Drosophila melanogasteri proovide ultraheli lüüs

Drosophila melanogasterit kasutatakse laborites laialdaselt mudelorganismina. Seetõttu tuleb sageli läbi viia Drosophila melanogasteri proovide analüüsieelseid ettevalmistusetappe, nagu lüüs, rakkude katkestamine, valgu ekstraheerimine ja DNA lõikamine. Ultraheli dismembraatorid on usaldusväärsed ja tõhusad ning neid saab kasutada mitmesuguste ülesannete täitmiseks, nagu lüüs, valgu ekstraheerimine või DNA killustumine kergesti, reguleerides ainult ultraheli protsessi parameetreid. Ultraheli homogenisaatorid on seega paindlikud tööriistad, millel on lai valik rakendusi.

Ultraheli lüüs ja valgu ekstraheerimine

Lüüs, rakkude lahustumine, kudede homogeniseerimine ja valgu ekstraheerimine on bioloogiliste laborite ultraheli dismembraatorite tüüpilised ülesanded. Ultraheli dismembraatorid ja rakkude katkestajad sobivad hästi loomade kudede, putukate (nt Drosophila melanogaster, C. elegans) või taimeproovide homogeniseerimiseks. Ultraheli järgnevad rakendused on rakususpensioonide ja graanulite lüüs, samuti rakusiseste valkude ekstraheerimine.
Ultraheli lüüs ja valgu ekstraheerimine on väga usaldusväärsed ja reprodutseeritavad protsessid, mida saab teostada kehtestatud protokollide alusel. Kuna ultraheli protsessi intensiivsust saab täpselt reguleerida ultrahelitöötluse parameetrite abil, nagu amplituud, tsükli? impulsi režiim, temperatuur ja proovi maht, kui tõestatud protokolle saab korrata sama tulemusega ikka ja jälle.

Ultraheli DNA ja RNA killustumine

Pärast rakkude lüüsi ja valgu ekstraheerimist on proovi ettevalmistamise tavaline nõutav samm DNA, RNA ja kromatiini lõikamine ja killustumine, nt enne kromatiini immunoprecipitatsiooni (ChIP). DNA ja RNA killustumist on võimalik usaldusväärselt saavutada, purustades kovalentsed sidemed, mis hoiavad DNA-d füüsiliste jõudude abil koos. Kasutades füüsilist lõikamist, näiteks ultrahelitöötlust, purunevad algul DNA ahelad, seejärel killustatakse DNA väiksemateks tükkideks.
Ultraheli DNA killustumine on usaldusväärne ja efektiivne DNA lõikamisel sihitud pikkuseni, nt 500bp (aluspaarid). Ultraheli DNA killustatuse peamised eelised hõlmavad ultraheli protsessi parameetrite ja intensiivsuse täpset kontrolli. Ultraheli protsessi parameetreid saab reguleerida ultrahelitöötluse intensiivsuse, tsüklite ja aja täpse häälestamisega. See võimaldab luua soovitud DNA suurused ja sihitud DNA pikkust saab usaldusväärselt toota ja reprodutseerida. Ultraheli DNA lõikamine on ideaalne ka suure molekulmassiga DNA fragmentide loomiseks.

Drosophila melanogasteri ultraheli lüüsi protokollid

Allpool leiate erinevaid protokolle ultraheli abil toimuva lüüsi, valgu ekstraheerimise ja Drosophila proovide DNA või kromatiini killustumise kohta.

Ultraheli lüüs ristsiduva immunoprecipitatsiooni (CLIP) analüüsi jaoks

CLIP-test viidi läbi, nagu varem teatatud, mõningate muudatustega. Ligikaudu 20 mg munasarjad 0–1 päeva vanustest metsikut tüüpi emasloomadest olid UV-ristseotud (3 × 2000 μJ/cm2), homogeniseeriti jääl 1 ml RCB puhvris (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sahharoos, 1 mM DTT, 1× EDTA-vabad täielikud proteaasi inhibiitorid, 1 mM PMSF), mida täiendati 300 U RNAseOUT-iga ja asetati jääle 30 minutiks. Homogenaat töödeldi jääl, 80% võimsusega, viis korda 20 sekundis, kui Hielscheri ultraheli protsessori kasutamise vahel oli 60 sekundit puhkust UP100H (100 W, 30 kHz) and centrifuged (16000 × g for 5 min at 4°C). Soluble extract was precleared with 20 μl Protein-G dynabeads for 20 min at 4°C. After removal of samples for immunoblotting and quantitation of RNA input (1%), HP1 was immunoprecipitated with anti-HP1 9A9 antibody from 450 μl precleared extract by incubation for 4 h with 50 μl Protein-G dynabeads. Immunoprecipitates were washed 4 times with RCB. To elute the immunoprecipitated RNAs, the pelleted beads were boiled in 100 μL of UltraPure DEPC-treated Water for 5 min. 900 μL Qiazol Reagent was added to the supernatant recovered for RNA preparation. The RNA purified was used as a template to synthesize cDNA using oligo dT, random hexamers and SuperScript reverse transcriptase III according to the manufacturer’s protocol.
(Cassale et al. 2019)

Ultraheli lüüs kromatiini immunoprecipitatsiooni analüüsiks

Kromatiini immunoprecipitatsioon viidi läbi vastavalt Meneti kirjeldatud meetodile väikeste muudatustega. Ligikaudu 20 mg munasarjad 0–1-päevastest metsikut tüüpi emasloomadest homogeniseeriti 1 ml NEB puhvris (10 mM HEPES-Na pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na pH 8 juures, 0,5 mM EDTA-Na pH 8 juures, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidiin, 0,15 mM spermiin, 1× EDTA-vabad täielikud proteaasi inhibiitorid) homogenisaatori? sukeldamise dispergeerijaga 1 min (kiirusel 3000 p? min). Homogenaat kanti eelnevalt jahutatud klaasist dounce'ile ja 15 täislööki kanti tiheda uhmriga. Seejärel tsentrifuugiti vabu tuumasid 6000xg juures 10 minutit 4 °C juures. Tuumasid sisaldavad graanulid resuspendeeriti 1 ml NEB-s ja tsentrifuugiti 20000 × g juures 20 minutit sahharoosigradiendil (0,65 ml 1,6 M sahharoosi NEB-s, 0,35 ml 0,8 M sahharoosi NEB-s). Pellet resuspendeeriti 1 ml NEB-s ja formaldehüüdis lõppkontsentratsioonini 1%. Tuumad olid toatemperatuuril 10 minutit ristseotud ja kustutati, lisades 1/10 vol 1,375 M glütsiini. Tuumad koguti tsentrifuugimise teel 6000 × g juures 5 minutit. Tuumasid pesti kaks korda 1 ml NEB-s ja resuspendeeriti 1 ml lüüsipuhvris (15 mM HEPES-Na pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pH 8 juures, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroüülsarkosiin ja 1× EDTA-vaba täielik proteaasi inhibiitor). Tuumad töödeldi ultraheliga Hielscheri ultraheli protsessori abil UP100H (100 W, 30 kHz) kuus korda 20 s peal ja 1 min jääl. Ultraheliga töödeldud tuumad tsentrifuugiti 13000 × g juures 4 minutit temperatuuril 4 °C. Suurem osa ultraheliga töödeldud kromatiinist oli 500 kuni 1000 aluspaari (bp) pikk. Iga immunoprecipitatsiooni puhul inkubeeriti 15 μg kromatiini 10 μg HP1 9A9 monoklonaalse antikeha juuresolekul (3 tundi 4 °C juures pöörlevas rattas). Seejärel lisati 50 μl dünabeaadide valku G ja inkubeerimist jätkati üleöö temperatuuril 4 °C. Supernatandid jäeti kõrvale ja proove pesti kaks korda lüüsipuhvris (mõlemad pesevad 15 minutit 4 °C juures) ja kaks korda TE-puhvris (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pH 8 juures). Kromatiin elueeriti helmestest kahes etapis; kõigepealt 100 μl eluitsioonpuhvriga 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pH 8 juures) 65 °C juures 15 minutit, millele järgneb tsentrifuugimine ja supernatandi saagis. Helmeste materjal ekstraheeriti uuesti 100 μl TE + 0,67% SDS-is. Kombineeritud eluaati (200 μl) inkubeeriti üleöö 65 °C juures, et ristsidemed tagurdada, ning töödeldi 50 μg/ml RNaseA-ga 15 minutit 65 °C juures ja 500 μg/ml proteinaasiga K 3 tundi 65 °C juures. Proovid ekstraheeriti fenool-kloroformiga ja sadestati etanool. DNA resuspendeeriti 25 μl vees. Molekulaarsete analüüside maksimeerimiseks DNA immunopretsipitatsiooniga võimendati kandidaatgeene paarikaupa optimeeritud dupleks-PCR-protokolli abil, kasutades ühes reaktsioonis kahte erinevat praimerite komplekti, millel oli sarnane sulamistemperatuur.
(Casale et al. 2019)
 

Suure jõudlusega ultraheli rakkude häirijad bioloogiliste proovide jaoks

Hielscher Ultrasonics on teie pikaajaline kogenud partner, kui tegemist on suure jõudlusega ultrasonikaatoritega rakkude katkestamiseks, lüüsimiseks, valgu ekstraheerimiseks, DNA, RNA ja kromatiini killustumiseks, samuti muud eelanalüütilised proovide ettevalmistamise etapid. Pakkudes ulatuslikku ultraheli labori homogenisaatorite ja proovide ettevalmistamise üksuste portfelli, on Hielscheril ideaalne ultraheli seade teie bioloogilise rakenduse ja nõuete jaoks.
Klassikaline sondi tüüpi ultrasonikaator, millel on mikroots, näiteks UP200St (200W; vaata pilti vasakul) või üks ultraheli proovide ettevalmistamise üksustest VialTweeter või UP200St_TD_CupHorn koos VialHolderiga on lemmikmudelid uurimis- ja analüüsilaborites. Klassikaline ultraheli sond on ideaalne, kui valmistada vähem proove tuleb lüüsida, ekstraheerida või killustada. Proovi ettevalmistamise üksused VialTweeter ja UP200St_TD_CupHorn võimaldavad vastavalt kuni 10 või 5 viaali samaaegset ultrahelitöötlust.
Kui tuleb töödelda suurt hulka proove (nt 96 auguga plaadid, mikrotiiterplaadid jne), tuleb UIP400MTP on ideaalne ultrahelitöötluse seadistus. UIP400MTP toimib nagu suurem kuppel, mis on täidetud veega ja millel on piisavalt ruumi mikrokaevude plaatide hoidmiseks. 400-vatise võimsa ultraheli protsessori jõul annab UIP400MTP väga ühtlase ja intensiivse mitme süvendi plaatide ultrahelitöötluse, et häirida rakke, lüüsida proove, lahustada graanuleid, ekstraheerida valke või nihke DNA-d.

Täpne juhtimine nutika tarkvara kaudu

Kõik Hielscheri ultrahelitöötluse lahendused alates 200 vatti ülespoole on varustatud digitaalse värvilise puutetundliku ekraaniga ja intelligentse tarkvaraga. Nutikate andmete protokollimise kaudu salvestatakse kõik ultraheli protsessi parameetrid automaatselt CSV-failina sisseehitatud SD-kaardile niipea, kui ultrasonikaator käivitatakse. See muudab uurimistöö ja protokollimise palju mugavamaks. Pärast ultrahelitöötluse katseid või proovi ettevalmistamist saate lihtsalt läbi vaadata iga ultrahelitöötluse jooksu ultrahelitöötluse parameetrid ja võrrelda neid.
Intuitiivse menüü kaudu saab enne ultrahelitöötlust eelnevalt seadistada arvukalt parameetreid: Näiteks proovi temperatuuri reguleerimiseks ja selle termilise lagunemise vältimiseks saab määrata proovi temperatuuri ülemise piiri. Ühendatav temperatuuriandur, mis on kaasas ultraheliseadmega, annab ultraheli protsessorile tagasisidet tegeliku ultrahelitöötluse temperatuuri kohta. Kui ülemine temperatuuripiir on saavutatud, peatub ultraheli seade, kuni saavutatakse seadistatud ∆T alumine piir ja algab seejärel automaatselt ultraheliga töötlemine.
Kui on vaja ultrahelitöötlust konkreetse energiasisendiga, saate eelseadistada ultrahelitöötluse lõpliku ultraheli energia. Loomulikult saab ultraheli pulsatsiooni ja tsükli režiimi ka individuaalselt seadistada.
Kõige edukamate ultrahelitöötluse parameetrite taaskasutamiseks saate salvestada erinevaid ultrahelitöötluse režiime (nt ultrahelitöötluse aeg, intensiivsus, tsüklirežiim jne) eelseadistatud režiimidena, nii et need oleksid lihtsad ja kiiresti uuesti käivitatud.
Suurema mugavuse huvides saab kõiki digitaalseid ultraheli seadmeid kasutada brauseri kaugjuhtimispuldi kaudu mis tahes ühises brauseris (nt InternetExplorer, Safari, Chrome jne). LAN-ühendus on lihtne plug-n-play seadistus ja ei vaja täiendavat tarkvara installimist.
Meie Hielscheris teame, et bioloogiliste proovide edukas ultrahelitöötlus nõuab täpsust ja korratavust. Seetõttu kujundasime oma ultrasonikaatorid nutiseadmetena, millel on kõik funktsioonid, mis võimaldavad tõhusat, usaldusväärset, reprodutseeritavat ja mugavat proovi ettevalmistamist.

Alltoodud tabel annab teile ülevaate meie ultraheli süsteemide ligikaudsest töötlemisvõimsusest ultraheli mikro-otsikutest ja klassikalistest ultraheli homogenisaatoritest MultiSample ultrasonikaatoritele arvukate proovide mugavaks ja usaldusväärseks ettevalmistamiseks: