Ultraheli proovi ettevalmistamine ELISA testide jaoks
Selliseid analüüse nagu ELISA kasutatakse laialdaselt in vitro diagnostikas, haigusega seotud valkude avastamiseks ja kvaliteedikontrolliks (nt toiduallergeenide jälgimiseks). Ultraheli proovide ettevalmistamine on kiire, usaldusväärne ja reprodutseeritav tehnika rakusiseste valkude, DNA, RNA ja organellide lüüsimiseks ja isoleerimiseks. Hielscher Ultrasonics pakub erinevaid ultraheli lahendusi üksikute proovide, mitme viaali, samuti mikrotiiterplaatide ja 96-süvendi plaatide mugavaks ettevalmistamiseks.
ELISA – Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs
ELISA tähistab ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi ja on laialdaselt kasutatav biokeemilise analüüsi meetod ligandit siduvate testide kategoorias. ELISA-proovis lisatakse vedel proov statsionaarsele tahkele faasile, millel on erilised sidumisomadused. Tavaliselt kantakse statsionaarne tahke faas kattekihina süvendiplaadile või ELISA plaadile. Seejärel lisatakse järjestikku erinevaid vedelaid reaktiive, inkubeeritakse ja pestakse, nii et lõpuks toimub süvendis olevas lõplikus vedelikus optiline muutus (nt värvi areng ensümaatilise reaktsiooni produkti abil). Optiline muutus võimaldab mõõta analüüdi kogust nn kvantitatiivselt “lugemine". Kvantitatiivse lugemise jaoks kasutatakse edastatud valguse intensiivsuse tuvastamiseks ja mõõtmiseks spektrofotomeetrit, fluoromeetrit või luminomeetrit. Avastamise tundlikkust mõjutab signaali võimendamine analüütiliste reaktsioonide ajal. Kuna ensüümreaktsioonid on hästi uuritud ja usaldusväärsed võimendusprotsessid, kasutatakse signaali loomiseks ensüüme. Ensüümid on seotud detekteerivate reaktiividega kindlaksmääratud proportsioonides, et võimaldada täpset kvantifitseerimist, mis selgitab ka nimetust "ensüümiga seotud" immunosorbentanalüüs.
Kuna ELISA teste tehakse mikrotiiterplaatidel / 96-augulistel plaatidel, on see tuntud kui plaadipõhine analüüsitehnika ja seda kasutatakse nt kliinilises in vitro diagnostikas, teadusuuringutes, ravimiarenduses jne antikehade, peptiidide, valkude ja hormoonide tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks.
ELISA tehnikat kasutatakse sageli diagnostikavahendina meditsiinis, biotehnoloogias, taimepatoloogias ja see on ka oluline kvaliteedikontrolli mõõtmine mitmes tööstusharus.
Ultraheli proovi ettevalmistusüksus VialTweeter mida kasutatakse rakkude lüüsiks ja valkude ekstraheerimiseks enne ELISA-analüüse
Ultraheli proovi ettevalmistamine enne ELISA-d
Enne ELISA-testi läbiviimist vajavad proovid selliseid ettevalmistusetappe nagu rakkude lüüs ja rakusiseste valkude, DNA, RNA jne ekstraheerimine. Ultraheli rakkude lüüsi ja valgu eraldamise eeliseks on selle kõrge efektiivsus, usaldusväärsus ja reprodutseeritavus. Kõik need tegurid on olulised kvaliteetse diagnostika ja uurimistulemuste saamiseks
- Homogeenne proovitöötlus
- Täielik lüüs
- Täielik valgu ekstraheerimine (nt antikehad, DNA)
- Optimaalne kohanemine rakutüübiga
- Mis tahes valimi suuruse puhul
- reprodutseeritav
- reguleeritava temperatuuriga
- Automaatne andmete protokollimine SD-kaardil
Pre-ELISA ultraheli rakkude lüüsi protokoll
- rakukultuuride puhul: Enne ultraheli rakkude lüüsi tsentrifuugige rakke 5 minutit 270 x g juures mikrotsentrifuugis. Supernatant eemaldatakse aspiratsiooni teel ja resuspendeeritakse rakud 30–100 μL RIPA puhvris. Seejärel inkubeerige rakupelletit jääl 30 minutit.
- Nüüd on rakuproov ultraheli lüüsiks valmis:
Kasutage sondi tüüpi ultrasonikaatorit (nt. UP200Ht koos S26d2 sondiga) või ultraheli mitme prooviga seade (nt VialTweeter kuni 10 viaali samaaegseks ultrahelitöötluseks või mikrotiiterplaatide / 96-süvendi plaatide UIP400MPT) sõltuvalt valmistatavate proovide kogusest.
Ühe proovi sondi tüüpi ultrahelitöötluseks asetage rakud 1,5 ml mikrotsentrifuugitorudesse. - Eelseadistage ultraheli kestus, koguenergia sisend, tsükli režiim ja / või temperatuuri piirid ultrasonikaatori digitaalses menüüs. See tagab väga usaldusväärse ultrahelitöötluse ja korratavuse.
- Seadke sonotrode sisse ja lülitage ultraheli seade sisse. Liigutage ultraheli sondi mikro-otsa õrnalt läbi proovi, et proovi ühtlaselt sonikeerida.
Enamiku rakkude puhul viiakse ultraheli lüüs lõpule pärast 2-4 tsüklit 10 sek ultrahelitöötlust. - Pärast ultrahelitöötlust eemaldage sonotrode proovist. Proove tuleks inkubeerida jääl 5 minutit. Seejärel tsentrifuugitakse 10 000 x g juures 20 minutit, et praht granuleerida. Supernatandid viiakse uude mikrotsentrifuugiküvetti. Analüüdid märgistatakse ja säilitatakse -20 °C juures.
- Ultraheli sonotrode saab puhastada, pühkides seda korralikult alkoholi või sonikaadiga alkoholiga täidetud keeduklaasis, nt 70% etanool. Kõik titaanist valmistatud ultraheli sondid on autoklaavitavad.
Valgu ekstraheerimine E.coli rakkudest ultraheli sond UP200St
- Loputage kudet jääkülma fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega (0,01M, pH=7,4), et eemaldada põhjalikult liigne hemolüüsiveri.
- Kude (neerud, süda, kops, põrn jne) kaalutakse ja leotatakse väikesteks tükkideks, mis homogeniseeritakse fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses. Vajaliku fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuse maht on seotud koe massiga. Rusikareeglina vajab 1g kude umbes 9mL fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahust. PBS-ile on soovitatav lisada mõni proteaasi inhibiitor. (Alternatiivina võib kasutada RIPA või hüpotoonilist lüüsipuhvrit, mis sisaldab proteaasi ja fosfataasi inhibiitorikokteili.)
- Sõltuvalt koe suurusest võib koe eeltöötlemisel abiks olla lühike pöörisravi (u 1-2 min. 15 sek. impulsside jooksul).
- Paigaldage oma ultrasonikaatorile mikroots, nt S26d2. Katseklaas asetatakse koos koega jäävanni.
- Sonikeerige proovi oma ultrasonikaatoriga, nt UP200St (80% amplituud) 1 min pulsirežiimis (15sec sisse, 15sec paus). Proovi hoitakse jäävannis.
- Seejärel homogenaadid tsentrifuugitakse, et saada spetsiifilisi segusid (tsütosoolsed, tuuma-, mitokondriaalsed või lüsosomaalsed), et rikastada analüüsitavat valku. Proovi tsentrifuugitakse 5 minutit 5000×g juures ja otsitakse välja supernatant.
Sonotrode MTP-24-8-96-l on kaheksa ultraheli sondi mikrotiiterplaatide kaevude ultraheliga töötlemiseks.
Usaldusväärne temperatuuri reguleerimine ultrahelitöötluse ajal
Temperatuur on oluline protsessi mõjutav tegur, mis on eriti oluline bioloogiliste proovide töötlemisel, nt valkude termilise lagunemise vältimiseks. Nagu kõik mehaanilised proovide ettevalmistamise tehnikad, tekitab ultrahelitöötlus soojust. Kuid proovide temperatuuri saab Hielscher Ultrasonics seadmete kasutamisel hästi kontrollida. Tutvustame teile erinevaid võimalusi oma proovide temperatuuri jälgimiseks ja kontrollimiseks, valmistades neid ette sondi tüüpi ultrasonikaatori või VialTweeteriga eelanalüütiliselt.
- Proovi temperatuuri jälgimine: Kõik Hielscheri digitaalsed ultraheli protsessorid on varustatud intelligentse tarkvara ja ühendatava temperatuurianduriga. Ühendage temperatuuriandur ultraheliseadmega (nt UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Mitme kaevuga plaadi sonikaatori UIP400MTP) ja asetatakse temperatuurianduri ots ühte katseklaasi. Digitaalse värvilise puutetundliku ekraani abil saate ultraheli protsessori menüüs seada oma proovi ultrahelitöötluse jaoks konkreetse temperatuurivahemiku. Ultrasonikaator peatub automaatselt, kui maksimaalne temperatuur on saavutatud, ja peatub, kuni proovi temperatuur on seatud temperatuuri ∆ madalama väärtuseni. Seejärel algab ultrahelitöötlus automaatselt uuesti. See nutikas funktsioon hoiab ära kuumusest põhjustatud lagunemise.
- Mis puudutab ultraheli mitme prooviga üksust VialTweeter, võib titaanplokki, mis hoiab katseklaase, eelnevalt jahutada. Pange VialTweeteri plokk (ainult sonotrode ilma andurita!) külmkappi või sügavkülma, et titaanplokk eeljahutada, aitab proovi temperatuuri tõusu edasi lükata. Võimaluse korral saab proovi ka ise eeljahutada.
- Kasutage ultrahelitöötluse ajal jahutamiseks jäävanni või kuiva jääd. Asetage prooviklaas (id) ultrahelitöötluse ajal jäävanni. VialTweeteri jaoks kasutage madalat salve, mis on täidetud kuiva jääga, ja asetage VialTweeter kuivale jääle, et kuumus saaks kiiresti hajuda.
Kliendid kogu maailmas kasutavad Hielscheri sondi tüüpi ultrasonikaatoreid, samuti mitme prooviga ultrahelitöötlusseadmeid VialTweeter ja UIP400MTP nende igapäevaseks proovide ettevalmistamiseks bioloogilistes, biokeemilistes, meditsiinilistes ja kliinilistes laborites. Hielscheri protsessorite intelligentne tarkvara ja temperatuuri reguleerimine, temperatuuri kontrollitakse usaldusväärselt ja välditakse kuumusest põhjustatud proovi lagunemist. Ultraheli proovide ettevalmistamine Hielscheri ultraheli lahendustega annab väga usaldusväärseid ja reprodutseeritavaid tulemusi!
Lisateavet suure läbilaskevõimega ultrahelitöötluse kohta, kasutades testide jaoks mitme kaevuga plaadi sonikaatori UIP400MTP!
Võta meiega ühendust! / Küsi meilt!
Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid rakenduste segamiseks, hajutamiseks, emulgeerimiseks ja ekstraheerimiseks laboris, piloot- ja tööstuslikus mastaabis.
Kirjandus / Viited
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Faktid, mida tasub teada
Mis tüüpi ELISA on olemas?
ELISA on mitut tüüpi, mida iseloomustab nende toimimispõhimõte. Neid tuntakse kui otsest ELISA-d, kaudset ELISA-d, võileiva-ELISA-d, konkurentsivõimelist ELISA-d ja vastupidist ELISA-d. Allpool esitame teile ülevaate erinevatest ELISA tüüpidest ning nende peamistest omadustest ja erinevustest.
ELISA-testi võib teha kvalitatiivselt või kvantitatiivselt. Kvalitatiivsed tulemused annavad lihtsa positiivse või negatiivse tulemuse, samas kui kvantitatiivse ELISA-testi puhul võrreldakse proovi optilist tihedust standardkõveraga, mis on tavaliselt sihtmolekuli teadaoleva kontsentratsiooniga lahuse jadalahjendus.
Otsene ELISA
Otsene ELISA on ELISA kõige lihtsam analüüsivorm, kus kasutatakse ainult ensüümiga märgistatud primaarset antikeha ja sekundaarseid antikehi ei vajata. Ensüümiga märgistatud primaarne antikeha seondub otse sihtmärgiga, st antigeeniga. Puhverdatud antigeeni lahus lisatakse mikrotiiterplaadi igasse auku (tavaliselt 96 auguga plaadid, ELISA-plaadid), kus see kleepub laengu vastastikmõjude kaudu plastpinnale. Kui primaarse antikehaga seotud ensüüm reageerib oma substraadiga, tekitab see nähtava signaali, mida saab mõõta spektrofotomeetri, fluoromeetri või luminomeetri abil.
Kaudne ELISA
Kaudse ELISA-testi jaoks on vaja nii primaarset antikeha kui ka sekundaarset antikeha. Kuid vastupidiselt otsesele ELISA-le ei ole primaarne antikeha, vaid sekundaarne antikeha märgistatud ensüümiga. Antigeen immobiliseeritakse süvendiplaadile ja seotakse primaarse antikehaga. Seejärel seondub ensüümiga märgistatud sekundaarne antikeha primaarse antikehaga. Lõpuks reageerib sekundaarse antikehaga seotud ensüüm oma substraadiga, et tekitada nähtav signaal, mida saab tuvastada.
Võileib ELISA
Kui otsestes ja kaudsetes ELISA testides immobiliseeritakse antigeen ja kaetakse kaevuplaadi pinnaga, siis võileiva ELISA-s immobiliseeritakse antikeha ELISA-plaadi plastpinnale. Sandwich ELISA immobiliseeritud antikehi tuntakse kui püüdmise antikehi. Lisaks püüdmise antikehadele on võileiva ELISA-s vaja ka nn detekteerivaid antikehi. Detekteerivate antikehade hulka kuuluvad märgistamata primaarne detekteeriv antikeha ja ensüümiga märgistatud sekundaarne detekteeriv antikeha.
Samm-sammult seondub huvipakkuv antigeen plaadile immobiliseeritud haaramisantikehaga. Seejärel seondub esmane tuvastav antikeha antigeeniga. Seejärel seondub sekundaarne detekteeriv antikeha esmase detekteeriva antikehaga. Viimases reaktsioonietapis reageerib ensüüm oma substraadiga, et tekitada nähtav signaal, mida saab optiliselt tuvastada.
Konkurentsivõimeline ELISA
Konkurentsivõimeline ELISA, tuntud ka kui inhibeerimine ELISA, on kõige keerulisem ELISA tüüp, kuna see hõlmab inhibiitori antigeeni kasutamist. Kõiki kolme formaati, otsest, kaudset ja võistlevat ELISA-vormingut, saab kohandada konkurentsivõimelise ELISA-vorminguga. Konkureerivas ELISA-s konkureerivad inhibiitori antigeen ja huvipakkuv antigeen seondumisel primaarse antikehaga.
Konkureeriva ELISA puhul inkubeeritakse märgistamata antikeha selle antigeeni, st proovi juuresolekul. Need seotud antikehade/antigeenikompleksid lisatakse seejärel antigeeniga kaetud auku.
Plaat pestakse nii, et eemaldatakse sidumata antikehad. Konkurentsivõimeline ELISA on oma nime saanud tänu sellele, et mida rohkem antigeeni on proovis, seda rohkem moodustuvad antigeeni-antikeha kompleksid. See tähendab, et augus oleva antigeeniga seondumiseks on vähem sidumata antikehi ja antigeenid peavad olemasoleva antikeha pärast konkureerima. Lisatakse sekundaarne antikeha, mis vastab primaarsele antikehale. See teine antikeha on seotud ensüümiga. Substraadi lisamisel tekitavad ülejäänud ensüümid kromogeense või fluorestseeruva signaali.
Sel hetkel peatatakse reaktsioon, et vältida signaali lõplikku küllastumist.
Mõned konkureerivad ELISA komplektid sisaldavad ensüümiga seotud antikeha asemel ensüümiga seotud antigeeni. Märgistatud antigeen konkureerib primaarsete antikehade sidumiskohtade osas proovi antigeeniga (märgistamata). Mida vähem antigeeni proovis on, seda rohkem märgistatud antigeeni jääb auku ja seda tugevam on signaal.
Vastupidine ELISA
Pöörd-ELISA-test ei kasuta hästi plaate, kuid jätab antigeenid katsevedelikku suspendeerima. Pöörd-ELISA-test mõõdab seotud antikehade kogust antigeeni kaudu. See töötati välja spetsiaalselt Lääne-Niiluse viiruse ümbrisvalgu tuvastamiseks ja uurimiseks ning selle kohta, kuidas see suudab leida viirusespetsiifilisi antikehi.
Milliseid ensümaatilisi markereid kasutatakse ELISA jaoks?
Allolevas loetelus on esitatud kõige levinumad ELISA-testides kasutatavad ensümaatilised markerid, mis võimaldavad pärast analüüsi lõpetamist mõõta analüüsi tulemusi.
- OPD (o-fenüleendiamiindivesinikkloriid) muutub merevaigukollaseks, et tuvastada HRP (mädarõika peroksidaas), mida sageli kasutatakse konjugeeritud valguna.
- TMB (3,3′,5,5′-tetrametüülbensidiin) muutub HRP tuvastamisel siniseks ja muutub kollaseks pärast väävelhappe või fosforhappe lisamist.
- ABTS (2,2′-Asinobid [3-etüülbensotiasoliin-6-sulfoonhape]-diammooniumsool) muutuvad HRP määramisel roheliseks.
- PNPP (p-nitrofenüülfosfaat, dinaatriumsool) muutub leeliselise fosfataasi avastamisel kollaseks.