid plaate ühtlase energiasisendiga. See on väärtuslik alati, kui töövoogudes tuleb ühendada läbilaskevõime ja analüütiline täpsus, näiteks skriininguuringutes, kvantitatiivses proteoomikas või standardiseeritud proovide ettevalmistamise liinides. UIP400MTP ei ole seega pelgalt mugavusvahend; see on platvorm, mis toetab laiemat suundumust automatiseerimise, reprodutseeritavuse ja töökindla suure läbilaskevõimega proteoomika poole.
Lisateave mikroplaadi sonikaatori UIP400MTP kohta!

Disain, tootmine ja nõustamine – Saksamaal valmistatud kvaliteet

Hielscheri ultrahelitöötluse seadmed on tuntud oma kõrgeima kvaliteedi ja disainistandardite poolest. Töökindlus ja lihtne kasutus võimaldavad meie ultrahelitöötluse seadmete sujuvat integreerimist tööstusrajatistesse. Hielscheri ultrahelitöötluse seadmed tulevad kergesti toime karmide tingimuste ja nõudlike keskkondadega.

Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifitseeritud ettevõte ning pöörab erilist tähelepanu suure jõudlusega ultrahelitöötluse seadmetele, mis on varustatud tipptehnoloogia ja kasutajasõbralikkusega. Loomulikult vastavad Hielscheri ultrahelitöötluse seadmed CE nõuetele ning täidavad UL, CSA ja RoHs nõudeid.

Kirjandus / viited

• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Susana Jorge, Kevin Pereira, Hugo López-Fernández, William LaFramboise, Rajiv Dhir, Javier Fernández-Lodeiro, Carlos Lodeiro, Hugo M. Santos, Jose L. Capelo-Martínez (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, Volume 206, 2020.
• Lindemann C, Lupilova N, Müller A, Warscheid B, Meyer HE, Kuhlmann K, Eisenacher M, Leichert LI. (2013): Redox proteomics uncovers peroxynitrite-sensitive proteins that help Escherichia coli to overcome nitrosative stress. Journal of Biological Chemistry 288(27); 2013. 19698-714.
• Gonçalo Martins, Javier Fernández-Lodeiro, Jamila Djafari, Carlos Lodeiro, J.L. Capelo, Hugo M. Santos (2019): Label-free protein quantification after ultrafast digestion of complex proteomes using ultrasonic energy and immobilized-trypsin magnetic nanoparticles. Talanta, Volume 196, 2019. 262-270.