Drosophila melanogaster proovid ultraheli lüüsi

Drosophila melanogasterit kasutatakse laborites laialdaselt mudelorganismina. Seetõttu tuleb sageli läbi viia drosophila melanogasteri proovide analüüsieelsed ettevalmistusetapid, nagu lüüs, rakuhäired, valgu ekstraheerimine ja DNA-nihke. Ultraheli dismembraanid on usaldusväärsed ja tõhusad ning neid saab kasutada mitmesuguste ülesannete täitmiseks, nagu lüüs, valgu ekstraheerimine või DNA fragmenteerimine, kohandades ainult ultraheli protsessi parameetreid. Ultraheli homogenisaatorid on seega paindlikud tööriistad, millel on lai valik rakendusi.

Ultraheli lüüsi ja valgu ekstraheerimine

Lüüs, rakkude lahustumine, kudede homogeniseerimine ja valgu ekstraheerimine on tüüpilised ülesanded ultraheli dismembraatoridele bioloogilistes laborites. Ultraheli dismembrators ja rakkude katkendonad sobivad hästi loomsete kudede, putukate (nt Drosophila melanogaster, C. elegans) või taimseid isendeid homogeniseerima. Ultraheli hilisemad rakendused on rakususpensioonide ja graanulite lüüsid ning rakusiseste valkude ekstraheerimine.
Ultraheli lüüs ja valgu ekstraheerimine on väga usaldusväärsed ja reprodutseeritavad protsessid, mida saab teha kehtestatud protokollide alusel. Kuna ultraheli protsessi intensiivsust saab täpselt reguleerida ultrahelitöötlusparameetriteabil, nagu amplituud, tsükkel / impulsi režiim, temperatuur ja proovi maht, võib tõestatud protokolle korrata sama tulemusega ikka ja jälle.

Ultraheli DNA ja RNA killustatus

Pärast rakulüüsi ja valkude ekstraheerimist on proovi valmistamisel tavaline vajalik samm DNA, RNA ja kromatiini nihke ja killustumisega, nt enne kromatiini immunopretsipiatsiooni (ChIP). DNA ja RNA killustatust on võimalik usaldusväärselt saavutada, lõhkudes kovalentsed sidemed, mis hoiavad DNA-d füüsiliste jõudude abil koos. Kasutades füüsilist nihke, näiteks ultrahelitöötlust, purunevad alguses DNA ahelad, seejärel fragmenteeritakse DNA väiksemateks tükkideks.
Ultraheli DNA killustatus on usaldusväärne ja tõhus lõikamine DNA sihtpikkusega, nt 500bp (aluspaarid). Ultraheli DNA killustumise peamised eelised on ultraheli protsessi parameetrite ja intensiivsuse täpne kontroll. Ultraheli protsessi parameetreid saab reguleerida ultrahelitöötlusintensiivsuse, tsüklite ja täpselt aja häälestamisega. See võimaldab luua soovitud DNA suurused ja sihitud DNA pikkust saab usaldusväärselt toota ja reprodutseerida. Ultraheli DNA lõikamine on ideaalne ka suure molekulmassiga DNA fragmentide loomiseks.

Protokollid ultraheli lüüsi Drosophila melanogaster

Allpool leiate erinevaid protokolle ultraheli abil lüüsi, valgu ekstraheerimise ja Drosophila proovide Dna või kromatiini killustumise kohta.

Ultraheli lüüs ristsidumise immunosadestuse (CLIP) analüüsiks

CLIP-analüüs viidi läbi nii, nagu varem teatatud, koos mõnede muudatustega. Ligikaudu 20 mg munasarjad 0- kuni 1-päevastest metsikut tüüpi emasloomadest olid UV-ristlinkitud (3 × 2000 μJ/cm2), homogeniseeriti jääl 1 ml RCB puhvris (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sahharoos, 1 mM DTT, 1× EDTA-vabad Täieliku Proteaasi inhibiitorid, 1 mM PMSF), millele on lisatud 300 U RNAseOUT ja asetatakse jääle 30 min. Homogenaat sonicated jääl, 80% võimsusega, viis korda 20 s puruneb 60 s puhkepausi vahel kasutades Hielscheri ultraheli protsessorit UP100H (100 W, 30 kHz) tsentrifuugitakse (16000 × g 5 minutit 4 °C juures). Lahustuv ekstrakt puhastati eelnevalt 20 μl proteiin-G dünabeadsiga 20 minutit 4 °C juures. Pärast proovide eemaldamist immunoblotanalüüsiks ja RNA sisendi kvantifitseerimiseks (1%), oli HP1 immunopretseeritud anti-HP1 9A9 antikehaga 450 μl eeltäidetud ekstraktist inkubeerimiseteel 4 tundi 50 μl proteiin-G dünabeadsiga. Immunoprecipitates pesti 4 korda RCB. Immunoprecipitated RNAde elueerimiseks kuumutati granuleeritud helmed 100 μl UltraPure DEPC-ga töödeldud vees 5 min. 900 μL Qiazol reaktiivi RNA valmistamiseks taasleitud supernatandile. Puhastatud RNA-d kasutati mallina cDNA sünteesimiseks oligo dT, juhuslike heksamanide ja superskripti deskriptaasi III abil vastavalt tootja protokollile.
(Cassale et al. 2019)

Kromatiini immunosadestamise analüüsi ultrahelilüüs

Chromatin immunoprecipitation was performed according to the method described by Menet with minor modifications. Approximately 20 mg ovaries from 0- to 1-day-old wild-type females were homogenized in 1 mL of NEB buffer (10 mM HEPES-Na at pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM EGTA-Na at pH 8, 0.5 mM EDTA-Na at pH 8, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 0.5 mM Spermidine, 0.15 mM Spermine, 1× EDTA- free Complete Protease Inhibitors) with a homogenizer / immersion disperser 1 min (at 3000 rpm). The homogenate was transferred to a pre-chilled glass dounce and 15 full strokes were applied with a tight pestle. Free nuclei were then centrifuged at 6000xg for 10 min at 4°C. The nuclei-containing pellets were resuspended in 1 mL of NEB and centrifuged at 20000 × g for 20 min on sucrose gradient (0.65 mL of 1.6 M sucrose in NEB, 0.35 mL of 0.8 M sucrose in NEB). The pellet was resuspended in 1 mL of NEB and formaldehyde to a final concentration of 1%. Nuclei were cross-linked for 10 min at room temperature and quenched by adding 1/10 vol of 1.375 M glycine. The nuclei were collected by centrifugation at 6000 × g for 5 min. Nuclei were washed twice in 1 mL of NEB and resuspended in 1 mL of Lysis Buffer (15 mM HEPES-Na at pH 7.6, 140 mM NaCl, 0.5 mM EGTA, 1 mM EDTA at pH 8, 1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 0.1% Na Deoxycholate, 0.1% SDS, 0.5% N-lauroylsarcosine and 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors). Nuclei were sonicated using a Hielscher Ultrasonic Processor UP100H (100 W, 30 kHz) kuus korda 20 s kohta ja 1 min jääl. Sonikeeritud tuumad tsentrifuugiti 13000 × g 4 minutit 4 °C juures. Enamik ultraheliga töödeldud kromatiini oli 500-1000 baaspaari (bp) pikkus. Iga immunosadestamise puhul inkubeeriti 15 μg kromatiini 10 μg HP1 9A9 monoklonaalse antikeha juuresolekul (pöörleva ratta puhul 3 tundi 4 °C juures). Seejärel lisati 50 μl dünabeads'i proteiin G ja inkubeerimist jätkati üleöö 4 °C juures. Supernatandid visati ära ja proovid pesti kaks korda Lüüsipuhvris (iga pesemine 15 minutit 4 °C juures) ja kaks korda TE Puhvris (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pH 8 juures). Kromatiin elueeriti helmed kahes etapis; esimene 100 μl eluitioni puhvrit 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pH 8 juures) temperatuuril 65 °C 15 minutit, millele järgneb tsentrifuugimine ja supernatandi taastumine. Helmede materjal ekstraheeriti uuesti 100 μl TE + 0,67% SDS-is. Kombineeritud eluaati (200 μl) inkubeeriti üleöö 65 °C juures, et ristühendus ihendada, ning töödeldi 50 μg/ml RNaseAga 15 minutit temperatuuril 65 °C ja 500 μg/ml proteinaas K 3 tunni jooksul temperatuuril 65 °C. Proovid olid fenool-kloroformi ekstraheeritud ja etanooli sadestatud. DNA resuspendeeritud 25 μl vees. Molekulaaranalüüside maksimeerimiseks DNA immunopretsieratsiooniga võimendati kandidaatgeene paarides optimeeritud dupleks-PCR-protokolli abil, kasutades kahte erinevat praimerite kogumit, millel on ühe reaktsiooniga sarnane sulamistemperatuur.
(Casale et al. 2019)

Suure jõudlusega ultraheli rakkude katkendid bioloogiliste proovide jaoks

Hielscher Ultrasonics on teie kauakogenud partner, kui tegemist on suure jõudlusega ultrasonicators raku häireid, lüüsi, valgu ekstraheerimise, DNA, RNA ja kromatiini killustatuse samuti teiste preanalüütiliste proovi ettevalmistamise samme. Pakkudes terviklikku portfelli ultraheli lab homogenisaatorid ja proovi ettevalmistamise üksused, Hielscher on ideaalne ultraheli seade oma bioloogilise kohaldamise ja nõuded.
Klassikaline sondi-tüüpi ultrasonicator mikrootsaga, näiteks UP200St (200W; vt pilt vasakul) või üks ultraheli proovi ettevalmistamise ühikutest VialTweeter või UP200ST_TD_CupHorn vialholder on lemmik mudelid teadus-ja analüütilised laborid. Klassikaline ultraheli sond on ideaalne, kui valmistada vähem proove tuleb lüsitada, ekstraheerida või killustada. Proovi ettevalmistamise üksused VialTweeter ja UP200St_TD_CupHorn võimaldavad samaaegselt ultrahelitöötlus kuni 10 või 5 viaali võrra.
Kui tuleb töödelda suuri proovide numbreid (nt 96 puurkaevuga plaate, mikrotiiterplaate jne), tuleb Led, mida sa ei pea booking.com-i külastajaid vastu on ideaalne ultrahelitöötluse seadistus. UIP400MTP toimib nagu suurem cuphorn, mis on täidetud veega ja on piisavalt ruumi, et hoida mikro-hästi plaadid. Powered by 400 vatti võimas ultraheli protsessor, UIP400MTP pakub väga ühtlane ja intensiivne ultrahelitöötlus multi-well plaadid, et häirida rakke, lüse proovid, lahustuvad graanulid, ekstrakti valgud või nihke DNA.

Täpne kontroll smart tarkvara kaudu

Kõik Hielscheri ultrahelitöötluslahendused alates 200 vatti ülespoole on varustatud digitaalse värvipuuteekraani ja intelligentse tarkvaraga. Nutikate andmete protokollimise kaudu salvestatakse kõik ultraheli protsessi parameetrid automaatselt CSV-failina sisseehitatud SD-kaardile niipea, kui ultrasonicator on käivitatud. See muudab uurimistöö ja protokollimise palju mugavamaks. Pärast ultrahelitöötluskatseid või proovi ettevalmistamist saate lihtsalt üle vaadata iga ultrahelitöötluse ultrahelitöötluse parameetrid ja neid võrrelda.
Intuitiivse menüü kaudu saab enne ultrahelitöötlust eelseadistada arvukalt parameetere: näiteks proovi temperatuuri reguleerimiseks ja selle termilise lagunemise vältimiseks võib määrata proovi temperatuuri ülemise piiri. Ühendatav temperatuuriandur, mis on kaasas ultraheli seadmega, annab ultraheli protsessorile tagasisidet tegeliku ultrahelitöötlustemperatuuri kohta. Kui ülemine temperatuuripiir on saavutatud, peatub ultraheli seade, kuni saavutatakse komplekti alumine piir ∆T ja hakkab seejärel automaatselt uuesti ultraheliga.
Kui ultrahelitöötlus konkreetse energiasisendiga on vajalik, saate ultrahelitöötluse käivitamise lõpliku ultraheli energia eelseadistada. Loomulikult saab ka ultraheli pulsatsiooni ja tsükli režiimi individuaalselt määrata.
Oma kõige edukamate ultrahelitöötlusparameetrite uuesti kasutamiseks saate salvestada erinevaid ultrahelitöötlusrežiime (nt ultrahelitöötluse aeg, intensiivsus, tsükli režiim jne) eelseadistatud režiimidena, et need oleksid lihtsad ja kiiresti uuesti käivitatud.
Rohkem töömugavuse, kõik digitaalsed ultraheli üksused saab kasutada brauseri kaugjuhtimispuldi mis tahes ühise brauseri (nt InternetExplorer, Safari, Chrome jne). LAN-ühendus on lihtne plug-n-play setup ja ei nõua täiendavat tarkvara installi.
Hielscheri juures teame, et bioloogiliste proovide edukas ultrahelitöötlus nõuab täpsust ja korratavust. Seetõttu projekteerisime oma ultrasonicators nutiseadmetena koos kõigi funktsioonidega, mis võimaldavad tõhusat, usaldusväärset, reprodutseeritavat ja mugavat proovi ettevalmistamist.

Allolev tabel annab teile märku meie ultraheli süsteemide ligikaudsest töötlemisvõimsusest ultraheli mikro-näpunäidetest ja klassikalistest ultraheli homogenisaatoritest kuni MultiSample ultrasonikaatoriteni paljude proovide mugavaks ja usaldusväärseks ettevalmistamiseks: