Ultraheli DNA nihkamine

DNA ja RNA nihkamise käigus fragmenteeritakse pikad DNA molekulid väiksemateks tükkideks – see on oluline samm proovide ettevalmistamisel järgmise põlvkonna sekveneerimise (NGS) raamatukogu koostamiseks. Ultraheli DNA nihkamine kasutab akustilise kavitatsiooni jõude, et lõhkuda DNA või RNA fragmentideks pikkusega 100 bp kuni 5 kb. See meetod võimaldab fragmendi suurust täpselt kontrollida, mis hõlbustab kohandamist soovitud DNA pikkusele optimaalsete sekveneerimistulemuste saavutamiseks.

DNA nihkamine ultraheli töötluse abil

Hielscher Ultrasonics pakub mitmesuguseid ultrahelil põhinevaid lahendusi DNA, RNA ja kromatiini nihkamiseks. Valida saab sondtüüpi sonikaatorite (nt UP100H) vahel otseseks sonikeerimiseks mikrotipiga või kasutada seadet VialTweeeter või ultraheli cuphorni mitme proovi samaaegseks kaudseks DNA ettevalmistamiseks. Hielscher pakub teie vajadustele sobivaima seadme: olenemata sellest, kas teil on 1 või kuni 10 proovi, mikroliitritest liitriteni ulatuvad mahud – Hielscheri sonikaatorid vastavad teie nõuetele, et valmistada DNA, RNA ja kromatiini fragmendid õige pikkusega. Reprodutseeritavus, lihtne käsitsemine ja täpne juhtimine võimaldavad luua usaldusväärse raamatukogu järgmise põlvkonna sekveneerimiseks.
Erinevalt ensümaatilisest DNA fragmenteerimisest rakendab ultraheli nihkamine puhtalt mehaanilisi nihkejõude ilma kemikaale lisamata. Protsessiparameetrite täpse seadistamisega tekitab ultraheli nihkamine suure molekulmassiga DNA fragmente (plasmiidne ja genoomne DNA).
Puhastatud nukleiinhappeid saab amplifitseerida enne või pärast fragmenteerimisetappi.
Sonikeerimisparameetreid (võimsus, impulsitsükkel / impulsid, aeg ja temperatuur) saab turvaliselt juhtida tarkvaraseadete kaudu.

Ultraheli DNA nihkamise protokollid

Kromatiini immunosadestamise analüüsiks

Lühidalt: rakud külvati 60mm läbimõõduga tassidele (400 000 tassi kohta) ja transfekteeriti RhoA siRNA-ga (nagu kirjeldatud); 72 h pärast inkubeeriti neid formaldehüüdiga (lõppkontsentratsioon 1%) 10 min temperatuuril 37°C, et valgud DNA-ga ristsiduda. Ristsidumisreaktsioon peatati, lisades ühe kümnendiku mahust 1,25 mol/L glütsiini, mille tulemusel saadi lõppkontsentratsioon 125 mmol/L. Rakke pesti kaks korda jääkülma PBS-iga, suspendeeriti uuesti radioimmunosadestamise analüüsi puhvris [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksükolaat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)], mis sisaldas 1 mmol/L fenüülmetüülsulfonüülfluoriidi, 1 Ag/mL aprotiniini ja 1 Ag/mL pepstatiin A-d, ning hoiti jääl 30 min. Seejärel sonikeeriti rakulüsaate jääl Hielscher UP200S ultraheli sonikaatoriga (3 x 40 s, amplituud 40%, tsükkel 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), kuni ristseotud kromatiinid olid nihutatud nii, et saadi DNA fragmendid pikkusega 200 kuni 1 000 bp. Üks kümnendik kogulüsaadist kasutati erinevates proovides sisalduva DNA hulga kvantifitseerimiseks ja seda käsitleti kui „kogu sisend-DNA“. Supernatante inkubeeriti lõhesperma DNA/valgu agaroosi 50% suspensiooniga, et vähendada mittespetsiifilist tausta. Immunosadestamine tehti seejärel üleöö temperatuuril 4°C 5 Ag anti-NF-nB p65-ga (Upstate) või ilma antikehata (negatiivne kontroll). Neid supernatante täiendati 5 mol/L NaCl-iga ja kuumutati üleöö temperatuuril 65°C, et pöörata tagasi valgu ja DNA vahelised ristsidemed. Immunokomplekse töödeldi edasi DNaasi- ja RNaasivaba proteinaas K-ga ning DNA puhastati fenooli/kloroformi ekstraktsiooni ja etanoolsadestamise teel. PCR tehti spetsiifiliste praimeritega, mis vastavad inimese iNOS-geeni promootorpiirkonna järjestusele (p1 praimer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 praimer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP ekspressiooni uuringud

Ekspressiooniuuringuteks kultiveeriti rekombinantset tüve L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Saksamaa), mille kromosomaalsesse ssu lookusesse on integreeritud EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein ehk tugevdatud roheline fluorestsentsvalk) geen, eelnevalt kirjeldatud viisil erinevates söötmetes, millele lisati täiendavalt 100 mg l^-1 Nourseothricini (Jena Bioscience, Saksamaa). Kultiveerimise ajal võeti 1 ml proovid, tsentrifuugiti (2000 × g, 20°C, 10 min) ja pesti 0,9% NaCl lahusega. Sade resuspendeeriti puhvris (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) ja desintegreeriti sonikeerimisega ultraheliprotsessoriga UP400S (energiakasutus ∼ 400 Ws). Rakujäägid eemaldati tsentrifuugimisega (6000 × g, 4°C, 5 min) ja analüüsiti naatriumdodetsüülsulfaat–polüakrüülamiidgeelelektroforeesiga (SDS-PAGE) redutseerivates tingimustes Laemmli (1970) meetodi kohaselt 12,5% polüakrüülamiidgeelidega. EGFP ekspressiooni uuriti loksutatavas kultuuris. (Fritsche et al. 2007)

Kromatiini immunosadestamine

Kromatiini immunosadestamise analüüs viidi läbi, kasutades komplekti ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) vastavalt tootja juhistele mõningate muudatustega. Lühidalt: diferentseerunud inimese podotsüüdid ristsiduti 1% formaldehüüdiga 10 min toatemperatuuril. Rakke pesti jääkülma PBS-iga ja fikseerimisreaktsioon peatati 0,125 M glütsiini lisamisega 5 min toatemperatuuril. Rakke pesti uuesti jääkülma PBS-iga ja kraabiti tassilt maha. Rakud settitati tsentrifuugimisega ja resuspendeeriti lüüsipuhvris. Pärast tsentrifuugimist resuspendeeriti settinud tuumad nihkepuhvris, inkubeeriti jääl 30 min ning kromatiin nihutati ultraheli töötlusega, nt UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Saksamaa) 25% võimsusel 5 impulssi, igaüks 20 s, jääl, ligikaudu 200–600 bp pikkusteks fragmentideks. Seejärel nihutatud kromatiin tsentrifuugiti ja supernatant koguti. Immunosadestamiseks inkubeeriti 60 μl kromatiini 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) või NF-κB p50 (Abcam) antikehadega või negatiivse kontrollina küüliku IgG-ga (Zymed Laboratories) üleöö 4°C juures õrnalt pöörates. Magnetpärlitega seotud immunokompleksid koguti magnetalusega, pesti põhjalikult, valgu/DNA ristsidemed lõhuti ja DNA eluteeriti reaalaja PCR-analüüsiks. (Ristola et al. 2009)

EHEC DNA ettevalmistamine kiibimassiivi analüüsiks

Rakulüsaatide ja ekstraheeritud DNA ettevalmistamine
PBS-is soovitud lõppkontsentratsioonini suspendeeritud bakterisetteid töödeldi ultraheli disruptoriga UP100H (Hielscher GmbH, Saksamaa), mis oli varustatud mikrotipuga MS1 (läbimõõt 1mm). Töösagedus oli 30 kHz ja efektiivne väljundvõimsus 100 W. Töö ajal jahutati proove jää-vee vannis, segati ja tsentrifuugiti. Proove kasutati voolutsütomeetria uuringuteks, hilisemaks käsitlemiseks aga allutati proovid kuumtöötlusele (95°C, 5 min). Toorlüsaate töödeldi fenooli, kloroformi ja isoamüülalkoholi seguga (25:24:1). Lüsaadiproovile lisati võrdne ruumala seda segu, lahust vorteksiti jõuliselt 15 s ja tsentrifuugiti kiirusel 15 000 x g 2 min toatemperatuuril (RT) umbes 22°C juures. Genoomset DNA-d sisaldav ülemine vesifaas eraldati ettevaatlikult ja koguti uude steriilsesse Eppendorfi tuubi.
Seejärel allutati proovid ultraheli töötlusele (sonikeerimisele) DNA fragmenteerimiseks. Sonikeerimise etapp viidi läbi samadel tingimustel, nagu eespool kirjeldatud. Fragmenteerimise mõju hindamiseks genoomsele DNA-le analüüsiti proove agaroosgeelelektroforeesiga.
(…) Varem 2,5 min sonikeeritud proovid allutati pärast kuumtöötlust ja tsentrifuugimist ekstraktsiooni etapile. Vabanenud DNA ekstraheeriti kaks korda fenooli, kloroformi ja isoamüülalkoholi seguga ning seejärel allutati teisele sonikeerimisele 0 – 15 min jooksul. Agaroosgeelelektroforeesi kasutati ekstraktsioonijärgsele ultraheli fragmenteerimisele allutatud DNA suurusjaotuse määramiseks (joonis üleval paremal). Tugevalt fragmenteeritud DNA-le viitas DNA-määrde olemasolu suure molekulmassiga ribade asemel, mis kadusid proovidest, mida sonikeeriti 2,5 min või kauem. Pikem sonikeerimine vähendas fragmentide pikkust järk-järgult ligikaudu 150 – 600 bp-ni ja 15-minutiline sonikeerimine lagundas need fragmendid veelgi, mis on nähtav peamiselt määrde ülaosas. Seega vähenes DNA fragmentide keskmine suurus ultraheli töötluse kestusega järk-järgult ning 5-minutiline töötlus võimaldas saada DNA fragmentide suurused, mis sobisid kõige paremini kiibimassiivi analüüsideks. Lõpuks kehtestati DNA analüüdi ettevalmistamise protseduur, mis koosnes esmalt 2 min ultraheli töötlusest, DNA ekstraktsioonist (2×) ja sellele järgnevast 5 min sonikeerimisest. (Basselet et al. 2008)

Kromatiini immunosadestamine (ChIP)

HEK293 rakke kasvatati nagu eespool kirjeldatud ja fikseeriti 2 mM disuktsiinimidüülglutauraadiga 45 min toatemperatuuril. Seejärel pesti rakke kaks korda PBS-iga. Kromatiin ristsidestati 10 min toatemperatuuril 1% (v/v) formaldehüüdi abil ja pesti kaks korda jääkülma PBS-iga. Ristsidumisreaktsioon peatati inkubeerimisega glütsiiniga lõppkontsentratsioonil 0,125 M 5 min toatemperatuuril. Pärast inkubeerimist trüpsiiniga kraabiti rakud rakukultuuri tassilt maha ja pesti kaks korda PBS-iga. Rakusade suspendeeriti uuesti lüüsipuhvris (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl ja 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkubeeriti jääl 10 min ja homogeniseeriti Dounce’i homogenisaatoriga. Seejärel sadestati tuumad tsentrifuugimisega (3500 x g, 5 min, 4 °C) ja suspendeeriti uuesti tuumapuhvris (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA ja 1% (w/v) SDS). Tuumad lõhuti ultraheli töötlusega kolme 20-sekundilise impulsiga seadmes UP50H sonikaator (Hielscher Ultraschall Technologie), seadistusel tsükkel 0,5 ja amplituud 30%, mille tulemusel saadi genoomse DNA fragmendid põhisuurusega 200 – 1000 bp. ChIP jaoks lahjendati 50g DNA-d 4-kordselt immunosadestamise puhvris (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 ja 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histooni modifikatsioonide analüüs kromatiini immunosadestamise (ChIP) abil

Lühidalt, 6 x 10⁶ rakku pesti kaks korda PBS-iga ja ristsidestati kultuuriplaadil 15 min toatemperatuuril 0,5% formaldehüüdi juuresolekul. Ristsidumisreaktsioon peatati 0,125 M glütsiini lisamisega. Kõik järgnevad etapid viidi läbi temperatuuril 48°C. Kõik puhvrid olid eelnevalt jahutatud ja sisaldasid proteaasiinhibiitoreid (Complete Mini, Roche). Rakke pesti kaks korda PBS-iga ja seejärel kraapiti maha. Kogutud sademed lahustati 1 ml lüüsipuhvris (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) ja töödeldi ultraheliga külmas etanoolivannis 10 tsüklit 100% amplituudil, kasutades UP50H sonikaatorit (Hielscher, Teltow, Saksamaa). Kromatiini fragmenteerumist visualiseeriti 1% agaroosgeelis. Saadud fragmendid jäid vahemikku 200–500pb. Lahustuv kromatiin saadi ultraheliga töödeldud proovide tsentrifuugimisel 14 000g juures 10 min temperatuuril 48°C. Lahustuv fraktsioon lahjendati 1/10 lahjenduspuhvris (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), seejärel jaotati alikvootideks ja hoiti kuni kasutamiseni temperatuuril 80°C. (Rodriguez et al. 2008)