Kromatiini nihkamine ultraheli töötlusega
Kromatiini nihkamine on paljudes epigeneetika ja molekulaarbioloogia töövoogudes kriitiline etapp, eelkõige kromatiini immunosadestamisel (ChIP), ChIP-seq-is ja sarnastes analüüsides. Eesmärk on killustada kromatiin reprodutseeritavateks DNA-valgu kompleksideks, säilitades samal ajal epitoobi terviklikkuse ja minimeerides proovikadu. Olemasolevatest meetoditest on ultraheli abil kromatiini fragmenteerimine muutunud laialdaselt kasutatavaks lähenemisviisiks, kuna see tagab usaldusväärse, reagentideta fragmenteerimise suurepärase reprodutseeritavusega.
Mida tuleks kromatiini nihkamisel silmas pidada?
Tõhus kromatiini nihkamine nõuab katseparameetrite hoolikat kontrolli. Ebaõige fragmenteerimine võib seada ohtu järgnevad ChIP-katsed, tekitades fragmente, mis on kas liiga suured, liigselt lagunenud või proovide vahel ebaühtlased.
Üks olulisemaid tegureid on soovitud fragmentide suurusjaotus. Enamiku ChIP- ja ChIP-seq-rakenduste puhul on optimaalsed kromatiini fragmendid pikkusega 100 kuni 600 aluspaari. See suurusvahemik võimaldab tõhusat immunosadestamist, pakkudes samal ajal piisavat lahutusvõimet genoomi kaardistamiseks.
Teine võtmetegur on ristsidumise tõhusus enne ultraheli töötlust. Enamik ChIP-töövoogusid hõlmab formaldehüüdiga fikseerimist, et stabiliseerida valgu-DNA interaktsioone. Liigne ristsidumine võib aga muuta kromatiini fragmenteerimisele vastupidavamaks, mistõttu on vaja pikemat ultraheli töötlusaega ja see võib suurendada kuumuse mõju.
Temperatuuri kontroll on samuti ülioluline. Ultraheli töötlus tekitab lokaalset energiat, mis võib proovi temperatuuri tõsta. Kõrgendatud temperatuur võib kahjustada DNA-d või denatureerida valke, mõjutades antikeha äratundmist ChIP ajal. Paljud teadlased kasutavad seetõttu impulssidega ultraheli töötluse tsükleid koos jahutuspausidega, et säilitada proovi stabiilsus.
Proovi kontsentratsioon ja maht mõjutavad samuti fragmenteerimise tõhusust. Väga kontsentreeritud kromatiini suspensioonid võivad vajada pikemat ultraheli töötlusaega, samas kui väikesed proovimahud nõuavad täpset energia edastamist, et vältida ületöötlemist.
Lõpuks mõjutab ultraheli seadme valik tugevalt katse reprodutseeritavust. Kromatiini nihkamiseks mõeldud seadmed tagavad tavaliselt kontrollitud ultraheli energia ja standardiseeritud proovikäsitluse, võimaldades ühtlast fragmenteerimist mitme proovi puhul.
Ultraheli DNA nihkamine ChIP ajal – kromatiini immunosadestamine
Millist sonikaatorit peaksin kromatiini nihkamiseks valima?
Erinevad laboritöövood nõuavad erinevaid ultraheli töötluse konfiguratsioone. Optimaalne süsteem sõltub suuresti proovide läbilaskevõimest, mahust ja katseformaadist.
Sondtüüpi sonikaator
Sondtüüpi sonikaator edastab ultraheli energiat otse proovi titaanist sondi kaudu. See konfiguratsioon tagab väga suure energiatiheduse ja sobib seetõttu hästi kromatiini tugevaks lõhkumiseks üksikproovides.
Sondsonikaatorid on eriti kasulikud järgmistel juhtudel:
- Väikese kuni keskmise arvuga proovid
- Raskesti fragmenteeritav kromatiin
- Paindlikud katseprotokollid
Mitme tuubi sonikaator – VialTweeter
Laboritele, mis töötlevad korraga mitut proovi, pakub mitme tuubi sonikaator VialTweeter väga reprodutseeritavat lahendust. Süsteem edastab ultraheli energiat kaudselt viaalihoidiku kaudu, võimaldades fragmenteerida mitut suletud tuubi identsetel tingimustel.
See konfiguratsioon pakub olulisi eeliseid:
- Mitme proovi paralleelne kromatiini nihkamine
- Sondi põhjustatud saastumise välistamine
- Kõrge reprodutseeritavus tuubide vahel
- Lihtsustatud töövoog ChIP proovide ettevalmistamiseks
Sellised mitme tuubi süsteemid sobivad hästi rutiinsete ChIP-katsete ja keskmise läbilaskevõimega uuringute jaoks.
Mikroplaadi sonikaator – UIP400MTP
Suure läbilaskevõimega epigeneetikauuringud tuginevad üha enam mikroplaatidel põhinevale proovitöötlusele. Mikroplaadi sonikaator UIP400MTP on loodud kromatiini fragmenteerimiseks otse standardsetes mikroplaatides ilma proove ümber tõstmata.
See lähenemisviis võimaldab:
- Kümnete või sadade proovide samaaegset töötlemist
- Automatiseerimisele sobivad töövood
- Ühtlane ultrahelienergia jaotus kõigis süvendites
- Proovide käsitsemisetappide märkimisväärne vähenemine
Suurte ChIP-seq skriininguprojektide või suure läbilaskevõimega epigeneetiliste uuringute puhul tagab mikroplaadi ultraheli töötlus (sonikeerimine) erakordse skaleeritavuse ja tõhususe. Mitmekäsilise plaadi sonikaator UIP400MTP sobib hästi integreerimiseks vedelikukäsitlussüsteemidesse ja automatiseeritud laboritöövoogudesse.
Miks eelistada ultraheli töötlust (sonikeerimist) teistele kromatiini lõikamise meetoditele?
Ensümaatiliste meetoditega võrreldes tagab ChIP jaoks tehtav ultraheli töötlus (sonikeerimine) erapooletu fragmenteerimise, kuna protsess ei sõltu järjestusspetsiifilisest ensüümi aktiivsusest. See on eriti oluline genoomiülestes epigeneetilistes uuringutes, kus ühtlane kaetus on hädavajalik.
Veel üks suur eelis on skaleeritavus. Ultrahelisüsteemid sobivad üksikute proovide, mitme tuubi või tervete mikroplaatide jaoks, võimaldades laboritel valida oma katse läbilaskevõimele kõige sobivama konfiguratsiooni.
Lõpuks tagab ultraheli töötlus (sonikeerimine) suurepärase kontrolli fragmenteerimisparameetrite üle. Impulsstsüklite, kestuse ja võimsustasemete kohandamisega saavad teadlased usaldusväärselt saavutada soovitud fragmentide suuruse jaotuse.
Kromatiini fragmenteerimine ChIP-proovide optimeeritud ultraheli töötlusega (sonikeerimisega).
(a) lõikamine puudub (geelis on pikad fragmendid);
(b) optimaalne fragmenteerimisprofiil (200–600 bp fragmentide rikastumine);
(c) liigne DNA fragmenteerimine (lühemate kui 200 bp fragmentide ülekaal)
© Jarillo et al., 2018
Kromatiini lõikamise meetodite võrdlus
| Kromatiini lõikamise meetod | Põhimõte | Eelised | Piirangud |
| Ultraheli töötlus (sonikeerimine) | Kõrgsageduslik akustiline energia fragmenteerib kromatiini mehaaniliselt. | Reagendivaba fragmenteerimine, hästi reprodutseeritavad tulemused, kohandatav fragmentide suuruse jaotus, sobib ristsidestatud kromatiinile, skaleeritav üksikutelt tuubidelt mitme proovi ja mikroplaadi formaatideni. | Nõuab ultraheli töötluse (sonikeerimise) seadmeid ning sonikeerimisparameetrite optimeerimist. |
| Ensümaatiline lõhustamine (MNaas) | Mikrokoki nukleaas lõhustab DNA-d nukleosoomide vahel. | Õrn fragmenteerimine, kasulik natiivse kromatiini analüüsiks. | Ensüümi kallutatus, järjestuseelistus, raskesti kontrollitav lõhustamine, võimalik katsetevaheline varieeruvus. |
| Mehaaniline lõikamine (nõel / süstal) | Kromatiini lõhutakse korduva füüsilise jõu abil. | Lihtne meetod, mis nõuab minimaalseid seadmeid. | Halb reprodutseeritavus, piiratud kontroll fragmentide suuruse üle, töömahukas mitme proovi puhul. |
| Nebulisatsioon | Suruõhk surub DNA väikeste avade kaudu, põhjustades fragmenteerumist. | Kiire fragmenteerimisprotsess. | Võimalik proovikadu, piiratud skaleeritavus, nõuab spetsiaalseid seadmeid. |
Kuidas määrata kromatiini saagist kogust ja kvaliteeti pärast ultraheliga fragmenteerimist?
Pärast ChIP jaoks tehtavat ultraheli töötlust (sonikeerimist) peavad teadlased hindama nii fragmenteeritud kromatiini kogust kui ka kvaliteeti. See kontrollietapp tagab, et kromatiini fragmenteerimine vastab järgnevate rakenduste, näiteks ChIP-qPCR või ChIP-seq, nõuetele.
Kvantifitseerimine algab tavaliselt DNA kontsentratsiooni mõõtmisega. Spektrofotomeetrilised meetodid, nagu Nanodrop-analüüs, või fluoromeetrilised testid, nagu Qubit DNA kvantifitseerimine, annavad usaldusväärse hinnangu kromatiini saagisele pärast ristsidemete eemaldamist ja puhastamist.
Kuid ainuüksi DNA kontsentratsioon ei näita, kas fragmenteerimine õnnestus. Seetõttu hindavad teadlased fragmentide suuruse jaotust elektroforeetiliste meetoditega. Agaroosgeelelektroforees on endiselt laialdaselt kasutatav lähenemisviis DNA fragmentide visualiseerimiseks ja kontrollimiseks, et enamik neist jääb sihtsuuruse vahemikku.
Edasijõudnumad laborid kasutavad sageli kapillaarelektroforeesi süsteeme, näiteks Agilent Bioanalyzer või TapeStation. Need platvormid annavad täpsed suuruse jaotuse profiilid ja võimaldavad teadlastel avastada liigset fragmenteerimist või mittetäielikku lõikamist.
Kromatiini kvaliteeti pärast ultraheliga fragmenteerimist hinnates kinnitavad teadlased tavaliselt:
- Enamik DNA fragmente jääb vahemikku 100–600 bp
- Fragmentide jaotus on korduvproovides ühtlane
- DNA degradatsioon on minimaalne
- Kromatiini kogusaagis on planeeritud ChIP-analüüsiks piisav
Nõuetekohane kvaliteedikontroll tagab, et ultraheli abil toimuv kromatiini nihestamine annab reprodutseeritavaid ja bioloogiliselt tähendusrikkaid tulemusi.
Kokkuvõte: ultraheli abil toimuv kromatiini nihestamine usaldusväärse uurimistöö jaoks
Usaldusväärne kromatiini nihestamine on edukate ChIP- ja epigeneetikauuringute alus. Ultraheli abil toimuv fragmenteerimine pakub võimsa lahenduse, kuna see võimaldab täpset, reprodutseeritavat ja reagentideta kromatiini lõhkumist väga erinevates katseformaatides.
Optimeerides hoolikalt ultraheli töötluse (sonikeerimise) parameetreid, kontrollides fragmentide suurusjaotust ja valides sobiva sonikeerimissüsteemi – olgu selleks sondtüüpi sonikaator, mitme tuubi VialTweeter või suure läbilaskevõimega UIP400MTP mikroplaadi sonikaator – saavad teadlased saavutada järjepideva kromatiini fragmenteerimise, mis toetab kvaliteetseid ChIP- ja ChIP-seq tulemusi.
Kuna epigeneetikauuringud liiguvad jätkuvalt suurema läbilaskevõime ja parema katsete reprodutseeritavuse suunas, on ultraheli abil toimuv kromatiini nihestamine endiselt üks mitmekülgsemaid ja usaldusväärsemaid meetodeid, mis on tänapäevastele molekulaarbioloogia laboritele kättesaadavad.
Disain, tootmine ja nõustamine – Saksamaal valmistatud kvaliteet
Hielscheri ultraheliseadmed on tuntud oma kõrgeima kvaliteedi ja disainistandardite poolest. Töökindlus ja lihtne kasutus võimaldavad meie ultraheliseadmeid sujuvalt integreerida tööstusrajatistesse. Hielscheri ultraheliseadmed saavad hõlpsasti hakkama rasketes tingimustes ja nõudlikes keskkondades.
Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifitseeritud ettevõte ning pöörab erilist tähelepanu suure jõudlusega ultraheliseadmetele, mis kasutavad tipptasemel tehnoloogiat ja on kasutajasõbralikud. Loomulikult vastavad Hielscheri ultraheliseadmed CE nõuetele ning täidavad UL-i, CSA ja RoHs-i nõudeid.
Kromatiini nihestamiseks sonikeeritud tuubistatiiv seadmega UIP400MTP
Kirjandus / allikad
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
- Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
- José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
- Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)
Korduma kippuvad küsimused
Mis on kromatiin?
Kromatiin on DNA ja sellega seotud valkude struktuurne kompleks, mis organiseerib geneetilist materjali eukarüootsete rakkude tuumas. Kromatiini peamised valgud on histoonid, mille ümber DNA keerdub, moodustades nukleosoome. See organisatsioon pakib DNA kokku ning reguleerib samal ajal juurdepääsu geneetilisele informatsioonile selliste protsesside jaoks nagu transkriptsioon, replikatsioon ja DNA parandus.
Millised on kromatiini tüübid?
Kromatiin liigitatakse üldiselt kaheks põhivormiks: eukromatiin ja heterokromatiin. Eukromatiin on lõdvalt pakitud ja transkriptsiooniliselt aktiivne, mistõttu transkriptsioonimasinavärk pääseb geenidele hõlpsasti ligi. Heterokromatiin on tihedamalt pakitud ja transkriptsiooniliselt inaktiivne ning sisaldab tavaliselt korduvaid DNA järjestusi või vaigistatud geene. Heterokromatiin võib olla edasi jaotatud konstitutiivseks heterokromatiiniks, mis jääb püsivalt kondenseerunuks, ja fakultatiivseks heterokromatiiniks, mis võib rakulistest tingimustest sõltuvalt lülituda aktiivse ja inaktiivse oleku vahel.
Mis on ristsidumine?
Ristsidumine on biokeemiline protsess, mida kasutatakse biomolekulide vaheliste interaktsioonide stabiliseerimiseks, moodustades nende vahel kovalentseid sidemeid. Kromatiiniuuringutes kasutatakse ristsidumist tavaliselt valk–DNA interaktsioonide säilitamiseks kromatiinis enne analüüsi. Keemilisi aineid, näiteks formaldehüüdi, kasutatakse tavaliselt pöörduvate kovalentsete sidemete loomiseks DNA ja sellega seotud valkude vahel, “külmutades” molekulaarsed interaktsioonid tõhusalt kindlal ajahetkel. See stabiliseerimine võimaldab kromatiinikomplekse fragmenteerida ja töödelda, kaotamata DNA ja regulatoorsete valkude vahelisi looduslikke seoseid, mis on oluline selliste meetodite jaoks nagu kromatiini immunosadestamine (ChIP).
Mis on ChIP?
Kromatiini immunosadestamine (ChIP) on molekulaarbioloogia meetod, mida kasutatakse valkude ja DNA vaheliste interaktsioonide uurimiseks kromatiinis. Selle meetodi puhul stabiliseeritakse DNA-valgu kompleksid esmalt, tavaliselt ristsidumisega, ning seejärel kromatiin fragmenteeritakse. Sihtvalgule spetsiifilisi antikehi kasutatakse valk-DNA komplekside immunosadestamiseks, mis võimaldab seotud DNA järjestusi isoleerida ja analüüsida.
Milleks ChIP-i kasutatakse?
ChIP-i kasutatakse genoomsete piirkondade tuvastamiseks, millega seonduvad spetsiifilised DNA-ga seotud valgud, näiteks transkriptsioonifaktorid, histooni modifikatsioonid või kromatiiniga seotud regulatoorsed valgud. Tehnikat rakendatakse laialdaselt geeniregulatsiooni, epigeneetiliste modifikatsioonide, transkriptsioonifaktorite seondumissaitide ja kromatiini struktuuri uurimiseks. Kombineerituna järgnevate analüütiliste meetoditega, näiteks kvantitatiivse PCR-i (ChIP-qPCR) või suure läbilaskevõimega sekveneerimisega (ChIP-seq), võimaldab see kaardistada valgu–DNA interaktsioone kogu genoomi ulatuses.
Millised on ChIP-i tüübid?
Kromatiini immunosadestamisel on mitu varianti, olenevalt katse ülesehitusest ja järgnevast analüüsist. Levinumad lähenemisviisid on ChIP-qPCR, mis kvantifitseerib konkreetsete genoomsete piirkondade rikastumist; ChIP-seq, mis kasutab järgmise põlvkonna sekveneerimist valk-DNA interaktsioonide kaardistamiseks kogu genoomis; ning ChIP-chip, mis ühendab ChIP-i DNA mikrokiibi analüüsiga. Lisaks kasutatakse laialdaselt selliseid variante nagu natiivne ChIP (N-ChIP), mis analüüsib ristsidumata kromatiini, ja ristsidumisega ChIP (X-ChIP), mis kasutab valk-DNA interaktsioonide stabiliseerimiseks keemilist ristsidumist, olenevalt uuritavast bioloogilisest küsimusest.
Suure läbilaskevõimega kromatiini nihestamine mikroplaadi sonikaatoriga UIP400MTP
Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid alates laboriskaalast kuni tööstusliku mahuni.