Ultraheli DNA lõikamine

DNA ja RNA lõikamise ajal killustatakse pikad DNA molekulid väiksemateks tükkideks, mis on oluline samm proovide ettevalmistamisel järgmise põlvkonna sekveneerimise (NGS) raamatukogu ehitamiseks. Ultraheli DNA lõikamine kasutab akustilisi kavitatsioonijõude, et purustada DNA või RNA fragmentideks vahemikus 100 bp kuni 5 kb. See meetod võimaldab fragmentide suuruse täpset kontrolli, hõlbustades optimaalsete sekveneerimistulemuste saavutamiseks soovitud DNA pikkuse kohandamist.

DNA lõikamine ultraheli abil

Hielscher Ultrasonics pakub erinevaid ultrahelipõhiseid lahendusi DNA, RNA ja kromatiini lõikamiseks. Valige sondi tüüpi ultrasonikaatorite (nt UP100H) vahel otseseks ultrahelitöötluseks, kasutades mikrotipi, või kasutage VialTweeeterit või ultraheli kuparit erinevate proovide kaudseks DNA ettevalmistamiseks samaaegselt. Hielscher pakub ideaalset seadet, mis vastab teie vajadustele: kas teil on 1 või kuni 10 proovi, mahud mikroliitrist liitrini – Hielscheri sonikaatorid vastavad teie nõuetele DNA, RNA ja kromatiini fragmentide valmistamiseks õige pikkusega. Reprodutseeritavus, lihtne kasutamine ja täpne juhtimine võimaldavad usaldusväärset teeki järgmise põlvkonna järjestamiseks.
Erinevalt ensümaatilisest DNA killustatusest rakendab ultraheli lõikamine puhtaid mehaanilisi nihkejõude ilma kemikaale lisamata. Protsessi parameetrite täpse seadistamisega toodab ultraheli lõikamine suure molekulmassiga DNA fragmente (plasmiid ja genoomne DNA).
Puhastatud nukleiinhappeid saab võimendada enne või pärast killunemist.
Sonikatsiooniparameetreid (võimsus, impulsi tsükkel? purunemised, aeg ja temperatuur) saab tarkvara seadete kaudu ohutult juhtida.

Ultraheli DNA lõikamise protokollid

Kromatiini immunoprecipitatsiooni analüüsi jaoks

Lühidalt öeldes külvati rakud 60 mm läbimõõduga nõudesse (400 000 tassi kohta) ja transfekteeriti RhoA siRNA-ga (nagu kirjeldatud); 72 tunni pärast inkubeeriti neid formaldehüüdiga (lõplik kontsentratsioon, 1%) 10 minutit 37 °C juures, et valke DNA-ga ristsiduda. Ristsidumisreaktsioon kustutati, lisades kümnendiku mahust 1,25 mol/l glütsiini, mis andis lõppkontsentratsiooniks 125 mmol/l. Rakke pesti kaks korda jääkülma fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega, resuspendeeriti radioimmunoprecipitatsiooni analüüsi puhvris [150 mmol/l NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksükolaati, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)], mis sisaldas 1 mmol/l fenüülmetüülsulfonüülfluoriidi, 1 Ag/ml aprotiniini ja 1 Ag/ml pepstatiin A, ning hoiti jääl 30 minutit. Seejärel töödeldi rakulüsaate jääl ultraheliga Hielscher UP200S ultraheli sonikaator (3 x 40 s, amplituud 40%, tsükkel 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), kuni ristseotud kromatiinid nihkusid, et saada DNA fragmente vahemikus 200 kuni 1,000 bp. Üks kümnendik tervest lüsaadist kasutati erinevates proovides sisalduva DNA koguse kvantifitseerimiseks ja seda peeti “kogu sisend-DNA”. Supernatante inkubeeriti lõhe sperma DNA/valgu agaroos-50% lägaga, et vähendada mittespetsiifilist tausta. Seejärel tehti immunoprecipitation üleöö 4 ° C juures 5 Ag anti-NF-nB p65-ga (Upstate) või ilma antikehata (negatiivne kontroll). Neid supernatante täiendati 5 mol/l NaCl-ga ja kuumutati üleöö 65 °C juures, et taastada valgu-DNA ristsidemed. Immunokomplekse töödeldi edasi DNaasi- ja RNaasivaba proteinaasiga K-ga ning DNA puhastati fenooli/kloroformi ekstraheerimise ja etanooli sadestamisega. PCR tehti spetsiifiliste praimeritega, mis vastavad järjestusele inimese iNOS geeni promootori piirkonnas (p1 praimer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 praimer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP-ekspressiooni uuringud

Ekspressiooniuuringute jaoks kasvatati erinevates söötmetes rekombinantset tüve L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Saksamaa) EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) geeniga, kromosomaalset ssu integreeritud, nagu eelnevalt kirjeldatud, ja täiendavalt täiendati seda 100 mg l-ga^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Saksamaa). Kasvatamise ajal võeti 1 ml proove, tsentrifuugiti (2000 × g, 20 °C, 10 min) ja pesti 0,9% NaCl lahusega. Pellet resuspendeeriti puhvris (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) ja lagunes ultraheli protsessoriga sonifikatsiooni teel UP400S (energia kasutamine ∼ 400 Ws). Rakujäägid eemaldati tsentrifuugimise teel (6000 × g, 4 °C, 5 min) ja analüüsiti naatriumdodetsüülsulfaadiga – polüakrüülamiidgeeli elektroforeesiga (SDS-PAGE) redutseerivates tingimustes vastavalt Laemmli (1970) meetodile 12,5% polüakralamiidi geelidega. EGFP-väljendust uuriti ärritunud kultuuris. (Fritsche jt 2007)

kromatiini immunoprecipitatsioon

Kromatiini immunoprecipitatsiooni analüüs viidi läbi ChIP-IT abil^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) according to the manufacturer’s instructions with some modifications. Briefly, differentiated human podocytes were cross-linked with 1% formaldehyde for 10 min at room temperature. Cells were washed with ice-cold PBS and the fixation reaction was stopped by adding 0.125 M glycine for 5 min at room temperature. Cells were washed again with ice-cold PBS and scraped from the dish. Cells were pelleted by centrifugation and resuspended in the lysis buffer. After centrifugation, pelleted nuclei were resuspended in the shearing buffer, incubated on ice for 30 min and the chromatin was sheared by sonication, e.g. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Saksamaa) 25% võimsusega 5 impulssi 20 sekundit igaüks jääl umbes 200–600 bp fragmentideks. Seejärel tsentrifuugiti nihkunud kromatiin ja koguti supernatant. Immunopretsipitatsioonide jaoks inkubeeriti 60 μl kromatiini negatiivse kontrollina 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) või NF-κB p50 (Abcam) antikehadega või küüliku IgG-ga (Zymed Laboratories) negatiivse kontrollina üleöö 4 °C juures õrna pöörlemisega. Magnethelmestega seotud immunokompleksid koguti magnetilise aluse abil, pesti ulatuslikult ning valgu/DNA ristsidemed pöörati ümber ja DNA elueeriti reaalajas PCR-analüüsiks. (Ristola jt 2009)

EHEC DNA ettevalmistamine kiibimassiivi analüüsiks

Rakulüsaatide ja ekstraheeritud DNA paigutus
PBS-is suspendeeritud bakterigraanuleid soovitud lõppkontsentratsioonini töödeldi ultraheli katkestaja UP100H (Hielscher GmbH, Saksamaa), mis on varustatud mikrotiibiga MS1 (läbimõõt 1 mm). Töösagedus oli 30 kHz ja efektiivne väljundvõimsus 100 W. Operatsiooni ajal jahutati proovid jääveevannis, segati ja tsentrifuugiti. Proove kasutati voolutsütomeetrilisteks uuringuteks, hilisemaks käitlemiseks aga kuumtöödeldi proove (95 °C, 5 min). Toorraku lüsaate töödeldi fenool:kloroform:isoamüülalkoholi seguga (25:24:1). Lüsaadiproovile lisati sama kogus seda segu, lahust keerutati tugevasti 15 sekundit ja tsentrifuugiti 15 000 x g juures 2 minutit toatemperatuuril (RT) umbes 22 °C juures. Genoomset DNA-d sisaldav ülemine vesifaas eraldati hoolikalt ja koguti uude steriilsesse Eppendorfi torusse.
Seejärel töödeldi proove DNA killustamiseks. Ultrahelitöötluse samm realiseeriti samadel tingimustel, nagu eespool kirjeldatud. Killustumise mõju hindamiseks genoomsele DNA-le analüüsiti proove agaroosgeeli elektroforeesi abil.
(…) Varem 2,5 minutit ultraheliga töödeldud proovidele eraldati pärast kuumtöötlemist ja tsentrifuugimist. Vabanenud DNA ekstraheeriti kaks korda fenooliga:kloroform:isoamüülalkoholi segu ja seejärel viidi läbi teine ultrahelitöötlus 0–15 minutit. Agaroosgeeli elektroforeesi kasutati ekstraheerimisjärgsele ultraheli killustumisele allutatud DNA suuruse jaotuse määramiseks (joonis paremas ülanurgas). Väga killustatud DNA ilmnes pigem DNA määrdumise olemasolust kui kõrgmolekulaarsetest ribadest, mis kõrvaldati 2,5 min või kauem ultraheliga töödeldud proovidest. Pikem ultrahelitöötlus vähendas järk-järgult fragmentide pikkust umbes 150–600 bp-ni ja ultrahelitöötlus 15 minutit halvendas neid fragmente veelgi, nagu võib näha peamiselt määrdumise ülemisest osast. Seega vähenes keskmine DNA fragmendi suurus järk-järgult ultraheliuuringu ajaga ja 5-minutiline töötlemine võimaldas saada kiibimassiivi analüüsideks kõige sobivamate DNA fragmentide suurused. Lõpuks loodi DNA analüütide ettevalmistamise protseduur, mis hõlmas esimest 2 minutit ultraheliravi, DNA ekstraheerimist (2×) ja sellele järgnevat 5-minutilist ultrahelitöötlust. (Basselet et al. 2008)

Kromatiini immunoprecipitatsioon (ChIP)

HEK293 rakke kultiveeriti eespool kirjeldatud viisil ja fikseeriti 2 mM disuccinimidüül-glutaraadiga 45 minutit toatemperatuuril. Seejärel pesti rakke kaks korda fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega. Kromatiini ristseoti toatemperatuuril 10 minutit, kasutades 1% (v/v) formaldehüüdi, ja pesti kaks korda jääkülma fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega. Ristsidumisreaktsioon peatati inkubeerimisega glütsiiniga lõppkontsentratsioonil 0,125 M 5 minutit toatemperatuuril. Pärast trüpsiiniga inkubeerimist kraabiti rakukultuuri tassist rakukultuuri tassi ja pesti kaks korda fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega. Rakupellet resuspendeeriti lüüsipuhvris (5 mM torud, pH 8,0, 85 mM KCl ja 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkubeeriti jääl 10 minutit ja homogeniseeriti Dounce homogenisaatoriga. Seejärel granuleeriti tuumad tsentrifuugimise teel (3500 x g, 5 min, 4 °C) ja resuspendeeriti tuumapuhvris (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA ja 1% (w/v) SDS). Tuumad olid häiritud ultrahelitöötlusega kolme 20-sekundilise impulsiga a UP50H sonikaator (Hielscher Ultraschall Technologie) tsükli 0,5 ja amplituudiga 30%, saades genoomsed DNA fragmendid mahuga 200–1000 bp. ChIP puhul lahjendati 50 g DNA-d immunoprecipitatsioonipuhvris 4 korda (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 ja 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histooni modifikatsiooni analüüs kromatiini immunoprecipitatsiooni (ChIP) abil

Lühidalt, 6 x 10⁶ rakke pesti kaks korda fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega ja ristseoti kultuuriplaadil 15 minutit toatemperatuuril 0,5% formaldehüüdi juuresolekul. Ristsidumisreaktsioon peatati 0,125 M glütsiini lisamisega. Kõik järgnevad sammud viidi läbi 48 °C juures. Kõik puhvrid olid eelnevalt jahutatud ja sisaldasid proteaasi inhibiitoreid (Complete Mini, Roche). Rakke pesti kaks korda fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega ja seejärel kraabiti. Kogutud graanulid lahustati 1 ml lüüsipuhvris (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) ja töödeldi ultraheliga külmas etanoolivannis 10 tsüklit 100% amplituudiga, kasutades a UP50H sonikaator (Hielscher, Teltow, Saksamaa). Kromatiini fragmenteerumist visualiseeriti 1% agaroosgeelis. Saadud fragmendid olid vahemikus 200–500pb. Lahustuv kromatiin saadi ultraheliga töödeldud proovide tsentrifuugimisel 14 000 g juures 10 minutit 48 °C juures. Lahustuv fraktsioon lahjendati lahjenduspuhvris vahekorras 1:10 (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), seejärel alikvootiti ja säilitati kuni kasutamiseni temperatuuril 80 °C. (Rodriguez jt 2008)