Kromatiini lõikamine sonikatsiooniga
Kromatiini lõikamine on kriitiline samm paljudes epigeneetika ja molekulaarbioloogia töövoogudes, eriti kromatiini immunoprecipitatsiooni (ChIP), ChIP-seq ja sellega seotud analüüside puhul. Eesmärgiks on kromatiini fragmenteerimine reprodutseeritavateks DNA-valgu kompleksideks, säilitades samal ajal epitoopide terviklikkuse ja vähendades proovi kadusid. Olemasolevatest meetoditest on ultraheli kromatiini fragmenteerimine muutunud laialdaselt kasutatavaks meetodiks, sest see võimaldab usaldusväärset, reaktiivivaba fragmenteerimist, mis on suurepärase reprodutseeritavusega.
Mida peaksin kromatiini lõikamisel arvesse võtma?
Tõhus kromatiini lõikamine nõuab katseparameetrite hoolikat kontrollimist. Ebaõige fragmenteerimine võib ohustada ChIP-katsete läbiviimist, tekitades liiga suuri, liiga lagunenud või proovide vahel ebajärjekindlaid fragmente.
Üks tähtsamaid tegureid on soovitud fragmentide suuruse jaotus. Enamiku ChIP- ja ChIP-seq-rakenduste jaoks on optimaalsed kromatiinifragmendid vahemikus 100-600 aluspaari. See suurusvahemik võimaldab tõhusat immunoprecipitatsiooni ja samas piisavat eraldusvõimet genoomi kaardistamiseks.
Teine oluline tegur on ristseotuse tõhusus enne sonikatsiooni. Enamik ChIP-tööprotsesse hõlmab formaldehüüdiga fikseerimist, et stabiliseerida valgu ja DNA vastastikmõju. Liigne ristseotamine võib aga muuta kromatiini killustumisele vastupidavamaks, mis nõuab pikemat sonikatsiooniaega ja võib suurendada kuumusega kokkupuudet.
Temperatuuri kontroll on samuti väga oluline. Soniseerimine tekitab lokaalset energiat, mis võib tõsta proovi temperatuuri. Kõrge temperatuur võib kahjustada DNA-d või denatureerida valke, mõjutades antikehade äratundmist ChIPi ajal. Paljud teadlased teevad seetõttu pulseeritud sonikatsioonitsükleid koos jahutusintervallidega, et säilitada proovi stabiilsus.
Proovi kontsentratsioon ja maht mõjutavad samuti fragmenteerimise tõhusust. Kõrge kontsentratsiooniga kromatiinisuspensioonid võivad nõuda pikemat sonikatsiooni aega, samas kui väikesed proovimahud nõuavad täpset energiakasutust, et vältida liigset töötlemist.
Lõpuks mõjutab sonikatsiooniseadme valik tugevalt katsete reprodutseeritavust. Kromatiini lõikamiseks mõeldud seadmed pakuvad tavaliselt kontrollitud ultraheli energiat ja standardiseeritud proovi käitlemist, mis võimaldab järjepidevat fragmenteerimist mitme proovi puhul.
Ultraheli DNA lõikamine ChIP ajal – kromatiini immunoprecipitatsioon
Millise sonikaatori peaksin valima kromatiini lõikamiseks?
Erinevad laboratoorsed tööprotsessid nõuavad erinevaid sonikatsiooni konfiguratsioone. Optimaalne süsteem sõltub suuresti proovi läbilaskevõimest, mahust ja katseformaadist.
Sonda-tüüpi sonikaator
Sonditüüpi sonikaator edastab ultraheli energia otse proovile läbi titaanist sondi. See konfiguratsioon tagab väga suure energiatiheduse ja sobib seetõttu üksikute proovide tugeva kromatiini lõhkumise jaoks.
Sonikaatorid on eriti kasulikud järgmistel juhtudel:
- Väikesed ja keskmise suurusega valimid
- raskesti killustatav kromatiin
- Paindlikud katseprotokollid
Multi-Tube Sonicator - VialTweeter
Mitut proovi samaaegselt töötlevatele laboritele pakub VialTweeter multi-tube sonikaator väga hästi reprodutseeritavat lahendust. Süsteem edastab ultraheli energia kaudselt läbi viaali hoidja, võimaldades killustada mitu suletud toru identsetes tingimustes.
Selline konfiguratsioon pakub olulisi eeliseid:
- Mitme proovi paralleelne kromatiini lõikamine
- Sondi saastumise kõrvaldamine
- Kõrge reprodutseeritavus torude vahel
- Lihtsustatud tööprotsess ChIP-proovide ettevalmistamiseks
Sellised mitme toruga süsteemid sobivad hästi rutiinseteks ChIP-eksperimentideks ja keskmise läbilaskevõimega uuringuteks.
Mikroplaatide sonikaator - UIP400MTP
Suure läbilaskevõimega epigeneetika uuringud tuginevad üha enam mikroplaatidel põhinevale proovitöötlusele. UIP400MTP mikroplaatide sonikaator on mõeldud kromatiini fragmenteerimiseks otse standardsetel mikroplaatidel ilma proovide ülekandmiseta.
Selline lähenemine võimaldab:
- Kümnete või sadade proovide samaaegne töötlemine
- Automatiseerimissõbralikud töövood
- Ühetaoline ultraheli energia jaotumine puuraukude vahel
- Proovikäitluse etappide märkimisväärne vähendamine
Suurte ChIP-seq skriining-projektide või suure läbilaskevõimega epigeneetiliste uuringute jaoks pakub mikroplaatide sonikatsioon erakordset skaleeritavust ja tõhusust. Mitme süvendi plaadi sonikaator UIP400MTP sobib hästi järgmisteks eesmärkideks integreerimine vedelikukäitlussüsteemidesse ja automatiseeritud laboratooriumide töövoogudesse.
Miks valida sonikatsioon teiste kromatiini lõikamistehnikate asemel?
Võrreldes ensümaatiliste meetoditega tagab sonikatsioon ChIPi jaoks erapooletu fragmenteerimise, kuna protsess ei sõltu järjestusspetsiifilisest ensüümi aktiivsusest. See on eriti oluline kogu genoomi hõlmavate epigeneetiliste uuringute puhul, kus ühtlane katvus on oluline.
Teine suur eelis on skaleeritavus. Ultrahelisüsteemid võivad mahutada üksikuid proove, mitut toru või terveid mikroplaate, võimaldades laboratooriumidel valida oma katsete läbilaskevõime jaoks kõige sobivama konfiguratsiooni.
Lõpuks võimaldab sonikatsioon suurepäraselt kontrollida fragmenteerimise parameetreid. Impulsside tsüklite, kestuse ja võimsuse tasemeid reguleerides saavad teadlased usaldusväärselt saavutada soovitud fragmentide suuruse jaotuse.
Kromatiini fragmenteerimine ChIP-proovide optimeeritud sonikatsiooniga.
(a) ei ole nihkumist (pikad fragmendid geelis);
(b) optimaalne fragmentatsiooniprofiil (200-600 bp fragmentide rikastamine);
(c) liigne DNA-fragmentatsioon (üle 200 bp lühemate fragmentide üleesindatus).
© Jarillo et al., 2018
Kromatiini lõikamistehnikate võrdlus
| Kromatiini lõikamise meetod | Põhimõte | Eelised | Piirangud |
| ultrahelitöötlus | Kõrgsageduslik akustiline energia killustab mehaaniliselt kromatiini. | Reaktiivivaba fragmenteerimine, väga hästi reprodutseeritavad tulemused, reguleeritav fragmendi suuruse jaotumine, ühildub ristseotud kromatiiniga, skaleeritav ühest torust kuni mitme proovi ja mikroplaadi formaatideni. | Nõuab sonikatsiooniseadmeid ja sonikatsiooniparameetrite optimeerimist. |
| Ensümaatiline lagundamine (MNaas) | Mikrokokk-nukleaas seedib DNA-d nukleosoomide vahel. | Õrn fragmentatsioon ja kasulik natiivse kromatiini analüüsiks. | Ensüümide kõrvalekalded, järjestuse eelistus, raskesti kontrollitav seedimine, võimalik varieeruvus katsete vahel. |
| Mehhaaniline lõikamine (nõel / süstal) | Kromatiini lõhutakse korduva füüsilise jõu abil. | Lihtne meetod, mis nõuab minimaalset varustust. | Halb reprodutseeritavus, piiratud kontroll fragmentide suuruse üle, töömahukas mitme proovi puhul. |
| Nebulatsioon | Suruõhk surub DNA-d läbi väikeste avauste, mis põhjustab killustumist. | Kiire killustumisprotsess. | Võimalik proovi kadu, piiratud skaleeritavus, nõuab eriseadmeid. |
Kuidas kvantifitseerida ja kvalifitseerida kromatiini saagist pärast ultraheli-fragmenteerimist?
Pärast ChIP-i sonikatsiooni peavad teadlased hindama nii fragmenteeritud kromatiini kogust kui ka kvaliteeti. See kontrollsamm tagab, et kromatiini fragmenteerumine vastab järgnevate rakenduste, näiteks ChIP-qPCR või ChIP-seq nõuetele.
Kvantifitseerimine algab tavaliselt DNA kontsentratsiooni mõõtmisega. Spektrofotomeetrilised meetodid, nagu Nanodrop-analüüs või fluoromeetrilised analüüsid, nagu Qubit DNA kvantifitseerimine, annavad usaldusväärseid hinnanguid kromatiini saagise kohta pärast dekrosslinkimist ja puhastamist.
DNA kontsentratsioon üksi ei näita siiski, kas fragmenteerimine oli edukas. Seetõttu hindavad teadlased fragmentide suuruse jaotust elektroforeetiliste meetodite abil. Agaroosigeelelektroforees on endiselt üldkasutatav meetod DNA-fragmentide visualiseerimiseks ja selle kontrollimiseks, et enamik neist jääb sihtmõõdulisse vahemikku.
Arenenumad laborid kasutavad sageli kapillaarelektroforeesi süsteeme, näiteks Agilent Bioanalyzer või TapeStation. Need platvormid pakuvad täpseid suurusjaotuse profiile ja võimaldavad teadlastel tuvastada liigset killustumist või mittetäielikku lõikumist.
Kromatiini kvaliteedi hindamisel pärast ultraheli fragmenteerimist kinnitavad teadlased tavaliselt:
- Enamik DNA-fragmente jääb vahemikku 100-600 bp.
- Fragmentide jaotumine on kordusproovide puhul järjepidev.
- DNA lagunemine on minimaalne
- Kromatiini kogusaagis on piisav kavandatud ChIP-analüüsi jaoks.
Nõuetekohane kvaliteedikontroll tagab, et ultraheli kromatiini lõikamise etapp annab reprodutseeritavaid ja bioloogiliselt tähenduslikke tulemusi.
Kokkuvõte: Ultraheli kromatiini lõikamine usaldusväärsete uuringute jaoks
Usaldusväärne kromatiini lõikamine on ChIP- ja epigeneetiliste uuringute edukaks läbiviimiseks hädavajalik. Ultraheli fragmenteerimine pakub võimsat lahendust, sest see võimaldab täpset, korratavat ja reaktiivivaba kromatiini lõhustamist paljudes katsevormingutes.
Hoolikalt optimeerides sonikatsiooniparameetrid, kontrollides fragmentide suuruse jaotust ja valides sobiva sonikatsioonisüsteemi. – kas sonditüüpi sonikaator, mitme toruga VialTweeter või suure tootlikkusega UIP400MTP mikroplaatide sonikaator. – teadlased saavad saavutada järjepideva kromatiini fragmenteerimise, mis toetab kvaliteetseid ChIP- ja ChIP-seq-tulemusi.
Kuna epigeneetika uuringud laienevad jätkuvalt suurema läbilaskevõime ja suurema eksperimentaalse reprodutseeritavuse suunas, on ultraheli kromatiini lõikamine endiselt üks kõige mitmekülgsemaid ja usaldusväärsemaid meetodeid, mis on kaasaegsete molekulaarbioloogia laboratooriumide jaoks saadaval.
Disain, tootmine ja nõustamine – Kvaliteet Valmistatud Saksamaal
Hielscheri ultrasonikaatorid on tuntud oma kõrgeimate kvaliteedi- ja disainistandardite poolest. Vastupidavus ja lihtne kasutamine võimaldavad meie ultrasonikaatorite sujuvat integreerimist tööstusrajatistesse. Hielscheri ultrasonikaatorid saavad kergesti käsitseda karmid tingimused ja nõudlikud keskkonnad.
Hielscher Ultrasonics on ISO sertifitseeritud ettevõte ja paneb erilist rõhku suure jõudlusega ultrasonikaatoritele, millel on tipptasemel tehnoloogia ja kasutajasõbralikkus. Loomulikult on Hielscheri ultrasonikaatorid CE-nõuetele vastavad ja vastavad UL, CSA ja RoHs nõuetele.
UIP400MTP kromatiini lõikamiseks soniseeritud torustik.
Kirjandus / Viited
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
- Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
- José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
- Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)
Korduma kippuvad küsimused
Mis on kromatiin?
Kromatiin on DNA-st ja sellega seotud valkudest koosnev struktuurikompleks, mis korraldab geneetilist materjali eukarüootiliste rakkude tuumas. Kromatiini peamised valgud on histoonid, mille ümber DNA on mähitud nukleosoomide moodustamiseks. Selline organiseerimine tihendab DNA-d, reguleerides samal ajal juurdepääsu geneetilisele informatsioonile selliste protsesside jaoks nagu transkriptsioon, replikatsioon ja DNA parandamine.
Millised on kromatiini tüübid?
Kromatiin liigitatakse üldiselt kahte põhivormi: euchromatiin ja heterokromatiin. Euhromatiin on lõdvalt pakitud ja transkriptsiooniliselt aktiivne, võimaldades transkriptsioonimehhanismidele hõlpsasti juurdepääsu geenidele. Heterokromatiin on tihedamalt pakitud ja transkriptsiooniliselt mitteaktiivne, sisaldades tavaliselt korduvaid DNA järjestusi või geene, mis on vaigistatud. Heterokromatiini võib veel jagada konstitutiivseks heterokromatiiniks, mis jääb püsivalt kondenseerituks, ja fakultatiivseks heterokromatiiniks, mis võib sõltuvalt rakutingimustest vahetada aktiivse ja inaktiivse oleku vahel.
Mis on ristsidumine?
Ristsidumine on biokeemiline protsess, mida kasutatakse biomolekulide vaheliste interaktsioonide stabiliseerimiseks, moodustades nende vahel kovalentsed sidemed. Kromatiiniuuringutes kasutatakse ristseotust tavaliselt selleks, et säilitada valgu-DNA vastastikmõjusid kromatiinis enne analüüsi. Keemilisi aineid, nagu formaldehüüd, kasutatakse tavaliselt pöörduvate kovalentsete sidemete loomiseks DNA ja seotud valkude vahel, mis on tõhusalt “Külmutamine” molekulaarsed vastastikmõjud konkreetsel ajahetkel. Selline stabiliseerimine võimaldab kromatiinikomplekside killustamist ja töötlemist ilma DNA ja regulatiivsete valkude vahelisi natiivseid seoseid kaotamata, mis on oluline selliste meetodite puhul nagu kromatiini immunopretsipitatsioon (ChIP).
Mis on ChIP?
Kromatiini immunopretsipitatsioon (ChIP) on molekulaarbioloogiline meetod, mida kasutatakse valkude ja DNA vaheliste kromatiinis toimivate vastastikmõjude uurimiseks. Selle meetodi puhul stabiliseeritakse kõigepealt DNA-valgu kompleksid, tavaliselt ristseotuse abil, ja seejärel killustatakse kromatiin. Valgu-DNA-komplekside immunopretsipitatsiooniks kasutatakse sihtvalgu suhtes spetsiifilisi antikehi, mis võimaldab seotud DNA järjestusi isoleerida ja analüüsida.
Milleks kasutatakse ChIP-i?
ChIPi kasutatakse genoomi piirkondade tuvastamiseks, mida seovad konkreetsed DNA-ga seotud valgud, näiteks transkriptsioonifaktorid, histoonmodifikatsioonid või kromatiiniga seotud regulatiivsed valgud. Seda tehnikat kasutatakse laialdaselt geeniregulatsiooni, epigeneetiliste modifikatsioonide, transkriptsioonifaktorite seondumiskohtade ja kromatiini struktuuri uurimiseks. Kui seda kombineerida järgnevate analüüsimeetoditega, nagu kvantitatiivne PCR (ChIP-qPCR) või suure läbilaskevõimega sekveneerimine (ChIP-seq), võimaldab see kogu genoomi hõlmavat valgu-DNA interaktsioonide kaardistamist.
Millised on ChIP-i tüübid?
Kromatiini immunopretsipitatsiooni on mitmeid variante, mis sõltuvad katse ülesehitusest ja järgnevast analüüsist. Kõige levinumad lähenemisviisid on ChIP-qPCR, mis kvantifitseerib konkreetsete genoomi piirkondade rikastumist; ChIP-seq, mis kasutab järgmise põlvkonna sekveneerimist, et kaardistada valgu-DNA interaktsioone kogu genoomis; ja ChIP-chip, mis ühendab ChIPi ja DNA-mikroskoopanalüüsi. Sõltuvalt uuritavast bioloogilisest küsimusest kasutatakse laialdaselt ka selliseid lisavariante nagu natiivne ChIP (N-ChIP), mille puhul analüüsitakse ristseotamata kromatiini, ja ristseotatud ChIP (X-ChIP), mille puhul kasutatakse valgu-DNA vastastikmõjude stabiliseerimiseks keemilist ristseotust.
Suure läbilaskevõimega kromatiini lõikamine mikroplaatide sonikaatoriga UIP400MTP
Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid alates Lab kuni tööstuslik suurus.