Ultraheli proovide ettevalmistus ELISA analüüsideks

Analüüsid, näiteks ELISA, on laialdaselt kasutusel in vitro diagnostikas, haigusega seotud valkude tuvastamisel ja kvaliteedikontrollis (nt toidu allergeenide jälgimisel). Ultraheli proovide ettevalmistus on kiire, usaldusväärne ja korratav meetod rakkude lüüsimiseks ning rakusiseste valkude, DNA, RNA ja organellide eraldamiseks. Hielscher Ultrasonics pakub mitmesuguseid ultraheli lahendusi üksikproovide, mitme viaali ning mikrotiiterplaatide ja 96-süvendiliste plaatide mugavaks ettevalmistamiseks.

ELISA – ensüümseotud immunosorbentanalüüs

ELISA tähendab ensüümseotud immunosorbentanalüüsi (enzyme-linked immunosorbent assay) ning on laialdaselt kasutatav biokeemiline analüüsimeetod, mis kuulub ligandi sidumisanalüüside kategooriasse. ELISA-s lisatakse vedel proov statsionaarsele tahkele faasile, millel on erilised sidumisomadused. Tavaliselt kantakse statsionaarne tahke faas kattena süvenditega plaadile ehk ELISA plaadile. Seejärel lisatakse järjestikku mitmesuguseid vedelaid reagente, inkubeeritakse ja pestakse, nii et süvendis oleva lõppvedeliku optiline omadus lõpuks muutub (nt värvuse teke ensümaatilise reaktsiooni produkti toimel). Optiline muutus võimaldab analüüdi kogust mõõta niinimetatud kvantitatiivse „lugemisega“. Kvantitatiivseks lugemiseks kasutatakse spektrofotomeetrit, fluoromeetrit või luminomeetrit, et tuvastada ja mõõta läbiva valguse intensiivsust. Tuvastamise tundlikkust mõjutab signaali võimendamine analüütiliste reaktsioonide käigus. Kuna ensüümreaktsioonid on hästi uuritud ja usaldusväärsed võimendusprotsessid, kasutatakse signaali tekitamiseks ensüüme. Ensüümid on seotud tuvastusreagentidega kindlates vahekordades, et võimaldada täpset kvantifitseerimist, mis selgitab ka nime „ensüümseotud“ immunosorbentanalüüs.
Kuna ELISA analüüse tehakse mikrotiiterplaatidel / 96-süvendilistel plaatidel, tuntakse seda plaadipõhise analüüsimeetodina ning seda kasutatakse nt kliinilises in vitro diagnostikas, teadustöös, ravimiarenduses jne antikehade, peptiidide, valkude ja hormoonide tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks.
ELISA meetodit kasutatakse sageli diagnostikavahendina meditsiinis, biotehnoloogias ja taimepatoloogias ning see on ka oluline kvaliteedikontrolli mõõtmine paljudes tööstusharudes.

Ultraheli proovide ettevalmistus enne ELISA-t

Enne ELISA analüüsi tegemist vajavad proovid ettevalmistusetappe, nagu rakkude lüüs ning rakusiseste valkude, DNA, RNA jms ekstraheerimine. Ultraheli abil rakkude lüüsimise ja valkude isoleerimise eelis on selle kõrge efektiivsus, usaldusväärsus ja korratavus. Kõik need tegurid on olulised kvaliteetsete diagnostika- ja uurimistulemuste saamiseks

Protokoll ultraheli rakulüüsiks enne ELISA-t

• Rakukultuuride puhul: Enne rakkude ultraheli lüüsi tsentrifuugige rakke 5 min 270 x g juures mikrotsentrifuugis. Eemaldage supernatant aspireerimise teel ja suspendeerige rakud uuesti 30 – 100 μL RIPA puhvris. Seejärel inkubeerige rakupelletit jääl 30 min.
• Nüüd on rakuproov ultraheli lüüsiks valmis:
  Kasutage sondtüüpi ultrahelisonikaatorit (nt UP200Ht S26d2 sondiga) või ultraheli mitme proovi seadet (nt VialTweeter kuni 10 viaali samaaegseks sonikeerimiseks või UIP400MPT mikrotiiterplaatide / 96-süvendiliste plaatide jaoks), olenevalt ettevalmistatavate proovide hulgast.
  Üksiku proovi sondtüüpi sonikeerimiseks asetage rakud 1,5 mL mikrotsentrifuugitorudesse.
• Seadistage ultrahelisonikaatori digitaalmenüüs ette ultraheli kestus, kogu energiasisend, tsüklirežiim ja/või temperatuuripiirangud. See tagab väga usaldusväärse sonikeerimise ja korratavuse.
• Sisestage sonotrood ja lülitage ultraheliseade sisse. Liigutage ultrahelisondi mikrotippu õrnalt läbi proovi, et proovi ühtlaselt sonikeerida.
  Enamiku rakkude puhul on ultraheli lüüs lõpule viidud pärast 2–4 tsüklit 10 sekundit kestvat sonikeerimist.
• Eemaldage pärast sonikeerimist sonotrood proovist. Proove tuleks inkubeerida jääl 5 minutit. Seejärel tsentrifuugige 10 000 x g juures 20 minutit, et praht sadestada. Kandke supernatandid uude mikrotsentrifuugitorusse. Märgistage analüüdid ja hoidke temperatuuril -20°C.
• Ultraheli sonotroodi saab puhastada, pühkides seda korralikult alkoholiga, või sonikeerides alkoholiga täidetud keeduklaasis, nt 70% etanoolis. Kõiki titaanist valmistatud ultrahelisonde on võimalik autoklaavida.

• Loputage kude jääkülma PBS-iga (0,01M, pH=7,4), et eemaldada põhjalikult liigne hemolüüsitud veri.
• Kaaluge kude (neer, süda, kopsud, põrn jne) ja peenestage see väikesteks tükkideks, mis homogeniseeritakse PBS-is. Vajalik PBS-i kogus sõltub koe massist. Rusikareeglina vajab 1g kudet ligikaudu 9mL PBS-i. PBS-ile on soovitatav lisada veidi proteaasi inhibiitorit. (Alternatiivina võib kasutada RIPA või hüpotoonilist lüüsipuhvrit, mis sisaldab proteaasi ja fosfataasi inhibiitorite segu.)
• Sõltuvalt koe suurusest võib koe eeltöötluseks olla abiks lühike vortex-töötlus (ligikaudu 1–2 min 15-sekundiliste impulssidena).
• Kinnitage ultraheliseadme külge mikrotipp, nt S26d2. Asetage koega proovitoru jäävanni.
• Sonikeerige proovi oma ultraheliseadmega, nt UP200St (80% amplituud), 1 min impulssrežiimis (15 sek sees, 15 sek paus). Hoidke proovi jäävannis.
• Seejärel homogenaadid tsentrifuugitakse, et saada spetsiifilisi fraktsioone (tsütosoolne, tuuma-, mitokondriaalne või lüsosomaalne), et rikastada valku analüüsiks. Proovi 5 minutit 5000×g juures tsentrifuugides saadakse supernatant.

Usaldusväärne temperatuuri reguleerimine sonikeerimise ajal

Temperatuur on protsessi mõjutav oluline tegur, mis on eriti tähtis bioloogiliste proovide töötlemisel, nt valkude termilise lagunemise vältimiseks. Nagu kõik mehaanilised proovide ettevalmistamise tehnikad, tekitab ka sonikeerimine soojust. Hielscher Ultrasonics seadmeid kasutades saab proovide temperatuuri siiski hästi kontrollida. Tutvustame teile erinevaid võimalusi oma proovide temperatuuri jälgimiseks ja reguleerimiseks, kui valmistate neid enne analüüsi ette sondtüüpi ultraheliseadme või seadmega VialTweeter.

1. Proovi temperatuuri jälgimine: kõik Hielscheri digitaalsed ultraheliprotsessorid on varustatud intelligentse tarkvara ja ühendatava temperatuurianduriga. Ühendage temperatuuriandur ultraheliseadmega (nt UP200Ht, UP200St, VialTweeter, mitme süvendiga plaatide sonikaator UIP400MTP) ja sisestage temperatuurianduri ots ühte proovitorudest. Digitaalse värvilise puuteekraani kaudu saate ultraheliprotsessori menüüs seada oma proovi sonikeerimiseks kindla temperatuurivahemiku. Ultraheliseade peatub automaatselt, kui maksimaalne temperatuur on saavutatud, ja jääb pausile, kuni proovi temperatuur langeb seatud temperatuuri ∆ alumise väärtuseni. Seejärel algab sonikeerimine automaatselt uuesti. See nutikas funktsioon hoiab ära kuumusest tingitud lagunemise.
2. Mitme proovi ultraheliseadme VialTweeter puhul saab proovitorusid hoidvat titaanplokki eelnevalt jahutada. Plokki VialTweeter (ainult sonotrood ilma muundurita!) külmikusse või sügavkülmikusse asetades titaanploki eelnevaks jahutamiseks aitab edasi lükata proovi temperatuuri tõusu. Võimaluse korral saab ka proovi ennast eelnevalt jahutada.
3. Kasutage sonikeerimise ajal jahutamiseks jäävanni või kuivjääd. Asetage oma proovianum(ad) sonikeerimise ajaks jäävanni. Seadme VialTweeter puhul kasutage kuivjääga täidetud madalat kandikut ja asetage seade VialTweeter kuivjää peale, et soojus saaks kiiresti hajuda.

Kliendid üle maailma kasutavad Hielscheri sondtüüpi ultrahelitöötlusseadmeid ning mitme proovi samaaegse sonikeerimise seadmeid VialTweeter ja UIP400MTP oma igapäevaseks proovide ettevalmistamiseks bioloogia-, biokeemia-, meditsiini- ja kliinilistes laboratooriumides. Hielscheri protsessorite intelligentse tarkvara ja temperatuuri reguleerimise abil hoitakse temperatuuri usaldusväärselt kontrolli all ning välditakse kuumusest tingitud proovi lagunemist. Ultraheliga proovide ettevalmistamine Hielscheri ultraheli lahendustega annab väga usaldusväärseid ja reprodutseeritavaid tulemusi!
Lugege lähemalt suure läbilaskevõimega sonikeerimisest mitmekaevulise plaadi sonikaatoriga UIP400MTP analüüside jaoks!