E. coli ultraheli lüüs

E. coli bakterid on mikrobioloogias ja biotehnoloogias kõige sagedamini kasutatavad bakterid.
Ultraheli rakudesintegraatorid annavad E. coli lüüsimisel töökindlaid ja korratavaid tulemusi.
Intensiivne, kuid täpselt reguleeritav kavitatsioon ja nihkejõud tagavad täieliku rakkude lõhkumise ja suure ekstraktsioonisaagise (nt valgud, DNA).

Miks on E. coli ultraheli rakkude lõhkumine eelistatud meetod?

Ultraheli homogenisaatorid ehk sondtüüpi ultraheli seadmed pakuvad E. coli lüüsimisel mitmeid eeliseid, kuna intensiivne ultraheli lõhub tõhusalt rakuseinu ja membraane. Sondtüüpi ultraheli seadmeid kasutatakse E. coli lüüsimiseks laialdaselt järgmistel põhjustel:

Rakuseinte tõhus lõhkumine: E. coli rakuseinal on poolkõva, peptidoglükaanist koosnev struktuur, mida võib traditsiooniliste lüüsimeetoditega olla raske purustada. Sondtüüpi ultraheli seade tekitab intensiivseid ultraheli laineid, mis moodustavad rakke ümbritsevas vedelikus kavitatsioonimulle. Kui need mullid kollapseeruvad, tekivad suure kiirusega vedelikujoad ja lööklained, mis lõhuvad rakuseinu mehaaniliselt ning vabastavad tõhusalt raku sisu, näiteks biomolekule.

Parem tungimisvõime: Sondi / sonotroodi tekitatud ultraheli lained võivad proovi sügavale tungida, jõudes suurema hulga E. coli rakkudeni ja töödeldes neid ühtlaselt. See aitab tagada, et lüüs on kogu proovis ühtlasem, mille tulemuseks on suurem rakkude lõhkumise tõhusus.

Lühem töötlusaeg: Sondtüüpi ultraheli seadme edastatav energia on väga kontsentreeritud ja lokaliseeritud, mis tagab kiire ja tõhusa rakkude lüüsi. Võrreldes teiste meetoditega, nagu helmestega jahvatamine või ensümaatiline lüüs, võib sonikeerimisega saavutada E. coli lüüsi minutitega või isegi sekunditega. Kui paljud alternatiivsed meetodid, näiteks külmutamine-sulatamine, nõuavad mitut töötlustsüklit, avab ultraheli lüüs rakud ühe töösammuga.

Temperatuuri reguleerimine: Kaasaegsed ultraheli seadmed on varustatud temperatuurianduritega ja nutika tarkvaraga, mis võimaldab määrata maksimaalse protsessitemperatuuri. Ultraheli seade teeb temperatuuripiiri saavutamisel automaatselt pausi ja alustab sonikeerimist uuesti, kui seatud temperatuuripunkt on saavutatud. Proovide jahutamine jäävannis on lihtne viis proovi temperatuuri madalana hoidmiseks ja kuumusest tingitud proovi lagunemise vältimiseks.

Skaleeritavus: Sondtüüpi ultraheli seadmeid on saadaval erinevates suurustes, alates käeshoitavatest seadmetest kuni suuremahuliste tööstuslike mudeliteni. See muudab need sobivaks väikeste mahtude töötlemiseks laboris või suurendamiseks ulatuslikumate bioprotsesside rakenduste jaoks, nt vaktsiinide tootmiseks või molekulide biosünteesiks.

Mitmekülgsus: Ultraheli seadmeid saab kasutada mitmesugusteks rakendusteks peale rakkude lüüsi, näiteks DNA lõikamiseks nihkejõududega, valkude ekstraheerimiseks, koe homogeniseerimiseks, nanoosakeste dispergeerimiseks ja emulgeerimiseks. Seega pakub investeerimine sondtüüpi ultraheli seadmesse mitmekülgsust teadus- või tööstuskeskkonnas.

Sondtüüpi ultrasonikaatorid, näiteks UP200St, on töökindlad koehomogenisaatorid ja rakkude purustajad ning seetõttu laialdaselt kasutusel proovide ettevalmistamiseks geneetikas, nt E.coli lüüsiks

Valkude ekstraheerimine E.coli rakkudest toimub tõhusalt ultraheli sondiga UP200St

Sondtüüpi ultraheli seade pakub E. coli lüüsimisel palju eeliseid. Ultraheli protsessiparameetrite töökindel ja täpne reguleerimine võimaldab optimeerida töörežiimi parameetreid, nagu võimsus, kestus ja proovi käsitsemine, et saavutada soovitud tulemused.

See juhend selgitab, millist tüüpi ultraheliseade sobib kõige paremini proovide ettevalmistamiseks, näiteks lüüsiks, rakkude lõhustamiseks, valkude eraldamiseks ning DNA ja RNA fragmenteerimiseks laborites, analüüsis ja teadustöös. Valige oma kasutusala, proovi mahu, proovide arvu ja läbilaskevõime jaoks sobivaim ultraheliseadme tüüp. Hielscher Ultrasonics pakub teile ideaalset ultrahelihomogenisaatorit!

Ultraheli DNA fragmenteerimist kasutatakse sageli proovide ettevalmistamise etapina järgmise põlvkonna sekveneerimisel (NGS)

Genoomse DNA elektroforeetilised analüüsid E. coli EDL933 puhul, mida töödeldi ultraheliga 0 – 15 min. L tähistab DNA marker-redelit.
(uuring ja pilt: ©Basselet et al. 2008)

Rakkude lõhkumine ultraheli kavitatsiooni abil

Ultraheli sondtüüpi homogenisaatorid töötavad ligikaudu 20 000 tsükliga sekundis (sagedusel 20kHz) ning tekitavad vedelikes või suspensioonides kavitatsiooni. Akustiline kavitatsioon tekitab mikroskoopilisi piirkondi, kus valitsevad vaakumilaadsed rõhud ja kõrged temperatuurid ning mis rebivad rakke lahti. Kuigi temperatuurid võivad ulatuda mitme tuhande kraadini Celsiuse skaalal, on kavitatsioonimahud nii väikesed, et nad protsessi märkimisväärselt ei kuumuta. Ultraheli tekitatud akustiline kavitatsioon ja nihkejõud perforeerivad või purustavad bakterirakkude, näiteks E.coli rakumembraani. Hielscheri ultraheliseadmed võimaldavad täpselt kontrollida protsessiparameetreid, nagu ultraheli intensiivsus, amplituud, energiasisend ja temperatuur. Seeläbi saab ultraheli lüüsiprotsessi optimaalselt kohandada rakutüübi, rakukultuuri ja protsessi eesmärgiga.

Ultraheli lüüsi eelised

lüüsi täpne kontroll (intensiivsus, amplituud, temperatuur)
usaldusväärsed, korratavad tulemused
optimaalne kohandamine konkreetsetele proovidele
temperatuuri kontroll
väga väikestest kuni väga suurte proovideni (µL kuni liitriteni)
puhtalt mehaaniline töötlus
kasutajasõbralik, ohutu töö
lineaarne skaleerimine laborist tootmiseni

Ultraheliseade VialTweeter võimaldab ette valmistada samaaegselt kuni 10 viaali samades protsessitingimustes. (Suurendamiseks klõpsake!)

VialTweeter ultraheli lüüsiks

Ultraheli homogenisaator võrreldes teiste lüüsitehnikatega

Kuigi keemiline ja ensümaatiline lüüs võivad olla problemaatilised – kuna keemiline lüüs võib muuta valkude struktuuri ja tekitada puhastamisprobleeme ning ensümaatiline lüüs nõuab pikki inkubatsiooniaegu ja ei ole korratav –, on ultraheli abil lõhkumine täiustatud ja kiire rakkude lõhkumise meetod.
Ultraheli lüüs põhineb ainult mehaanilistel jõududel. Kemikaale ei lisata, sonikeerimine lõhub rakuseina nihkejõudude abil. Keemiline lüüs võib muuta valgu struktuuri ja tekitada puhastamisprobleeme. Ensümaatiline lõhkumine nõuab pikki inkubatsiooniaegu ja ei ole korratav. E.coli bakterirakkude ultraheli abil lõhkumine on kiire, lihtne, usaldusväärne ja korratav. Seetõttu kasutatakse Hielscheri ultraheliseadmeid bioloogia- ja biokeemialaboratooriumides üle kogu maailma proovide ettevalmistamiseks, eelanalüütikaks, in vitro diagnostikaks ja mitmesugusteks analüüsideks.

Üldised soovitused ultraheli lüüsiks

Sonikeerimine on kõige populaarsem tehnika väga väikeste, keskmiste ja suurte rakususpensiooni koguste lüüsimiseks – pikoliitritest kuni 100 L/h (ultraheli läbivoolukambrit kasutades). Rakud lüüsitakse vedeliku nihke ja kavitatsiooni toimel. Sonikeerimisel lõigatakse ka DNA, mistõttu ei ole vaja rakususpensioonile DNaasi lisada.

Temperatuuri kontroll E.coli ultraheli lüüsi ajal
Proovi eelnevalt jahutades ja sonikeerimise ajal jääl hoides saab proovi termilist lagunemist hõlpsalt vältida.
Ideaalis tuleks proove lüüsi ajal hoida jääkülmana, kuid enamiku proovide puhul piisab sellest, kui temperatuur ei tõuse kõrgemale kultuuri või koeallika temperatuurist. Seetõttu soovitatakse suspensiooni hoida jääl ja sonikeerida mitme lühikese ultraheli impulsiga kestusega 5–10 s ning pausidega 10–30 s. Pauside ajal saab soojus hajuda, et taastada madal temperatuur. Suuremate rakuproovide jaoks on saadaval mitmesugused läbivoolukambriga reaktorid jahutusmantliga.
Lugege siit üksikasjalikke näpunäiteid ja soovitusi eduka ultraheli lüüsi jaoks!

Protokollid E. coli lüsaatide ultraheli abil ettevalmistamiseks

Teadlased kasutavad E.coli rakkude lõhkumiseks Hielscheri ultraheli homogenisaatoreid. Allpool leiate mitmesuguseid testitud ja end tõestanud protokolle E.coli lüüsiks Hielscheri ultraheli homogenisaatoritega erinevate E. coli-ga seotud rakenduste jaoks.

Rakkude kasvatamine, ristsidumine ja E. coli rakuekstraktide ettevalmistamine ultraheli abil

SeqA ja RNA polümeraasi ChIP-Chip jaoks kasvatati E. coli MG1655 või MG1655 ΔseqA temperatuuril 37°C kuni OD₆₀₀ ligikaudu 0,15 juures 50 ml LB-söötmes (+ 0,2% glükoos), enne kui lisati 27 μl formaldehüüdi (37%) ühe ml söötme kohta (lõppkontsentratsioon 1%). Ristsidumine viidi läbi aeglasel loksutamisel (100 rpm) toatemperatuuril 20 min, millele järgnes peatamine 10 ml 2,5 M glütsiiniga (lõppkontsentratsioon 0,5 M). Kuumašoki katsete jaoks kasvatati E. coli MG1655 65 ml LB söötmes temperatuuril 30°C kuni OD₆₀₀ ligikaudu 0,3. Seejärel kanti 30 ml kultuuri eelsoojendatud kolbi temperatuuril 43°C ja ülejäänud osa hoiti temperatuuril 30°C. Ristsidumine ja peatamine toimusid nii, nagu eespool kirjeldatud, välja arvatud see, et rakke hoiti enne edasist aeglast loksutamist toatemperatuuril 5 min temperatuuril 30 või 43°C. Rakud koguti tsentrifuugimisega ja pesti kaks korda külma TBS-iga (pH7.5). Pärast resuspendeerimist 1 ml lüüsipuhvris (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sahharoos, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lüsosüüm) ja inkubeerimist temperatuuril 37°C 30 min, millele järgnes 4 ml IP-puhvri lisamine, töödeldi rakke ultrahelisondiga jääl 12 korda 30 sek ja 30 sek pausidega, kasutades Hielscheri ultraheliprotsessorit UP400St 100% võimsusseadistusel. Pärast tsentrifuugimist 10 min 9000 g juures hoiti supernatandi 800 μl alikvoote temperatuuril -20°C. (Waldminghaus 2010)

Ensüümide üleprodutseerimine ja puhastamine ultrahelisondiga

Dekahistidiiniga (His10) märgistatud valkude üleprodutseerimiseks transformeeriti E. coli BL21(DE3) pET19b konstruktidega. Üleöö eelkultuur koguti tsentrifuugimisega ja 1% kasutati ekspressioonikultuuri inokuleerimiseks. Rakke, mis kandsid pET19mgtB, kasvatati temperatuuril 22°C, kuni optiline tihedus 600 nm juures (OD600) oli 0,7. Kultuur viidi temperatuurile 17°C ja indutseeriti 100 μM IPTG-ga. Pärast 16 h koguti kultuur tsentrifuugimisega kiirusel 7 500 × g temperatuuril 4°C. Rakud resuspendeeriti 50 mM fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS), mis sisaldas 0,3 M NaCl, pH 7,4, ja lõhuti ultrahelitöötlusega S2 mikrotipiga sonotroodi abil Hielscheri ultrahelisondil UP200St tsükliga 0,5 ja amplituudiga 75%.
Dekahistidiiniga märgistatud GtfC üleprodutseerimine indutseeriti temperatuuril 37°C OD₆₀₀ 0,6 juures 100 μM IPTG-ga. Seejärel inkubeeriti rakke 4 h, koguti ja lüüsiti nii, nagu on MgtB puhul eespool öeldud.
Toorrakuekstraktid tsentrifuugiti kiirusel 15 000 × g temperatuuril 4°C, et rakujäänused settida. Selitatud ekstraktid kanti 1-ml HisTrap FF Crude kolonnidele, kasutades ÄKTAprime Plus süsteemi. Ensüümid puhastati tootja protokolli kohaselt His-märgistatud valkude gradientelueerimiseks. Eluteeritud valgulahuseid dialüüsiti kaks korda 1 000 mahu 50 mM PBS vastu, pH 7,4, 0,3 M NaCl-ga temperatuuril 4°C. Puhastamist analüüsiti 12% SDS-PAGE abil. Valgu kontsentratsioon määrati Bradfordi meetodil, kasutades Roti-Quanti. (Rabausch et al. 2013)

Valgu ultraheliekstraktsioon E. coli bakteritest
Huvipakkuv sööt-valk (antud juhul Arabidopsis thaliana MTV1) liidetakse GST-märgisega ja ekspresseeritakse BL21 Escherichia coli (E. coli) rakkudes.

Võtke üks GST-MTV1 ja GST pelletit (vastab 50 ml bakterikultuurile) ning resuspendeerige kumbki 2,5 mL jääkülmas ekstraktsioonipuhvris.
Kasutage ultraheli homogenisaatorit UP100H (varustatud MS3 mikrotipiga sonotroodiga väikeste, ligikaudu 2-5mL mahtude jaoks), et lõhkuda bakterirakke, kuni need on lüüsunud, mida näitavad vähenenud läbipaistmatus ja suurenenud viskoossus. See tuleb teha jääl ning soovitatav on sonikeerida intervallidena (nt 10 sek sonikeerimist, seejärel 10 sek paus jääl jne). Tuleb jälgida, et sonikeerimine ei toimuks liiga suure intensiivsusega. Kui täheldatakse vahutamist või valge sademe teket, tuleb intensiivsust vähendada.
Kandke lüüsunud bakterilahus 1,5 mL mikrotsentrifuugituubidesse ja tsentrifuugige temperatuuril 4°C, 16 000 x g juures 20 min.

Ultraheli sondid kasutavad akustilise kavitatsiooni jõude rakkude lõhkumiseks ning molekulide ja DNA ekstraheerimiseks E.colist.

Sondtüüpi ultrahelitöötlejad, nagu UP400St, kasutavad E.coli efektiivseks lüüsimiseks akustilise kavitatsiooni tööpõhimõtet.

Ekspressioonianalüüs ja rekombinantse valgu puhastamine sonikeerimise abil

E. coli sade töödeldi ultraheliga Hielscheri ultraheli sonikaatoriga UP100H. Selleks suspendeeriti rakusade uuesti jahutatud lüüsipuhvris (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) ja jahutati jääl 10 min. Seejärel sonikeeriti rakususpensiooni 10 lühikese 10 s impulsiga, millele järgnes 30 s jahutusintervall. Lõpuks eemaldati rakujäägid ultratsentrifuugimisega temperatuuril 4°C 15 min jooksul kiirusel 14 000 rpm. rPR ekspressiooni kinnitamiseks kanti supernatant 12% polüakrüülamiidgeelile ning analüüsiti SDS-PAGE ja Western blot meetodil. rPR puhastamine tehti Ni2+-NTA vaigu (Invitrogen, USA) abil vastavalt tootja juhendile. Selles etapis kasutati natiivset puhastusmeetodit. Puhastatud valgu puhtust hinnati elektroforeesiga 12% polüakrüülamiidgeelil ja sellele järgneva Coomassie sinise värvimisega. Puhastatud valgu kontsentratsiooni mõõdeti Micro BCA valgutestikomplektiga (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

See video näitab 200-vatist ultraheliseadet CupHorn laboriproovide dispergeerimiseks, homogeniseerimiseks, ekstraheerimiseks või degaseerimiseks.

Ultraheli homogenisaatorid E. coli lüüsiks

Hielscher Ultrasonics projekteerib, toodab ja tarnib suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid E. coli bakterite ning teiste rakutüüpide, kudede ja rakukultuuride usaldusväärseks ja tõhusaks lüüsiks.
Ultraheli sondide lai valik ning kaudsed sonikeerimissüsteemid võimaldavad meil pakkuda teile ideaalset ultraheli koehomogenisaatorit teie rakkude lõhkumise ja ekstraheerimise rakenduseks.

Projekteerimine, tootmine ja nõustamine – Saksamaal valmistatud kvaliteet

Hielscheri sonikaatorid on tuntud oma kõrgeima kvaliteedi ja disainistandardite poolest. Nutikas tarkvara, intuitiivne menüü, programmeeritavad seaded ja andmete automaatne protokollimine on vaid mõned Hielscheri sonikaatorite omadused. Töökindlus ja lihtne kasutus võimaldavad meie sonikaatorite sujuvat integreerimist uurimis- ja biotehnoloogiaasutustesse. Hielscheri sonikaatorid tulevad kergesti toime ka karmide tingimuste ja nõudlike keskkondadega.

Hielscher Ultrasonics on ISO sertifitseeritud ettevõte ja pöörab erilist tähelepanu suure jõudlusega sonikaatoritele, mis on varustatud tipptehnoloogia ja kasutajasõbralikkusega. Loomulikult vastavad Hielscheri sonikaatorid CE nõuetele ning täidavad UL, CSA ja RoHs nõudeid.

Allolev tabel annab ülevaate meie sonikaatorite ligikaudsest töötlusvõimsusest:

Partii maht	Vooluhulk	Soovitatavad seadmed
multi-well / mikrotiiterplaadid	n.a.	UIP400MTP
CupHorn viaalidele või keeduklaasile	n.a.	Ultraheli CupHorn
ultraheli mikrovoolureaktor	n.a.	GDmini2
kuni 10 viaali mahuga 0,5 kuni 1,5mL	n.a.	VialTweeter
0,5 kuni 1,5mL	n.a.	VialTweeter
1 kuni 500mL	10 kuni 200mL/min	UP100H
10 kuni 2000mL	20 kuni 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1 kuni 20L	0,2 kuni 4L/min	UIP2000hdT
10 kuni 100L	2 kuni 10L/min	UIP4000
n.a.	10 kuni 100L/min	UIP16000
n.a.	suurem	klaster, mis koosneb seadmetest UIP16000

Võtke meiega ühendust! / Küsige meilt!

Video tutvustab proovide ultraheliga ettevalmistamise süsteemi UIP400MTP, mis võimaldab suure intensiivsusega ultraheli abil usaldusväärselt ette valmistada proove kõigil standardsetel mitme süvendiga plaatidel. UIP400MTP tüüpilised kasutusalad on rakkude lüüs, DNA, RNA ja kromatiini fragmenteerimine ning valkude ekstraheerimine.

Täiendavad protokollid E. coli ultraheli lüüsiks

Allitsiiniga modifitseeritud valgud E. coli rakkudes ultraheli seadme VialTweeter abil

Sulfhüdrüülrühmade sisalduse määramine 5,5′-ditiobis(2-nitrobensoehappe) (DTNB) testiga
E. coli MG1655 üleöökultuuri kasutati MOPS minimaalse söötme inokuleerimiseks (1:100). Kultuuri kasvatati aeroobselt, kuni saavutati A600 väärtus 0,4. Kultuur jagati stressiraviks kolmeks 15-ml kultuuriks. Töötlemata kultuur toimis negatiivse kontrollina. Ülejäänud kahest kultuurist lisati ühele 0,79 mM allitsiini (128 μg ml-1) ja teisele 1 mM diamiidi. Kultuure inkubeeriti 15 min. 5 ml igast kultuurist koguti tsentrifuugimisega (8 525 × g, 4°C, 10 min). Rakke pesti kaks korda 1 ml PBS-iga (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, enne kasutamist anaeroobselt hoitud) ja tsentrifuugiti (13 000 × g, 4°C, 10 min). Rakud suspendeeriti uuesti lüüsipuhvris (PBS 6 mM guanidiinium-HCl-iga, pH 7,4) enne lõhkumist temperatuuril 4°C ultraheliga (VialTweeter sonikaator, Hielscher GmbH, Saksamaa) (3 × 1 min). Rakujäägid sadestati tsentrifuugimisega (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant viidi 3,5-ml QS-makroküvetti (10 mm) koos magnetsegajaga ja segati 1 ml lüüsipuhvriga. Proovide ekstinktsiooni jälgiti lainepikkusel 412 nm spektrofotomeetriga Jasco V-650, mis oli varustatud temperatuurikontrollitava küvetihoidjaga PSC-718, toatemperatuuril. Lisati 100μl 3 mM ditiobis(2-nitrobensoehappe) lahust. Ekstinktsiooni jälgiti, kuni see jõudis küllastuseni. Tioolide kontsentratsiooni arvutamisel kasutati ekstinktsioonikoefitsienti ϵ₄₁₂ = 13 700 M^-1 cm^-1 tio-2-nitrobensoehappe (TNB) puhul. Rakusiseste tioolide kontsentratsioonid arvutati E. coli rakkude mahu 6,7 × 10^-15 liitrit ja rakutiheduse A600 = 0,5 alusel (vastab 1 × 10⁸ rakule ml^-1 kultuuri kohta). (Müller et al. 2016)

Glutatiooni määramine in vivo ultraheli rakupurustiga

E.coli MG1655 kasvatati MOPS minimaalsöötmes kogumahus 200ml, kuni A600 jõudis väärtuseni 0,5. Kultuur jagati stressiga töötlemiseks 50-ml kultuurideks. Pärast 15-minutilist inkubeerimist 0,79 mM allitsiini, 1 mM diamiidi või dimetüülsulfoksiidiga (kontroll) koguti rakud tsentrifuugimisega 4 000g juures 4°C 10 min jooksul. Rakke pesti kaks korda KPE puhvriga, enne kui sade suspendeeriti 700µl KPE puhvris. Deproteiniseerimiseks lisati 300l 10% (w/v) sulfosalitsüülhapet, enne kui rakud lõhuti ultraheli töötlusega (3 x 1 min; VialTweeter sonikaator). Supernatandid koguti pärast tsentrifuugimist (30 min, 13 000g, 4°C). Sulfosalitsüülhappe kontsentratsioon vähendati 1%-ni, lisades 3 mahuosa KPE puhvrit. Üldglutatiooni ja GSSG mõõtmised tehti nii, nagu eespool kirjeldatud. Rakusisesed glutatiooni kontsentratsioonid arvutati E. coli rakkude mahu 6,7×10^-15 liitrit ja rakutiheduse A600 0,5 alusel (vastab 1×10⁸ rakule ml^-1 kultuuri kohta). GSH kontsentratsioonid arvutati, lahutades 2[GSSG] üldglutatioonist. (Müller et al. 2016)

Inimese mAspAT ekspressioon E. coli’s ultraheli homogenisaatori abil

Üksik E. coli BL21 (DE3) koloonia, mis kandis ekspressioonivektorit, viidi 30 mL Luria-Bertani (LB) söötmesse, mis sisaldas 100μg/mL ampitsilliini, ning kasvatati seejärel temperatuuril 37ºC, kuni optiline tihedus (OD₆₀₀) jõudis väärtuseni 0,6. Rakud koguti tsentrifuugimisega 4 000 × g juures 10 min ja suspendeeriti 3L värskes LB söötmes, mis sisaldas 100μg/mL ampitsilliini.
Seejärel indutseeriti valgu ekspressioon 1 mM isopropüül-β-ᴅ-1-tiogalaktopüranosiidiga (IPTG) 20 h jooksul temperatuuril 16ºC. Rakud koguti tsentrifuugimisega 8 000 × g juures 15 min ja pesti puhvriga A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Umbes 45g (märgmass) rakke saadi 3 L kultuurist. Pärast tsentrifuugimist suspendeeriti rakusade 40 mL jääkülmas ekstraktsioonipuhvris A (1 L kultuuri kohta) ning lõhuti ultraheli töötlusega jääkülmal temperatuuril, kasutades ultraheli rakupurustit Hielscher UP400St. Rakulüsaati tsentrifuugiti 12 000 rpm juures 15 min, et eraldada lahustuv (supernatant) ja sadestunud (pellet) fraktsioon. (Jiang et al. 2015)

Seotud teemad

Faktid, mida tasub teada

E.coli

Escherichia coli (E. coli) on gramnegatiivne, fakultatiivselt anaeroobne, kepikujuline, koliformne bakter perekonnast Escherichia, mida leidub tavaliselt soojavereliste organismide (endotermide) alumises soolestikus. E. coli tüvesid (ehk alamtüüpe) on suur hulk ja neil on mitmekesised omadused. Enamik E. coli tüvesid on inimestele kahjutud, nt B- ja K-12-tüved, mida kasutatakse laborites sageli uurimistöödeks. Mõned tüved on siiski kahjulikud ja võivad põhjustada rasket haigestumist.
E. coli etendab tänapäevases bioinseneerias ja tööstuslikus mikrobioloogias olulist rolli, kuna bakterit on lihtne manipuleerida. Tavalised laborirakendused, milles E. colit sageli kasutatakse, on näiteks rekombinantse desoksüribonukleiinhappe (DNA) loomine või mudelorganismina toimimine.
E. coli on väga mitmekülgne peremeesorganism heteroloogsete valkude tootmiseks ning rekombinantsete valkude tootmiseks E. colis on saadaval mitmesuguseid valguekspressioonisüsteeme. Plasmiidide abil, mis võimaldavad valgu kõrget ekspressioonitaset, saab geene viia bakteritesse, mis võimaldab selliseid valke toota suurtes kogustes tööstuslikes fermentatsiooniprotsessides.
E. colit kasutatakse rakutehastena insuliini tootmiseks. Muud rakendused hõlmavad modifitseeritud E. coli rakkude kasutamist vaktsiinide ja immobiliseeritud ensüümide väljatöötamiseks ja tootmiseks, biokütuste tootmiseks ning bioremediatsiooniks.
Tüvi K-12 on E. coli mutantne vorm, mis üleekspresseerib ensüümi aluselist fosfataasi (ALP). See mutatsioon tekib defekti tõttu geenis, mis kodeerib ensüümi pidevalt. Kui geen toodab produkti ilma igasuguse inhibeerimiseta, nimetatakse seda konstitutiivseks aktiivsuseks. Seda konkreetset mutantset vormi kasutatakse ALP-ensüümi isoleerimiseks ja puhastamiseks.
E. coli baktereid kasutatakse laialdaselt ka rakutehastena. Rakutehastena saab kasutada muundatud mikroobe (nt baktereid) ja taimerakke. Need geneetiliselt muundatud rakud toodavad molekule, kemikaale, polümeere, valke ja muid aineid, mida kasutatakse näiteks farmaatsia-, toidu- ja keemiatööstuses. Selliste bioinseneeritud rakkude sisemuses toodetud molekulide vabastamiseks on ultraheli lüüs levinud meetod rakuseinte lõhkumiseks ja sihtainete viimiseks ümbritsevasse vedelikku. Loe lähemalt bioinseneeritud rakkude lüüsi kohta!

DNA ultraheli nihestamine

Ultraheli nihkejõud on laialdaselt kasutatav meetod molekulide, organellide ja valkude vabastamiseks raku sisemusest ning DNA ahelate tükeldamiseks. Akustiline kavitatsioon lõhub rakuseinad ja membraanid, et ekstraheerida rakkudest DNA-d ja tekitada ligikaudu 600 – 800 bp pikkuseid fragmente, mis sobivad analüüsiks ideaalselt.
Klõpsake siin, et saada lisateavet DNA fragmenteerimiseks mõeldud ultraheli homogenisaatorite kohta!

Kirjandus / viited

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Suure jõudlusega ultraheli! Hielscheri tootevalik hõlmab kogu spektri kompaktsetest laboratoorsetest ultraheli töötlusseadmetest (sonikaatoritest) lauaseadmeteni ja täismahus tööstuslike ultraheli süsteemideni.

Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid alates laborist kuni tööstusliku mõõtkavani.