Hielscheri ultraheli tehnoloogia

Ultraheli DNA murdepinna

  • DNA ja RNA nihke ajal murtakse DNA molekulid väiksemateks tükkideks. DNA / RNA killustatus on üks olulisematest prooviprotseduuride etappidest, mis on vajalikud järgmise põlvkonna järjestuse (NGS) jaoks raamatukogude loomiseks.
  • Ultraheli DNA lõikamine kasutab akustiliste kavitatsioonide jõudusid DNA või RNA purustamiseks 100 tükkideks – 5kb bp.
  • Ultraheli lõikamine võimaldab täpset DNA fragmentimist ja soovitud DNA pikkusega kohanemist.

Ultraheli DNA murdepinna

Hielscher Ultrasonics pakub erinevaid ultraheli-põhiseid lahendusi DNA, RNA ja kromatiini lõikamiseks. Valige sondi tüüpi ultraheligaator (nt UP100H), et otse ultrahelitöötlus mikrotiipi abil, või kasutage VialTweetrit või ultraheli tassihambaid erinevate näidiste kaudse DNA valmistamiseks üheaegselt. Hielscher pakub teie vajadustele vastavat ideaalse seadet: kui teil on 1 või kuni 10 proovi, siis kogused mikroliiterist kuni liitri mahuni – Hielscheri ultraheli protsessorid on teie nõudmistele vastavuses, et valmistada DNA, RNA ja kromatiini fragmendid õiges pikkuses. Reprodutseeritavus, lihtne kasutamine ja täpne juhtimine võimaldavad usaldusväärset teekonda järgmise põlvkonna järjestamiseks.
Vastupidiselt ensümaatilisele DNA fragmentimisele rakendub ultraheli lõikamine puhtaks mehaanilise nihkejõuga ilma kemikaale lisamata. Protsessi parameetrite täpse seadistusega tekitab ultraheli lõikamine suure molekulmassiga DNA fragmente (plasmiid ja genoomne DNA).
Puhastatud nukleiinhappeid saab amplifitseerida enne või pärast fragmenteerimisetappi.
Sonikatsiooni parameetreid (võimsust, impulsi tsüklit / purse, aega ja temperatuuri) saab tarkvarasätete abil ohutult juhtida.

Eelised:

  • täpne kontroll
  • sonike tsüklid ja aeg, mis on täpselt kohandatav soovitud DNA suurusega
  • suure molekulmassiga DNA fragmendid
  • temperatuuri kontroll
  • Kiire
  • reprodutseeritavad tulemused
  • autoklaavitav
  • mitmesugused lahendused: Probe-tüüpi, VialTweeter ja CupHorn

Ultraheli DNA nihkeprotokollid

Kromatiini immuunsadestamise testi jaoks

Lühidalt, rakud plaaditi 60 mm läbimõõduga nõusse (400 000 tassi kohta) ja transfekteeriti RhoA siRNA-ga (nagu kirjeldatud); 72 tunni pärast inkubeeriti neid DNA-ga ristsiduvate valkude puhul formaldehüüdiga (lõppkontsentratsioon, 1%) 10 minutit temperatuuril 37 ° C. Ristsidumise reaktsioon kustutati, lisades ühe kümnendiku mahuni 1,25 mol / l glütsiini, andes lõppkontsentratsiooniks 125 mmol / l. Rakke pesti kaks korda jääkülma PBS-ga, resuspendeeriti radioimmuunsoojenemise analüüsipuhvris [150 mmol / 1 NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksükolaat, 0,1% SDS, 5 mmol / 1 EDTA, 50 mmol / 1 Tris-HCl (pH 8,0 )], mis sisaldas 1 mmol / 1 fenüülmetüülsulfonüülfluoriidi, 1 Ag / ml aprotiniini ja 1 Ag / ml pepstatiin A-d ja hoiti 30 minutit jääl. Seejärel töödeldi rakulüsaadid jääl koos sonariga Hielscher UP200S ultraheliga sonicator (3 x 40 s, amplituud 40%, tsükkel 1, Hielscher Ultrasonics GmbH), kuni ristseotud kromatiinid lõigati, et saada DNA fragmendid vahemikus 200 kuni 1000 bp. Erinevates proovides oleva DNA koguse kvantiteedi määramisel kasutati kümnendikku kogu lüsaati ja loeti seda “kogu sisend DNA”. Supernatante inkubeeriti lõhe sperma DNA / valgu agaroos-50% suspensiooniga, et vähendada mittespetsiifilist tausta. Seejärel viidi immuunsadestamine üleöö temperatuuril 4 ° C 5 Ng-vastase anti-NF-nB p65 (Upstate) või ilma antikehaga (negatiivne kontroll). Neid supernatante täiendati 5 mol / 1 NaCl-ga ja kuumutati üleöö temperatuuril 65 ° C, et taastada proteiini DNA-ristsidemed. Immuunkompleksid töödeldi edasi DNaas- ja RNaasivaba proteinaasiga K ning DNA puhastati fenooli / kloroformi ekstraheerimise ja etanooli sadestamisega. PCR viidi läbi spetsiifiliste praimeritega, mis vastavad inimese iNOS geeni promootorpiirkonnas olevale järjestusele (p1 praimer: 5'-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3; p2 praimer: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3'). (Doublier et al., 2008)

EGFP-ekspressiooni uuringud

Ekspressiooniuuringute jaoks kultiveeriti erinevatesse kandjatesse eelnevalt kirjeldatud rekombinantne tüvi L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Saksamaa) koos EGFP geeni (täiustatud roheline fluorestsentsvalk) geeniga, integreeritud kromosoomiga ssu täiendavalt täiendatud 100 mg l-ga-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Saksamaa). Kasvatamise ajal võeti 1 ml proovi, tsentrifuugiti (2000 x g, 20 ° C, 10 min) ja pesti 0,9% NaCl lahusega. Pellet resuspendeeriti puhvris (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) ja lagundati sontsioneerimisega ultraheli protsessoriga UP400S (energia rakendamine ~ 400 W). Rakuprobleemid eemaldati tsentrifuugimisega (6000 x g, 4 ° C, 5 min) ja analüüsiti laimmli (1970) meetodil redutseerivate tingimustega naatriumdodetsüülsulfaadi-polüakrüülamiidgeellelektroforeesiga (SDS-PAGE) koos 12,5% polüakraliidigeelidega . EGFP-ekspressiooni uuriti segatud kultuuris. (Fritsche et al., 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

E. coli EDL933 genoomse DNA elektroforeesianalüüsid, mida oli ultraheliga seostatud 0 - 15 minutiga. L näitab DNA ladderit. (Basselet jt, 2008)

Infonõue




Pange tähele, et meie Privaatsuspoliitika.


Kromatiini immuunsadestamine

Ultraheli raku hävitaja UP100H (100 W) lüüsi, rakkude häirete ja DNA nihutamiseks.Kromatiini immuunsadestamise analüüs tehti ChIP-IT abilTM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) vastavalt tootja juhistele mõnede muudatustega. Lühidalt, diferentseeritud inimese podotsüüdid ristseotud 10% toatemperatuuril 1% formaldehüüdiga. Rakke pesti jääkülma PBS-ga ja fikseerimisreaktsioon peatati 0,25 M glütsiini lisamisega toatemperatuuril 5 minutit. Rakke pesti jälle jääkülma PBS-iga ja kraapitud anumast. Rakud suspendeeriti tsentrifuugimisega ja resuspendeeriti lüüsipuhvris. Pärast tsentrifuugimist resuspendeeriti pelleeritud tuumad lõikamispuhvris, inkubeeriti jääl 30 minutit ja kromatiini lõigati ultraheliga, näiteks UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Saksamaa) 25% võimsusega 5 impulssi 20 sekundit jääl ligikaudu 200-600 bp fragmentidena. Seejärel kärbitud kromatiini tsentrifuugiti ja supernatant koguti. Immuunpretsipitsatsioonide jaoks inkubeeriti 60 ui kromatiini 1 ug Sp1-ga (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-KBB p65 (Abcam, Cambridge, UK) või NF-kB p50 (Abcam) antikehadega või küüliku IgG (Zymed Laboratories, Lõuna-San Francisco, CA, USA) negatiivse kontrollina, õrnalt pöörlevat öö jooksul 4 ° C juures. Magnetkangidega seotud immuunkompleksid koguti magnettuledega, pesti ulatuslikult ja proteiini / DNA ristsidemed pöörati ümber ja DNA-d elueeriti reaalajalise PCR analüüsiga. (Ristola jt, 2009)

EHEC DNA preparaat kiipide massiivanalüüsiks

Rakulüsaatide ja ekstraheeritud DNA paigutus
PBS-s suspendeeritud bakteriaalseid graanuleid soovitud lõppkontsentratsioonini töödeldi ultraheli häireseade UP100H (Hielscher GmbH, Saksamaa), mis on varustatud mikrotiipiga MS1 (diameetriga 1 mm). Töösagedus oli 30 kHz ja efektiivne väljundvõimsus oli 100 W. Operatsiooni käigus jahutati proove jäävannis, segati ja tsentrifuugiti. Proove kasutati voolutsütomeetrilisteks uuringuteks, kuid nende edasiseks käitlemiseks viidi proovid kuumtöötlemisele (95 ° C, 5 min). Toorrakulüsaate töödeldi fenooli / kloroformi / isoamüülalkoholi seguga (25: 24: 1). Lüsaadiproovile lisati võrdne kogus seda segu, lahus viidi tugevasti vorteksti 15 sekundiks ja tsentrifuugiti 15 000 xg juures 2 minutit toatemperatuuril (RT) umbes 22 ° C juures. Genoomne DNA sisaldav ülemine vesifaas eraldati ettevaatlikult ja koguti uue steriilse Eppendorfi tuubi.
Seejärel töödeldi proovid ultraheliga DNA fragmentideks. Ultraheli töötlemise etapp saavutati samades tingimustes nagu eespool kirjeldatud. Genoomse DNA killustatuse mõju hindamiseks analüüsiti proove agaroosgeel-elektroforeesiga.
(…) Proove, mida sonikeeriti eelnevalt 2,5 minutit, töödeldi pärast kuumtöötlust ja tsentrifuugimist ekstrakti. Vabanenud DNA ekstraheeriti kaks korda fenooliga: kloroform: isoamüülalkoholi segu ja seejärel muudeti ultraheliga töötlemist 0 kuni 15 minutiks. DNA ekstraheerimisjärgse ultraheli fragmenteeritava DNA suuruse jaotuse määramiseks kasutati agaroosgeeli elektroforeesi (joonis ülaosas paremas servas). Kõrge fragmenteeritud DNA ilmnes pigem DNA-i määrimisest kui suure molekulmassiga ribadest, mis eemaldati 2.5-minutistest või pikematest ultraheliga töödeldud proovidest. Pikem ultrahelitöötlus vähendas järk-järgult fragmentide pikkust ligikaudu 150-600 bp-ni ja ultrahelitöötlus 15 minuti jooksul lagunes neid fragmente veelgi, nagu nähtub enamjaolt rasva ülemisest osast. Seega vähenes DNA fragmendi keskmine väärtus ultraheliuuringu ajaga järk-järgult ja 5-minutiline töötlemine võimaldas saada kiibi array analüüside jaoks kõige sobivamate DNA fragmentide suurust. Lõpuks määrati DNA analüüdi valmistamisprotseduur, mis hõlmas ultraheliga töötlemise esimest 2 minutit, DNA ekstraheerimist (2 ×) ja sellele järgnevat 5 min ultrahelitöötlust. (Basselet jt, 2008)

Kromatiini immuunsadestamine (ChIP)

Ultraheli protsessor UP100H DNA, RNA ja kroon nihkumine. (Vajuta suurendamiseks!)HEK293 rakke kasvatati nagu eespool kirjeldatud ja fikseeriti 2 mM disuktsiinimidüülglutaraadiga toatemperatuuril 45 minutit. Seejärel pesti rakke kaks korda PBS-ga. Kromatiini ristseotud 10 minutit toatemperatuuril, kasutades 1% (v / v) formaldehüüdi ja pesti kaks korda jääkülma PBS-ga. Ristsidumise reaktsioon peatati inkubeerimisega glütsiiniga lõppkontsentratsioonil 0,125 M 5 minutit toatemperatuuril. Pärast trüpsiini inkubeerimist kraabiti rakud rakukultuuri tassilt ja pesti kaks korda PBS-ga. Rakupellet resuspendeeriti lüüsipuhvris (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCI ja 0,5% (v / v) Nonidet P-40), inkubeeriti jääl 10 minutit ja homogeniseeriti Douncei homogenisaatoriga. Seejärel pelleti tuumad tsentrifuugimisega (3500 xg, 5 min, 4 ° C) ja resuspendeeriti tuumapuhvris (50 mM Tris-HCI, pH 8,1, 10 mM EDTA ja 1% (mass / maht) SDS). Tuumad olid häiritud ultraheliga kolmes 20-nda impulsiga a UP50H sonicator (Hielscher Ultraschall Technologie) tsükli 0,5 ja 30% amplituudiga, genereerides genoomseid DNA fragmente suurusega 200-1000 bp. CHIP-i jaoks lahjendati 50 g DNA-d 4 korda immunopretsipitatsioonipuhvris (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (maht / maht) Triton X-100 ja 0,01% (mass / v) SDS). (Weiske jt, 2006)

Histooni modifitseerimise analüüs kromatiini immuunsadestamise (ChIP) abil

Lühidalt, 6 x 106 rakke pesti kaks korda PBS-ga ja ristsidemega 15 minutit toatemperatuuril kultuuriplaadil 0,5% formaldehüüdi juuresolekul. Ristsidumise reaktsioon peatati 0,125 M glütsiini lisamisega. Kõik järgnevad etapid viidi läbi 48 ° C juures. Kõik puhvrid olid eelnevalt jahutatud ja sisaldasid proteaasi inhibiitoreid (Complete Mini, Roche). Rakke pesti kaks korda PBS-iga ja seejärel kraabiti. Kogutud graanulid lahustati 1 ml lüüsipuhvris (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) ja töödeldi ultraheliga 10-tsüklilise 100% amplituudiga külma etanoolivannis, kasutades UP50H sonicator (Hielscher, Teltow, Saksamaa). Kromatiini fragmenteeritus visualiseeriti 1% agaroosgeelil. Saadud fragmendid olid vahemikus 200-500 pb. Lahustuv kromatiin saadi ultrahelitöötlusproovide tsentrifuugimisel 14 000 g juures 48 minutit temperatuuril 48 ° C 10 minutit. Lahustuvat fraktsiooni lahjendati 1/10 lahjenduspuhvris (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), seejärel alikvooditi ja säilitati kuni kasutamiseni temperatuuril 80 ° C. (Rodriguez jt, 2008)

Seade Võimsus [W] Tüüp Maht [ml]
VialTweeter 200 iseseisev 0.5 1.5
UP50H 50 käeshoitav või standmounted 0.01 250
UP100H 100 käeshoitav või standmounted 0.01 500
Uf200 ः t 200 käeshoitav või standmounted 0.1 1000
UP200St 200 seisma jäänud 0.1 1000
UP400St 400 seisma jäänud 5.0 2000
CupHorn 200 CupHorn, sonoreactor 10 200
GDmini2 200 saastevaba voolukamber

Infonõue




Pange tähele, et meie Privaatsuspoliitika.


Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

VialTweeter ultraheliproovi ettevalmistamiseks

Võta meiega ühendust! / Küsi meiega!

Küsige lisateavet

Palun kasutage allpool olevat vormi, kui soovite taotleda täiendavat teavet ultraheli homogeniseerimine. Meil on hea meel pakkuda teile ultraheli süsteemi istungil oma nõudeid.









Palun pange tähele, et meie Privaatsuspoliitika.


Kirjandus / viited

  • Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Enterohemorraagilise Escherichia coli (EHEC) DNA kiibi massiivipõhise analüüsi proovide töötlemine. Mikroobide rakufaktorid 7:29. 2008
  • Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA summutamine taastab resistentsuse doksorubitsiinile inimese käärsoole vähirakkudes. Molekulaarravi uuringud 6 (10), 2008.
  • Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid NHH, Simonsson M. (2008): Fusarium DNA ekstraheerimise meetodi hindamine mütseelist ja nisust reaalajalise PCRi allavoolu kvantifitseerimiseks ja korrelatsiooniks mükotoksiinitasemetega . 2008. aasta mikrobioloogiliste meetodite väljaanne.
  • Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Leishmania tarentolae kasvukäitumise iseloomustus - uus rekombinantsete valkude ekspressioonisüsteem. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384-393.
  • Ristola M., Arpiainen S., Saleem MA, Mathieson PW, Welshi GI, Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Nef3 geeni reguleerimine podotsüütides - transkriptsioonifaktorite NF-KB ja Sp1 võtmerolli. BMC molekulaarbioloogia 10:83, 2009.
  • Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado MA (2008): tavapärastes ja vähirakkudes metüülimata DNA Alu korduste genoomide ulatuslik jälgimine. Nucleic Acid Research Vol. 36, nr 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): histidiin triaadi proteiini vihje1 käivitab apoptoosi, mis on sõltumatu selle ensümaatilisest aktiivsusest. Bioloogilise keemia ajakiri. Vol. 281, nr 37, 2006. 27356-27366.


Faktid Tasub teada

Ultraheli / akustiline kavitatsioon loob väga intensiivseid jõude, mis soodustab kristalliseerumise ja sadestamise protsessi (Klõpsa suurendamiseks!)

Ultraheli DNA lõikamine põhineb akustilisel kavitatsioonil ja selle hüdrodünaamilistes nihkejõududes