Drosophila Melanogaster’i proovide ultraheli lüüs

Drosophila melanogaster’it kasutatakse laborites laialdaselt mudelorganismina. Seetõttu tuleb Drosophila melanogaster’i proovidega sageli teha analüüsieelseid ettevalmistusetappe, nagu lüüs, rakkude lõhkumine, valkude ekstraheerimine ja DNA nihkelõikamine. Ultraheli dismembraatorid on usaldusväärsed ja tõhusad ning nendega saab hõlpsasti teha mitmesuguseid ülesandeid, nagu lüüs, valkude ekstraheerimine või DNA fragmenteerimine, kohandades ainult ultraheli protsessiparameetreid. Ultraheli homogenisaatorid on seega paindlikud tööriistad laia kasutusvaldkonnaga.

Ultraheli lüüs ja valkude ekstraheerimine

Lüüs, rakkude solubiliseerimine, koe homogeniseerimine ja valkude ekstraheerimine on bioloogialaborites ultraheli dismembraatorite tüüpilised ülesanded. Ultraheli dismembraatorid ja rakulõhkujad sobivad hästi loomsete kudede, putukate (nt Drosophila melanogaster, C. elegans) või taimsete proovide homogeniseerimiseks. Ultraheli töötluse järgmised rakendused on rakususpensioonide ja sadete lüüs ning rakusiseste valkude ekstraheerimine.
Ultraheli lüüs ja valkude ekstraheerimine on väga usaldusväärsed ja korratavad protsessid, mida saab teostada väljakujunenud protokollide alusel. Kuna ultraheli protsessi intensiivsust saab täpselt reguleerida sonikeerimise parameetrite, nagu amplituud, tsükli- / impulssrežiim, temperatuur ja proovi maht, kaudu, saab kord end tõestanud protokolle korrata ikka ja jälle sama tulemusega.

Ultraheli DNA ja RNA fragmenteerimine

Pärast rakkude lüüsi ja valkude ekstraheerimist on proovide ettevalmistamisel sageli vajalik etapp DNA, RNA ja kromatiini nihkelõikamine ja fragmenteerimine, nt enne kromatiini immunosadestamist (ChIP). DNA ja RNA fragmenteerimist saab usaldusväärselt saavutada, katkestades füüsikaliste jõudude abil kovalentsed sidemed, mis hoiavad DNA-d koos. Füüsikalise nihkelõikamise, näiteks ultraheli töötluse (sonikeerimise) abil katkevad esmalt DNA ahelad, seejärel fragmenteeritakse DNA väiksemateks tükkideks.
Ultraheli DNA fragmenteerimine on usaldusväärne ja tõhus DNA nihkelõikamisel soovitud pikkuseni, nt 500bp (aluspaari). Ultraheli DNA fragmenteerimise peamised eelised hõlmavad ultraheli protsessiparameetrite ja intensiivsuse täpset kontrolli. Ultraheli protsessiparameetreid saab reguleerida, häälestades täpselt ultraheli töötluse intensiivsust, tsükleid ja aega. See võimaldab luua soovitud DNA suurusi ning soovitud DNA pikkust saab usaldusväärselt nii toota kui ka reprodutseerida. Ultraheli DNA nihkelõikamine sobib ideaalselt ka suure molekulmassiga DNA fragmentide loomiseks.

Drosophila melanogaster’i ultraheli lüüsi protokollid

Allpool leiate mitmesuguseid protokolle Drosophila proovide ultraheli abil toetatud lüüsiks, valkude ekstraheerimiseks ning DNA või kromatiini fragmenteerimiseks.

Ultraheli lüüs ristsiduva immunosadestamise (CLIP) analüüsiks

CLIP analüüs viidi läbi nii, nagu on varem kirjeldatud, väikeste muudatustega. Ligikaudu 20 mg munasarju 0–1 päeva vanustelt metsiktüüpi emastelt töödeldi UV-ristsidumiseks (3 × 2000 μJ/cm2), homogeniseeriti jääl 1 mL RCB puhvris (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sahharoos, 1 mM DTT, 1× EDTA-vabad Complete proteaasi inhibiitorid, 1 mM PMSF), millele oli lisatud 300 U RNAseOUT, ning hoiti 30 min jääl. Homogenaati töödeldi ultraheliga jääl 80% võimsusel viis korda 20 s impulssidena, mille vahel oli 60 s paus, kasutades Hielscher Ultrasonic Processor’it UP100H (100 W, 30 kHz) ja tsentrifuugiti (16 000 × g 5 min jooksul temperatuuril 4°C). Lahustuv ekstrakt eelpuhastati 20 μl Protein-G dynabeads’iga 20 min jooksul temperatuuril 4°C. Pärast immunoblotanalüüsi ja RNA sisendi (1%) kvantifitseerimise proovide eemaldamist immunosadestati HP1 anti-HP1 9A9 antikehaga 450 μl eelpuhastatud ekstraktist, inkubeerides 4 h 50 μl Protein-G dynabeads’iga. Immunosadestised pesti RCB-ga 4 korda. Immunosadestatud RNA-de elueerimiseks keedeti sadestunud helmeid 100 μL UltraPure DEPC-töödeldud vees 5 min. RNA preparatsiooniks kogutud supernatandile lisati 900 μL Qiazol Reagenti. Puhastatud RNA-d kasutati matriitsina cDNA sünteesiks, kasutades oligo dT-d, juhuslikke heksameere ja SuperScript pöördtranskriptaasi III vastavalt tootja protokollile.
(Cassale et al. 2019)

Ultraheli lüüs kromatiini immunosadestamise analüüsiks

Kromatiini immunosadestamine viidi läbi Menet’ kirjeldatud meetodi järgi väikeste muudatustega. Ligikaudu 20 mg munasarju 0–1 päeva vanustelt metsiktüüpi emastelt homogeniseeriti 1 mL NEB puhvris (10 mM HEPES-Na pH 8,0 juures, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na pH 8 juures, 0,5 mM EDTA-Na pH 8 juures, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidiin, 0,15 mM spermiin, 1× EDTA-vabad Complete proteaasi inhibiitorid) homogenisaatori / sukeldatava dispergaatoriga 1 min (kiirusel 3000 rpm). Homogenaat viidi eelnevalt jahutatud klaasist dounce’i homogenisaatorisse ja rakendati 15 täistõmmet tiheda uhmrinuiaga. Vabad tuumad tsentrifuugiti seejärel kiirusel 6000xg 10 min jooksul temperatuuril 4°C. Tuumi sisaldavad sademed suspendeeriti uuesti 1 mL-s NEB-i ning tsentrifuugiti kiirusel 20 000 × g 20 min sahharoosi gradiendil (0,65 mL 1,6 M sahharoosi NEB-is, 0,35 mL 0,8 M sahharoosi NEB-is). Sade suspendeeriti uuesti 1 mL-s NEB-is ja formaldehüüdis lõppkontsentratsioonini 1%. Tuumi ristsidustati 10 min toatemperatuuril ja reaktsioon peatati 1/10 mahu 1,375 M glütsiini lisamisega. Tuumad koguti tsentrifuugimisega kiirusel 6000 × g 5 min. Tuumi pesti kaks korda 1 mL-s NEB-is ja suspendeeriti uuesti 1 mL-s lüüsipuhvris (15 mM HEPES-Na pH 7,6 juures, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pH 8 juures, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na-deoksükolaat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroüülsarkosiin ja 1× EDTA-vabad Complete proteaasi inhibiitorid). Tuumi töödeldi ultraheliga, kasutades Hielscher Ultrasonic Processorit UP100H (100 W, 30 kHz) kuus korda 20 s ja 1 min jääl. Ultraheliga töödeldud tuumad tsentrifuugiti kiirusel 13 000 × g 4 min jooksul temperatuuril 4°C. Suurem osa ultraheliga töödeldud kromatiinist oli pikkusega 500 kuni 1000 aluspaari (bp). Iga immunosadestamise jaoks inkubeeriti 15 μg kromatiini 10 μg HP1 9A9 monoklonaalse antikeha juuresolekul (3 h temperatuuril 4°C pöörlevas rattas). Seejärel lisati 50 μl dynabeads’i valku G ja inkubeerimist jätkati üleöö temperatuuril 4°C. Supernatandid visati ära ja proovid pesti kaks korda lüüsipuhvris (iga pesu 15 min temperatuuril 4 °C) ning kaks korda TE puhvris (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pH 8 juures). Kromatiin elueeriti helmestelt kahes etapis; esmalt 100 μl elueerimispuhvris 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pH 8 juures) temperatuuril 65°C 15 min jooksul, millele järgnesid tsentrifuugimine ja supernatandi kogumine. Helmeste materjal ekstraheeriti uuesti 100 μl-s TE + 0,67% SDS. Ühendatud eluaat (200 μl) inkubeeriti üleöö temperatuuril 65°C ristsidemete lahutamiseks ning töödeldi 50 μg/ml RNaasiga A 15 min jooksul temperatuuril 65°C ja 500 μg/ml proteinaas K-ga 3 h jooksul temperatuuril 65°C. Proovidest ekstraheeriti fenool–kloroformiga ja sadestati etanooliga. DNA suspendeeriti uuesti 25 μl vees. Immunosadestatud DNA molekulaaranalüüside maksimeerimiseks amplifitseeriti kandidaatgeene paaridena optimeeritud dupleks-PCR protokolli abil, kasutades ühes reaktsioonis kahte erinevat praimerikomplekti, millel on sarnased sulamistemperatuurid.
(Casale et al. 2019)

Suure jõudlusega ultraheli rakulõhkujad bioloogiliste proovide jaoks

Hielscher Ultrasonics on teie pikaajalise kogemusega partner, kui vajate suure jõudlusega sonikaatoreid rakkude lõhkumiseks (desintegreerimiseks), lüüsimiseks, valkude ekstraheerimiseks, DNA, RNA ja kromatiini fragmenteerimiseks ning muudeks analüüsieelseteks proovide ettevalmistamise etappideks. Hielscher pakub laia valikut ultraheli laborihomogenisaatoreid ja proovide ettevalmistamise seadmeid ning omab seega teie bioloogilise rakenduse ja nõuete jaoks ideaalset ultraheliseadet.
Klassikaline sondtüüpi sonikaator mikrootsikuga, näiteks UP200St (200 W; vt pilti vasakul) või üks ultraheli proovide ettevalmistamise seadmetest VialTweeter või UP200ST_TD_CupHorn koos VialHolderiga on teadus- ja analüüsilaborites eelistatud mudelid. Klassikaline ultrahelisond sobib ideaalselt, kui lüüsida, ekstraheerida või fragmenteerida tuleb vähem proove. Proovide ettevalmistamise seadmed VialTweeter ja UP200St_TD_CupHorn võimaldavad samaaegselt sonikeerida vastavalt kuni 10 või 5 katseklaasi.
Kui töödelda tuleb suurt hulka proove (nt 96-kaevulised plaadid, mikrotiiterplaadid jne), on ideaalne sonikeerimisseadistus UIP400MTP. UIP400MTP toimib nagu suurem cuphorn, mis on täidetud veega ja millel on piisavalt ruumi mikrokaevudega plaatide paigutamiseks. 400-vatise võimsa ultraheliprotsessori toel tagab UIP400MTP mitmekaevuliste plaatide väga ühtlase ja intensiivse sonikeerimise rakkude lõhkumiseks, proovide lüüsimiseks, sademete lahustamiseks, valkude ekstraheerimiseks või DNA nihkejõududega fragmenteerimiseks.

Täpne juhtimine nutika tarkvara abil

Kõik Hielscher’i sonikeerimislahendused alates 200 vatist on varustatud digitaalse värvilise puuteekraani ja intelligentse tarkvaraga. Nutika andmete protokollimise kaudu salvestatakse kõik ultraheli protsessiparameetrid automaatselt CSV-failina sisseehitatud SD-kaardile niipea, kui sonikaator käivitatakse. See muudab uurimistöö ja protokollimise palju mugavamaks. Pärast sonikeerimiskatseid või proovide ettevalmistamist saate iga sonikeerimistsükli parameetreid lihtsalt üle vaadata ja neid omavahel võrrelda.
Intuitiivse menüü kaudu saab enne sonikeerimist eelseadistada arvukaid parameetreid: näiteks proovi temperatuuri kontrollimiseks ja selle termilise lagunemise vältimiseks saab määrata proovi temperatuuri ülempiiri. Ultraheliseadmega kaasas olev ühendatav temperatuurisensor annab ultraheliprotsessorile tagasisidet tegeliku sonikeerimistemperatuuri kohta. Kui temperatuuri ülempiir on saavutatud, teeb ultraheliseade pausi, kuni jõutakse seatud ∆T alampiirini, ning alustab seejärel automaatselt uuesti sonikeerimist.
Kui on vaja sonikeerimist kindla energiasisendiga, saate eelseadistada sonikeerimistsükli ultraheli lõppenergia. Loomulikult saab eraldi seadistada ka ultraheli pulseerimist ja tsüklirežiimi.
Oma kõige edukamate sonikeerimisparameetrite taaskasutamiseks saate salvestada erinevaid sonikeerimisrežiime (nt sonikeerimisaeg, intensiivsus, tsüklirežiim jne) eelseadistatud režiimidena, nii et neid saab lihtsalt ja kiiresti uuesti käivitada.
Suurema kasutusmugavuse huvides saab kõiki digitaalseid ultraheliseadmeid juhtida brauseri kaugjuhtimise kaudu mis tahes levinud brauseris (nt InternetExplorer, Safari, Chrome jne). LAN-ühendus on lihtne plug-n-play seadistus ega vaja täiendava tarkvara installimist.
Meie Hielscher’is teame, et bioloogiliste proovide edukas sonikeerimine nõuab täpsust ja korratavust. Seetõttu oleme oma sonikaatorid kavandanud nutiseadmetena, millel on kõik funktsioonid, mis võimaldavad tõhusat, usaldusväärset, reprodutseeritavat ja mugavat proovide ettevalmistamist.

Allolev tabel annab ülevaate meie ultraheli süsteemide ligikaudsest töötlusvõimsusest ultraheli mikrootsikutest ja klassikalistest ultraheli homogenisaatoritest kuni MultiSample sonikaatoriteni arvukate proovide mugavaks ja usaldusväärseks ettevalmistamiseks: