Selliseid analüüse nagu ELISA kasutatakse laialdaselt in vitro diagnostikaks, haigusega seotud valkude avastamiseks ja kvaliteedikontrolliks (nt toidu allergeenide jälgimine). Ultraheli proovi ettevalmistamine on kiire, usaldusväärne ja reprodutseeritav meetod rakkude lonkamiseks ja rakusiseste valkude, DNA, RNA ja organellide isoleerimiseks. Hielscher Ultrasonics pakub erinevaid ultraheli lahendusi üksikproovide, mitme viaali, samuti mikrotiiterplaatide ja 96-kaevuplaatide mugavaks ettevalmistamiseks.

Elisa – Ensüümiga seotud immunosorbenttest

ELISA tähistab ensüümiga seotud immunosorbenttesti ja on ligandi siduvate analüüside kategooria laialdaselt kasutatav biokeemiline analüüsimeetod. ELISA-s lisatakse vedel proov statsionaarsele tahkele faasile, millel on erilised siduvad omadused. Tavaliselt kantakse statsionaarne tahke faas kausplaadile või ELISA plaadile kattekihina. Seejärel lisatakse järjestikku erinevaid vedelaid reaktiive, inkubeeritakse ja pestakse, nii et lõpuks toimub kaevu lõplikus vedelikus optiline muutus (nt värviarendus ensümaatilise reaktsiooni abil). Optiline muudatus võimaldab mõõta analüüdi kogust niinimetatud kvantitatiivse “lugemine". Kvantitatiivsenäidu puhul kasutatakse läbiva valguse intensiivsuse avastamiseks ja mõõtmiseks spektrofotomeetrit, fluoromeetrit või valgusmõõturit. Tundlikkus avastamise mõjutab võimendamine signaali ajal analüütilised reaktsioonid. Kuna ensüümireaktsioone uuritakse hästi ja usaldusväärseid amplifikatsiooniprotsesse, kasutatakse signaali loomiseks ensüüme. Ensüümid on seotud tuvastamisreaktiividega kindlaksmääratud proportsioonides, et võimaldada täpset kvantifitseerimist, mis selgitab ka nimetust "ensüümiga seotud" immunosorbenttest.
Kuna ELISA-analüüse tehakse mikrotiiterplaatidega / 96-hästi plaadid, on seda tuntud plaadipõhise analüüsi tehnikat ja seda kasutatakse näiteks kliinilisein vitro diagnostika, teadusuuringute, ravimite arendamise jne avastamiseks ja kvantifitseerimiseks antikehade, peptiidide, valkude ja hormoonide avastamiseks ja kvantifitseerimiseks.
ELISA tehnikat kasutatakse sageli meditsiinis, biotehnoloogias, taimepatoloogias diagnostikavahendina ning see on ka oluline kvaliteedikontrolli mõõtmine mitmes tööstusharus.

Ultraheli proovi ettevalmistus enne ELISA-d

Enne ELISA-analüüsi tegemist vajavad proovid sellise rakulüüsi ettevalmistamise ja rakusiseste valkude, DNA, RNA jne ekstraheerimise samme. Ultraheli rakkude lüüsi ja valgu isolatsiooni eeliseks on selle kõrge efektiivsus, usaldusväärsus ja reprodutseeritavus. Kõik need tegurid on olulised, et saada kvaliteetseid diagnostika- ja uurimistulemusi

ELISA-eelse ultraheli rakulüüsi protokoll

• Rakukultuuride puhul: Enne ultrahelirakkude lüüsi tsentrifuugige rakke 5 minutit 270 x g juures mikrotsentrifuugis. Supernatant eemaldatakse aspiratsiooni teel ja rakud resuspendeeritakse 30...100 μl RIPA puhvris. Seejärel inkubeeritakse rakugraanulid jääl 30 minutit.
• Nüüd on rakuproov ultraheli lüüsiks valmis:
  Kasutage sonditüüpi ultrasonicator (nt Uf200 ः t S26d2 sondiga) või ultraheli mitmeproovilist seadet (nt VialTweeter kuni 10 viaali samaaegseks ultrahelitöötluseks või UIP400MPT mikrotiiterplaatide / 96-kaevuplaatide jaoks) sõltuvalt proovide kogusest, mida peate ette valmistama.
  Ühe proovi sondi tüüpi ultrahelitöötluseks pannakse rakud 1,5 ml mikrotsentrifuugiküvettidesse.
• Eelseadistage oma ultraheli kestus, kogu energia sisend, tsükli režiim ja /või temperatuuri piirangud ultrasonicator digitaalses menüüs. See tagab väga usaldusväärse ultrahelitöötluse ja korratavuse.
• Inset sonotrode ja lülitage ultraheli seade sisse. Liigutage ultraheli sondi mikrootsa ettevaatlikult läbi proovi, et proovi ühtlaselt sonikeerida.
  Enamiku rakkude puhul viiakse ultraheli lüüs lõpule pärast 2 -4 tsüklit 10 sek ultrahelitöötlust.
• Pärast ultrahelitöötlust eemaldatakse sonotrood proovist. Proove tuleks inkubeerida jääl 5 minutit. Seejärel tsentrifuugitakse 20 minutit 10 000 x g juures, et praht granuleeee.a. Transfer supernatants uue mikrotsentrifuugi toru. Analüüdid märgistatakse ja hoitakse temperatuuril -20 °C.
• Ultraheli sonotrode saab puhastada, pühkides seda korralikult alkoholiga või sonikeerides alkoholiga täidetud keeduklaasis, nt 70% etanoolis. Kõik titaanist valmistatud ultraheli sondid on autoklaavitavad.

• Loputage kude jääkülma PBS-iga (0,01M, pH=7.4), et eemaldada hoolikalt liigne hemolüüsiveri.
• Kaalutakse kude (neer, süda, kops, põrn jne) ja leotage see väikesteks tükkideks, mis on homogeniseeritud PBS. Vajalik pbs-i maht on seotud koe kaaluga. Reeglina pöial, 1g kude nõuab umbes 9ml PBS. Soovitatav on lisada mõned proteaasi inhibiitor pbs. (Teise võimalusena võib kasutada proteaasi ja fosfataasi inhibiitori kokteili sisaldavat RIPA- või hüpotoonilist lüüsipuhvrit.)
• Sõltuvalt kudede suurus, lühike keeris ravi (umbes 1-2 min. in 15 sek. kaunviljad) võib olla kasulik eeltöödelda kudede.
• Paigaldage oma ultrasonicator mikro-ots, nt S26d2. Proovitoru asetatakse koega jäävanni.
• Sonikeeritakse proov oma ultrasonicator, nt UP200St (80% amplituud) 1 min. impulsi režiimis (15sec kohta, 15sec paus). Hoidke proovi jäävannis.
• Seejärel tsentrifuugitakse homogenaadid, et saada analüüsimiseks erikoondisi (tsütosooliline, tuuma-, mitokondriaalne või lüsosomaalne). Tsentrifuugides proovi 5 minutit 5000×g juures, leitakse supernatant.

Usaldusväärne temperatuurikontroll ultrahelitöötluse ajal

Temperatuur on oluline protsessi mõjutavat tegurit, mis on eriti oluline bioloogiliste proovide töötlemiseks, nt valkude termilise lagunemise vältimiseks. Nagu kõik mehaanilised proovi ettevalmistamise tehnikad, ultrahelitöötlus loob soojust. Siiski saab proovide temperatuuri Hielscher Ultrasonics seadmete kasutamisel hästi kontrollida. Tutvustame teile erinevaid võimalusi, et jälgida ja kontrollida oma proovide temperatuuri, valmistades neid sondi-tüüpi ultrasonicator või VialTweeter eelnevalt analüütiliselt.

1. Proovi temperatuuri jälgimine: Kõik Hielscheri digitaalsed ultraheli protsessorid on varustatud intelligentse tarkvara ja ühendatava temperatuurianduriga. Ühendage temperatuuriandur ultraheliseadmega (nt Uf200 ः t, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) ja sisestage temperatuurianduri ots ühte proovitorusse. Digitaalse värvilise puuteekraani abil saate ultraheli protsessori menüüs määrata oma proovi ultrahelitöötluse jaoks konkreetse temperatuurivahemiku. Ultraheliseade peatub automaatselt, kui maksimaalne temperatuur on saavutatud, ja peatub, kuni proovi temperatuur on määratud temperatuuri alumise väärtuseni ∆. Seejärel algab ultrahelitöötlus automaatselt uuesti. See nutikas funktsioon takistab kuumusest tingitud lagunemist.
2. Seoses ultraheli mitme proovi seade VialTweeter, titaan plokk, mis hoiab proovi torud, saab eelnevalt jahtuda. Pane VialTweeter plokk (ainult sonotrode ilma anduri!) külmkappi või sügavkülma eelnevalt jahtuda titaaniplokk aitab edasi lükata temperatuuri tõusu proovis. Võimaluse korral võib proovi ise ka eeljahutada.
3. Ultrahelitöötluse ajal jahtumiseks kasutage jäävanni või kuiva jääd. Asetage proovitoru(d) ultrahelitöötluse ajal jäävanni. VialTweeteri jaoks kasutage kuiva jääga täidetud madalat alust ja asetage VialTweeter kuivale jääle, et kuumus saaks kiiresti hajutada.

Kliendid kogu maailmas kasutavad Hielscheri sondi-ultrasonicators samuti mitme proovi ultrahelitöötlus üksused VialTweeter ja UIP400MTP oma igapäevast proovi ettevalmistamise töö bioloogilistes, biokeemilistes, meditsiinilistes ja kliinilistes laborites. Hielscheri protsessorite intelligentne tarkvara ja temperatuuri kontroll, temperatuur on usaldusväärselt kontrollitud ja kuumusest tingitud proovi lagunemine välditud. Ultraheli proovi ettevalmistamine Hielscheri ultraheli lahustega annab väga usaldusväärseid ja reprodutseeritavaid tulemusi!