Drosophila melanogaster proovid ultraheli lüüsi
Drosophila melanogasterit kasutatakse laborites laialdaselt mudelorganismina. Seetõttu tuleb sageli läbi viia drosophila melanogasteri proovide analüüsieelsed ettevalmistusetapid, nagu lüüs, rakuhäired, valgu ekstraheerimine ja DNA-nihke. Ultraheli dismembraanid on usaldusväärsed ja tõhusad ning neid saab kasutada mitmesuguste ülesannete täitmiseks, nagu lüüs, valgu ekstraheerimine või DNA fragmenteerimine, kohandades ainult ultraheli protsessi parameetreid. Ultraheli homogenisaatorid on seega paindlikud tööriistad, millel on lai valik rakendusi.
Ultraheli lüüsi ja valgu ekstraheerimine
Lüüs, rakkude lahustumine, kudede homogeniseerimine ja valgu ekstraheerimine on tüüpilised ülesanded ultraheli dismembraatoridele bioloogilistes laborites. Ultraheli dismembrators ja rakkude katkendonad sobivad hästi loomsete kudede, putukate (nt Drosophila melanogaster, C. elegans) või taimseid isendeid homogeniseerima. Ultraheli hilisemad rakendused on rakususpensioonide ja graanulite lüüsid ning rakusiseste valkude ekstraheerimine.
Ultraheli lüüs ja valgu ekstraheerimine on väga usaldusväärsed ja reprodutseeritavad protsessid, mida saab teha kehtestatud protokollide alusel. Kuna ultraheli protsessi intensiivsust saab täpselt reguleerida ultrahelitöötlusparameetriteabil, nagu amplituud, tsükkel / impulsi režiim, temperatuur ja proovi maht, võib tõestatud protokolle korrata sama tulemusega ikka ja jälle.
- väga tõhus
- Reguleeritav konkreetsele proovimaterjalile
- Sobib mis tahes mahule
- Mittetermiline töötlemine
- reprodutseeritavad tulemused
- Lihtne ja turvaline
Ultraheli DNA ja RNA killustatus
Pärast rakulüüsi ja valkude ekstraheerimist on proovi valmistamisel tavaline vajalik samm DNA, RNA ja kromatiini nihke ja killustumisega, nt enne kromatiini immunopretsipiatsiooni (ChIP). DNA ja RNA killustatust on võimalik usaldusväärselt saavutada, lõhkudes kovalentsed sidemed, mis hoiavad DNA-d füüsiliste jõudude abil koos. Kasutades füüsilist nihke, näiteks ultrahelitöötlust, purunevad alguses DNA ahelad, seejärel fragmenteeritakse DNA väiksemateks tükkideks.
Ultraheli DNA killustatus on usaldusväärne ja tõhus lõikamine DNA sihtpikkusega, nt 500bp (aluspaarid). Ultraheli DNA killustumise peamised eelised on ultraheli protsessi parameetrite ja intensiivsuse täpne kontroll. Ultraheli protsessi parameetreid saab reguleerida ultrahelitöötlusintensiivsuse, tsüklite ja täpselt aja häälestamisega. See võimaldab luua soovitud DNA suurused ja sihitud DNA pikkust saab usaldusväärselt toota ja reprodutseerida. Ultraheli DNA lõikamine on ideaalne ka suure molekulmassiga DNA fragmentide loomiseks.

ultraheligaator Uf200 ः t 2mm mikrotipiga S26d2 Drosophila proovide ultrahelitöötluseks
Protokollid ultraheli lüüsi Drosophila melanogaster
Allpool leiate erinevaid protokolle ultraheli abil lüüsi, valgu ekstraheerimise ja Drosophila proovide Dna või kromatiini killustumise kohta.
Ultraheli lüüs ristsidumise immunosadestuse (CLIP) analüüsiks
CLIP-analüüs viidi läbi nii, nagu varem teatatud, koos mõnede muudatustega. Ligikaudu 20 mg munasarjad 0- kuni 1-päevastest metsikut tüüpi emasloomadest olid UV-ristlinkitud (3 × 2000 μJ/cm2), homogeniseeriti jääl 1 ml RCB puhvris (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sahharoos, 1 mM DTT, 1× EDTA-vabad Täieliku Proteaasi inhibiitorid, 1 mM PMSF), millele on lisatud 300 U RNAseOUT ja asetatakse jääle 30 min. Homogenaat sonicated jääl, 80% võimsusega, viis korda 20 s puruneb 60 s puhkepausi vahel kasutades Hielscheri ultraheli protsessorit UP100H (100 W, 30 kHz) tsentrifuugitakse (16000 × g 5 minutit 4 °C juures). Lahustuv ekstrakt puhastati eelnevalt 20 μl proteiin-G dünabeadsiga 20 minutit 4 °C juures. Pärast proovide eemaldamist immunoblotanalüüsiks ja RNA sisendi kvantifitseerimiseks (1%), oli HP1 immunopretseeritud anti-HP1 9A9 antikehaga 450 μl eeltäidetud ekstraktist inkubeerimiseteel 4 tundi 50 μl proteiin-G dünabeadsiga. Immunoprecipitates pesti 4 korda RCB. Immunoprecipitated RNAde elueerimiseks kuumutati granuleeritud helmed 100 μl UltraPure DEPC-ga töödeldud vees 5 min. 900 μL Qiazol reaktiivi RNA valmistamiseks taasleitud supernatandile. Puhastatud RNA-d kasutati mallina cDNA sünteesimiseks oligo dT, juhuslike heksamanide ja superskripti deskriptaasi III abil vastavalt tootja protokollile.
(Cassale et al. 2019)
Kromatiini immunosadestamise analüüsi ultrahelilüüs
Kromatiini immunoprecipitation viidi läbi Meneti kirjeldatud meetodil väikeste muudatustega. Ligikaudu 20 mg munasarju 0- kuni 1-päevastest metsloomadest homogeniseeriti 1 ml NEB puhvris (10 mM HEPES-Na pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na pH 8 juures, 0,5 mM EDTA-Na pH 8 juures, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidiin, 0,15 mM Spermiin, 1× EDTA- vabad Täieliku Proteaasi inhibiitorid) homogenisaatoriga / sukeldumisdispondeerijaga 1 min (3000 pööret minutis). Homogenaat kanti eelnevalt jahutatud klaasist dounce'i ja 15 täislööki rakendati tiheda kahjuriga. Seejärel tsentrifuugiti vabad tuumad 6000xg juures 10 minutit 4 °C juures. Tuuma sisaldavad graanulid resuspendeeriti 1 ml NEB-s ja tsentrifuugiti 20000 × g juures 20 minuti jooksul sahharoosi g-le (0,65 ml 1,6 M sahharoosi NEB-s, 0,35 ml 0,8 M sahharoosi NEB-s). Graanul resuspendeeriti 1 ml NEB-s ja formaldehüüdis lõplikuks kontsentratsiooniks 1%. Tuumad ristsidati 10 min toatemperatuuril ja kustutati, lisades 1/10 vol 1,375 M glütsiini. Tuumad koguti tsentrifuugimise teel 6000 × g juures 5 min jooksul. Tuumad pesti kaks korda 1 ml NEB-s ja resuspendeeriti 1 ml L-s (15 mM HEPES-Na pH 7,6 juures, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pH 8 juures, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na deoksükolaat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroüülsarkosiin ja 1× EDTA-vabad täieliku proteaasi inhibiitorid). Tuumad ultraheliga, kasutades Hielscheri ultraheli protsessorit UP100H (100 W, 30 kHz) kuus korda 20 s kohta ja 1 min jääl. Sonikeeritud tuumad tsentrifuugiti 13000 × g 4 minutit 4 °C juures. Enamik ultraheliga töödeldud kromatiini oli 500-1000 baaspaari (bp) pikkus. Iga immunosadestamise puhul inkubeeriti 15 μg kromatiini 10 μg HP1 9A9 monoklonaalse antikeha juuresolekul (pöörleva ratta puhul 3 tundi 4 °C juures). Seejärel lisati 50 μl dünabeads'i proteiin G ja inkubeerimist jätkati üleöö 4 °C juures. Supernatandid visati ära ja proovid pesti kaks korda Lüüsipuhvris (iga pesemine 15 minutit 4 °C juures) ja kaks korda TE Puhvris (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pH 8 juures). Kromatiin elueeriti helmed kahes etapis; esimene 100 μl eluitioni puhvrit 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pH 8 juures) temperatuuril 65 °C 15 minutit, millele järgneb tsentrifuugimine ja supernatandi taastumine. Helmede materjal ekstraheeriti uuesti 100 μl TE + 0,67% SDS-is. Kombineeritud eluaati (200 μl) inkubeeriti üleöö 65 °C juures, et ristühendus ihendada, ning töödeldi 50 μg/ml RNaseAga 15 minutit temperatuuril 65 °C ja 500 μg/ml proteinaas K 3 tunni jooksul temperatuuril 65 °C. Proovid olid fenool-kloroformi ekstraheeritud ja etanooli sadestatud. DNA resuspendeeritud 25 μl vees. Molekulaaranalüüside maksimeerimiseks DNA immunopretsieratsiooniga võimendati kandidaatgeene paarides optimeeritud dupleks-PCR-protokolli abil, kasutades kahte erinevat praimerite kogumit, millel on ühe reaktsiooniga sarnane sulamistemperatuur.
(Casale et al. 2019)

UP200 TD_CupHorn selliste proovide kaudseks ultrahelitöötluseks nagu DNA ja kromatiini lõikamine
Suure jõudlusega ultraheli rakkude katkendid bioloogiliste proovide jaoks
Hielscher Ultrasonics on teie kauakogenud partner, kui tegemist on suure jõudlusega ultrasonicators raku häireid, lüüsi, valgu ekstraheerimise, DNA, RNA ja kromatiini killustatuse samuti teiste preanalüütiliste proovi ettevalmistamise samme. Pakkudes terviklikku portfelli ultraheli lab homogenisaatorid ja proovi ettevalmistamise üksused, Hielscher on ideaalne ultraheli seade oma bioloogilise kohaldamise ja nõuded.
Klassikaline sondi-tüüpi ultrasonicator mikrootsaga, näiteks UP200St (200W; vt pilt vasakul) või üks ultraheli proovi ettevalmistamise ühikutest VialTweeter või UP200ST_TD_CupHorn vialholder on lemmik mudelid teadus-ja analüütilised laborid. Klassikaline ultraheli sond on ideaalne, kui valmistada vähem proove tuleb lüsitada, ekstraheerida või killustada. Proovi ettevalmistamise üksused VialTweeter ja UP200St_TD_CupHorn võimaldavad samaaegselt ultrahelitöötlus kuni 10 või 5 viaali võrra.
Kui tuleb töödelda suuri proovide numbreid (nt 96 puurkaevuga plaate, mikrotiiterplaate jne), tuleb Led, mida sa ei pea booking.com-i külastajaid vastu on ideaalne ultrahelitöötluse seadistus. UIP400MTP toimib nagu suurem cuphorn, mis on täidetud veega ja on piisavalt ruumi, et hoida mikro-hästi plaadid. Powered by 400 vatti võimas ultraheli protsessor, UIP400MTP pakub väga ühtlane ja intensiivne ultrahelitöötlus multi-well plaadid, et häirida rakke, lüse proovid, lahustuvad graanulid, ekstrakti valgud või nihke DNA.
Täpne kontroll smart tarkvara kaudu
Kõik Hielscheri ultrahelitöötluslahendused alates 200 vatti ülespoole on varustatud digitaalse värvipuuteekraani ja intelligentse tarkvaraga. Nutikate andmete protokollimise kaudu salvestatakse kõik ultraheli protsessi parameetrid automaatselt CSV-failina sisseehitatud SD-kaardile niipea, kui ultrasonicator on käivitatud. See muudab uurimistöö ja protokollimise palju mugavamaks. Pärast ultrahelitöötluskatseid või proovi ettevalmistamist saate lihtsalt üle vaadata iga ultrahelitöötluse ultrahelitöötluse parameetrid ja neid võrrelda.
Intuitiivse menüü kaudu saab enne ultrahelitöötlust eelseadistada arvukalt parameetere: näiteks proovi temperatuuri reguleerimiseks ja selle termilise lagunemise vältimiseks võib määrata proovi temperatuuri ülemise piiri. Ühendatav temperatuuriandur, mis on kaasas ultraheli seadmega, annab ultraheli protsessorile tagasisidet tegeliku ultrahelitöötlustemperatuuri kohta. Kui ülemine temperatuuripiir on saavutatud, peatub ultraheli seade, kuni saavutatakse komplekti alumine piir ∆T ja hakkab seejärel automaatselt uuesti ultraheliga.
Kui ultrahelitöötlus konkreetse energiasisendiga on vajalik, saate ultrahelitöötluse käivitamise lõpliku ultraheli energia eelseadistada. Loomulikult saab ka ultraheli pulsatsiooni ja tsükli režiimi individuaalselt määrata.
Oma kõige edukamate ultrahelitöötlusparameetrite uuesti kasutamiseks saate salvestada erinevaid ultrahelitöötlusrežiime (nt ultrahelitöötluse aeg, intensiivsus, tsükli režiim jne) eelseadistatud režiimidena, et need oleksid lihtsad ja kiiresti uuesti käivitatud.
Rohkem töömugavuse, kõik digitaalsed ultraheli üksused saab kasutada brauseri kaugjuhtimispuldi mis tahes ühise brauseri (nt InternetExplorer, Safari, Chrome jne). LAN-ühendus on lihtne plug-n-play setup ja ei nõua täiendavat tarkvara installi.
Hielscheri juures teame, et bioloogiliste proovide edukas ultrahelitöötlus nõuab täpsust ja korratavust. Seetõttu projekteerisime oma ultrasonicators nutiseadmetena koos kõigi funktsioonidega, mis võimaldavad tõhusat, usaldusväärset, reprodutseeritavat ja mugavat proovi ettevalmistamist.
Allolev tabel annab teile märku meie ultraheli süsteemide ligikaudsest töötlemisvõimsusest ultraheli mikro-näpunäidetest ja klassikalistest ultraheli homogenisaatoritest kuni MultiSample ultrasonikaatoriteni paljude proovide mugavaks ja usaldusväärseks ettevalmistamiseks:
partii Köide | flow Rate | Soovitatavad seadmed |
---|---|---|
96-well / mikrotiiter plaadid | e.k. | Led, mida sa ei pea booking.com-i külastajaid vastu |
10 viaali à 0,5 kuni 1,5 ml | e.k. | VialTweeter UP200St |
CupHorn kaudseks ultrahelitöötluseks, nt kuni 5 viaali | e.k. | UP200ST_TD_CupHorn |
00,01 kuni 250ml | 5 kuni 100ml/min | UP50H |
00,01 kuni 500ml | 10 kuni 200 ml / min | UP100H |
00,02 kuni 1L | 20 kuni 400 ml / min | Uf200 ः t / UP200St |
10 kuni 2000 ml | 20 kuni 400 ml / min | Uf200 ः t, UP400St |
00,25 kuni 5L | 00,05 kuni 1L/min | UIP500hdT |
Võta meiega ühendust! / Küsi meiega!

Ultraheli mitmeprooviline ettevalmistusseade VialTweeter võimaldab samaaegset ultrahelitöötlust kuni 10 viaali. Mis klamber-on seade VialPress, kuni 4 täiendavat torud saab vajutada ees intensiivne ultrahelitöötlus.
Kirjandus/viited
- Casale, A.M.; Cappucci, U.; Fanti, L.; Piacentini, L. (2019): Heterochromatin protein 1 (HP1) is intrinsically required for post-transcriptional regulation of Drosophila Germline Stem Cell (GSC) maintenance. Sci Rep 9, 4372 (2019).
- Ristola, M.; Arpiainen, S., Saleem, M.A.; Mathieson, P.W.; Welsh, G.I.; Lehtonen, S.; Holthöfer, H.(2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biol 10, 83 (2009).
- Kharchenko, P.V: et al. (2011): Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila. Nature. 2011 Mar 24; 471(7339): 480–485.

Suure jõudlusega ultraheli! Hielscheri tootevalik hõlmab kogu spektrit kompaktsest labori ultraheliseadmest pink-top üksuste kohal kuni täistööstuslike ultrahelisüsteemideni.
Faktid Tasub teada
Metaboloomika
Metaboloamika on rakkudes, biofluidides, kudedes või organismides esinevate väikeste molekulide ehk metaboliitide uurimine. Need väikesed molekulid ja nende koostoimed bioloogilises süsteemis on kokku võetud katustermini "metabolome" all ja uurimisvaldkonda nimetatakse metaboloamikaks. Metaboloomi uuringud on tihedalt seotud kiiresti areneva täppismeditsiini valdkonnaga. Metaboloomi mõistmine ja selle seos erinevate haigustega aitab arendada haiguste ennetamise ja kliinilise hoolduse strateegiaid, samal ajal kui individuaalne varieeruvus keskkonnas, elustiilis, geneetikas ja molekulaarses fenotüübis. Metaboliitide molekulide vabastamiseks rakkudest kasutatakse ultraheliuuringut sageli bioloogilistes laborites analüüsieelse proovi valmistamiseks, nagu raku häired, lüüsimine ja valkude, lipiidide ja muude molekulide ekstraheerimine.