E. Coli ultraheli lüüs

• E. coli bakterid on mikrobioloogia ja biotehnoloogia kõige sagedamini kasutatavad bakterid.
• Ultraheliraku häired teevad usaldusväärseid ja reprodutseeritavaid tulemusi E. coli lüüsimiseks.
• Intensiivne, kuid täpselt kontrollitav kavitatsioon ja nihkejõud põhjustavad täieliku häirete ja kõrge ekstraheerimise saagise (nt valgud, DNA).

Rakkude katkestamine cavitation

Ultraheli sondi tüüpi homogenisaatorid töötavad u. 20 000 tsüklit sekundis (20 kHz juures) ja põhjustada kavitatsiooni vedelikes või supressioonides. Akustilise kavitatsiooni mikroskoopilised alad vaakum-tüüpi rõhkude ja kõrgel temperatuuril, et pisarakud lahku. Kuigi temperatuurid võivad ulatuda mitu tuhat kraadi Celsiuse järgi, on kavitatsiooni mahud nii väikesed, et nad protsessi oluliselt ei soojenda. Ultraheli genereeritud akustiline kavitatsioon ja nihkejõud katkestavad E. coli rakumembraani või murravad seda – sõltuvalt ultraheli homogenisaatori seadetest.

Ultraheli lüüsi eelised

• täpne kontroll lüüsi (intensiivsus, amplituud, temperatuur)
• optimaalne kohandamine konkreetsete proovidega
• temperatuuri kontroll
• väga väikeste kuni väga suurte proovide jaoks (μL kuni liitrit)
• puhas mehaaniline puhastus
• lineaarne skaalat alates laborist tootmiseni

Kuigi keemiline ja ensümaatiline lüüs võib olla problemaatiline – kuna keemiline lüüs võib muuta valgu struktuure ja tuua kaasa puhastusprobleeme ja ensümaatiline lüüs nõuab pikki inkubatsiooniaegu ja ei ole reprodutseeritav – ultraheli häired on keerukas, kiire raku katkestusmeetod.
Ultraheli lüüs põhineb ainult mehaanilistel jõududel. Kemikaale ei lisata, ultrahelitöötlus murrab rakuseina nihkejõududega. Keemiline lüüs võib muuta valgu struktuuri ja põhjustada puhastusprobleeme. Ensümaatiline häire nõuab pikki inkubatsiooniaegu ja ei ole reprodutseeritav. E.coli bakterirakkude ultraheli rakkude katkemine on kiire, lihtne, usaldusväärne ja reprodutseeritav. Sellepärast hielscher ultrasonicators kasutatakse bioloogiliste ja biokeemiliste laborite üle maailma proovide ettevalmistamiseks, pre-ananlüütikumid, in vitro diagonstics ja magistraalide analüüsid.

Üldised soovitused

Sonikatsioon on kõige populaarsem tehnika väga väikeste, keskmiste ja suurte rakususpensioonide hulga lüüsimiseks – alates pico-liitritest kuni 100 l / h (kasutades ultraheli voolu raku). Rakud lüüsitakse vedela lõike ja kavitatsiooniga. DNA-d lõigatakse ka ultrahelitöötluse ajal, seega pole rakususpensioonile vaja lisada DNaasi.
Temperatuuri kontroll:
Proovi eeljahutamisel ja proovi hoidmisel ultraheliga töötlemisel jääl võib kergesti vältida proovi temperatuuri halvenemist.
Ideaaljuhul tuleks proove hoida lüüsi ajal jääkülm, kuid enamiku proovide puhul piisab sellest, kui temperatuur ei tõuse kultuuri-või koeallika temperatuurist kõrgemal. Seetõttu on soovitatav hoida suspensioon jääl ja sonikaat mitme lühikese ultraheliga impulsside 5-10 SEK ja peatub 10-30 sek. Pausid ajal võib kuumus hajutada, et taastada madala temperatuuri. Suuremate rakkude proovide puhul on saadaval mitmesugused vooluraku reaktorid jahutusjakiga.

E. coli lüsaatide valmistamise protokollid

Ekspressioonianalüüs ja rekombinantse valgu puhastamine

E. coli graanul töödeldi ultraheli süsteemiga UP100H (Hielscher). Sel eesmärgil resuspendeeriti rakupellet jahutatud lüüsi puhvris (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) ja jahutati jääl 10 minutit. Seejärel töödeldi rakususpensiooni ultraheliga 10 lühikese 10 sekundi jooksul, millele järgnes 30 sekundi pikkune jahutus. Lõpuks eemaldati rakujäägid ultratsentrifuugimisega temperatuuril 4 ° C 15 minutit kiirusega 14000 p / min. RPR ekspressiooni kinnitamiseks viidi supernatant 12% polüakrüülamiidgeele ja analüüsiti SDS-PAGE ja Western blotting abil. RPR puhastamine teostati Ni abil²⁺-NTA vaik (Invitrogen, USA) vastavalt tootja juhendile. Selles etapis kasutati puhastamismeetodit. Puhastatud valgu puhtust hinnati elektroforeesiga 12% polüakrüülamiidgeelil ja sellele järgnenud Coomassie sinise värvusega. Puhastatud valgu kontsentratsioon mõõdeti Micro BCA valgu analüüsi komplektiga (PIERCE, USA). (Azarnezhad jt, 2016)

Rakkude kasv, ristsidumine ja E. coli rakuekstraktide valmistamine

SeqA ja RNA polümeraasi ChIP-kiibi E. coli MG1655 või MG1655 ΔseqA kasvatati temperatuuril 37 ° C OD₆₀₀ ligikaudu 0,15 ml 50 ml LB-s (+ 0,2% glükoos), lisati 27 ui formaldehüüdi (37%) ml kohta (lõppkontsentratsioon 1%). Crosslinking viidi läbi aeglaselt loksutades (100 pööret minutis) toatemperatuuril 20 minutit, millele järgnes 10 ml 2,5 M glütsiini (lõplik kontsentratsioon 0,5 M) karastamist. Kuumakatsete eksperimentide korral kasvatati E. coli MG1655 65 ml LB söötmes 30 ° C juures OD-ga₆₀₀ umbes 0,3. Seejärel viidi 30 ml kultuurid eelsoojendatud kolbi temperatuuril 43 ° C ja ülejäänu hoiti 30 ° C juures. Ristsildamine ja kustutamine toimus nagu eespool kirjeldatud, välja arvatud see, et rakke hoiti 5 minutit temperatuuril 30 või 43 ° C ja toatemperatuuril veel aeglaselt raputades. Rakud koguti tsentrifuugimisega ja pesti kaks korda külma TBS-ga (pH 7,5). Pärast resuspendeerimist 1 ml lüüsipuhvris (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sahharoos, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lüsosüümi) ja inkubeerimist 37 ° C juures 30 minutit, millele järgnes 4 ml IP puhver, rakke töödeldi ultraheliga jääl, 12 korda 30 sekundit ja 30 sekundit katkestas UP400St 100% võimsusega ultraheli protsessor (Hielscher Ultrasonics GmbH). Pärast tsentrifuugimist 10 min jooksul 9000 g juures säilitati supernatandi alikvoot 800 μl temperatuuril -20 ° C. (Waldminghaus 2010)

Ensüümide ületootmine ja puhastamine.

Dekahistidiini (His10) -tagitud valkude üleproduktsiooniks transformeeriti E. coli BL21 (DE3) pET19b konstruktidega. Üleöö eelkultuur koguti tsentrifuugimisega ja ekspressioonikultuuri inokuleerimiseks kasutati 1%. Rakke, mis sisaldasid pET19mgtB, kasvatati temperatuuril 22 ° C, kuni optilise tihedusega 600 nm (OD₆₀₀) 0,7. Kultuur viidi 17 ° C-ni ja indutseeriti 100 uM IPTG-ga. 16 tunni pärast koguti kultuur, tsentrifuugides kiirusel 7 500 × g 4 ° C juures. Rakud resuspendeeriti 50 mM fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS) koos 0,3 M NaCl-ga pH 7,4 juures ja häiritud ultraheliga S2 mikro-otsa sonotrodega UP200St ultraheligaator (Hielscher, Teltow, Saksamaa) tsüklis 0,5 ja amplituudiga 75%.
Dekahistidiini märgistatud GtfC ületootmine indutseeriti 37 ° C juures OD-ga₆₀₀ 0,6, kasutades 100 uM IPTG-d. Seejärel rakke inkubeeriti 4 tundi, koristati ja lüüsiti, nagu eespool MgtB puhul kirjeldatud.
Toorrakkude ekstrakte tsentrifuugiti 15 000 x g ja 4 ° C juures rakkude praht. Selgitavad ekstraktid laaditi 1-ml HisTrap FF Toorpeale kasutades ÄKTAprime Plus süsteemi (GE Healthcare). Ensüümid puhastati vastavalt tootja protokollile His-märgistatud valkude gradient-elueerimisele. Elueeritud valkude lahuseid dialüüsiti kaks korda 1000 mahuga 50 mM PBS-i, pH 7,4, 0,3 M NaCl-ga 4 ° C juures. Puhastamist analüüsiti 12% SDS-PAGE abil. Valgu kontsentratsioon määrati Bradfordi meetodil, kasutades Roti-Quanti (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Saksamaa). (Rabausch jt, 2013)

Proteiini ekstraheerimine E. coli bakteritest
Huvipakkuv suhkruvalk (käesoleval juhul, Arabidopsis thaliana MTV1) on sulatatud GST-märgisega ja ekspresseeritakse BL21 Escherichia coli (E. coli) rakkudes.
1. Võta üks GST-MTV1 ja GST graanul (vastab 50 ml bakterikultuurile) ja resuspendeerige need 2,5 ml jääkülma ekstraheerimispuhvriga.
2. Kasutage ultrasonikaatorit UP100H (varustatud MS3 mikrotiip-sonotrodega väikestes kogustes (2-5 ml)), et katkestada bakterirakud kuni nende lüüsimiseni, mida näitab väiksem läbipaistmatus ja suurenenud viskoossus. Seda tuleb teha jääl ja on soovitatav sonikeerida intervallidega (nt. 10 sekundi pikkune heinat, seejärel 10 sekundit jääl jms). Tuleb hoolitseda selle eest, et ultraviolettkiirgust ei teki liiga intensiivselt. Kui tuvastatakse vahustamine või valge sade moodustumine, tuleb intensiivsust alandada.
3. Lüüsitud bakteri lahus viiakse 1,5 ml mikrotsentrifuugi tuubidesse ja tsentrifuugitakse 4 ° C juures, 16 000 xg 20 minutit.

Allicini modifitseeritud valgud E. coli-s

Sulfhüdriili sisalduse määramine 5,5'-dithiobis (2-nitrobensoehape) (DTNB) määramine
MOPS-i minimaalse keskkonna (1: 100) inokuleerimiseks kasutati üleöö kultiveeritud E. coli MG1655. Kultuuri kasvatati aeroobselt, kuni saavutati A600 väärtuseks 0,4. Stressitöötlemiseks jagati kultuur kolmeks 15-milliliitriks kultuuriks. Puhastamata kultuur oli negatiivne kontroll. 0,79 mM allitsiini (128 ug / ml)^-1) või 1 mM diamiidi lisati mõlemale järelejäänud kahest kultuurist. Kultuure inkubeeriti 15 minutit. 5 ml igast kultuurist koguti tsentrifuugimisega (8,525 x g, 4 ° C, 10 min). Rakke pesti kaks korda 1 ml PBS-iga (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7,4, säilitatud enne kasutamist anaeroobselt) ja tsentrifuugiti (13 000 x g, 4 ° C, 10 min). Rakud resuspendeeriti lüüsipuhvris (PBS 6 mM guanidiinium-HCI-ga, pH 7,4) enne häireid temperatuuril 4 ° C ultraheliga (VialTweeter ultrasonikaator, Hielscher GmbH, Saksamaa) (3 x 1 min). Rakkude praht granuleeriti tsentrifuugimisega (13000 x g, 4 ° C, 15 min). Supernatant viidi magnetsegamisvardaga 3,5 ml QS-makro küveti (10 mm) ja segati 1 ml lüüsipuhvriga. Proovide kustutamist jälgiti 412 nm juures Jasco V-650 spektrofotomeetriga, mis oli varustatud toatemperatuuril PSC-718 temperatuuri kontrollitud rakkude hoidjaga (Jasco). Lisati 100 ui 3 mM ditiobis (2-nitrobensoehappe) lahust. Hävitamist jälgiti, kuni see jõudis küllastumiseni. Tiooli kontsentratsiooni arvutamine teostati, kasutades ekstinktsioonitegurit ε₄₁₂ = 13 700 M^-1 cm^-1 tio-2-nitrobensoehappe (TNB) jaoks. Rakulised tiooli kontsentratsioonid arvutati, võttes aluseks E. coli rakkude koguse 6,7 × 10^-15 liiter ja A-raku tihedus₆₀₀ = 0,5 (vastab 1 × 10⁸ rakud milliliitrites^-1 kultuur). (Müller jt, 2016)

In vivo glutatiooni määramine

E.coli MG1655 kasvatati MOPS minimaalses keskkonnas kogumahus 200 ml kuni A₆₀₀ 0,5-st. Stressitöötlemiseks jaotati kultuur 50-ml kultuurideks. Pärast 15 min inkubeerimist 0,79 mM allitsiini, 1 mM diamiidi või dimetüülsulfoksiidiga (kontroll) rakud koguti 4000 g juures 4 ° C juures 10 minutit. Rakke pesti kaks korda KPE puhvriga enne granule resuspensiooni 700 ui KPE puhvris. Deprotekteerimise eesmärgil lisati enne rakkude katkestamist ultraheliuuringuga (3 x 1 min; 300 μl 10% (mass / maht)) sulfosalitsüülhapet; VialTweeter ultraheligaator). Supernatandid koguti pärast tsentrifuugimist (30 minutit, 13 000 g, 4 ° C). Sulfosalitsüülhappe kontsentratsioonid vähenesid 1% ulatuses, lisades 3 mahtu KPE puhvrit. Kogu-glutatiooni ja GSSG mõõtmised viidi läbi nagu eespool kirjeldatud. Rakulised glutatiooni kontsentratsioonid arvutati, võttes aluseks E. coli rakkude koguse 6,7×10^-15 liiter ja A-raku tihedus₆₀₀ 0.5 (vastab 1×10⁸ rakud milliliitrites^-1 kultuur). GSH kontsentratsioonid arvutati, lahutades 2 [GSSG] kogu glutatioonist. (Müller jt, 2016)