E. Coli ultraheli lüüs

  • E. coli bakterid on mikrobioloogia ja biotehnoloogia kõige sagedamini kasutatavad bakterid.
  • Ultraheliraku häired teevad usaldusväärseid ja reprodutseeritavaid tulemusi E. coli lüüsimiseks.
  • Intensiivne, kuid täpselt kontrollitav kavitatsioon ja nihkejõud põhjustavad täieliku häirete ja kõrge ekstraheerimise saagise (nt valgud, DNA).

Miks on E. coli ultraheli rakkude häirimine eelistatud meetod?

Ultraheli homogenisaatorid või sondi tüüpi ultrasonikaatorid pakuvad E. coli lüüsi jaoks mitmeid eeliseid, kuna intensiivne ultraheli häirib tõhusalt rakuseinu ja membraane. Sondi tüüpi ultrasonikaatoreid kasutatakse laialdaselt E. coli lüüsi jaoks järgmistel põhjustel:

  • Rakuseinte tõhus katkestamine: E. colil on peptidoglükaanist koosnev pooljäik rakusein, mida võib traditsiooniliste lüüsimeetoditega olla raske murda. Sondi tüüpi ultrasonikaator tekitab intensiivseid ultraheli laineid, mis tekitavad rakke ümbritsevas vedelikus kavitatsioonimulle. Kui need mullid kokku varisevad, tekitavad nad kiireid vedelikujoad ja lööklaineid, mille tulemuseks on rakuseinte mehaanilised häired, vabastades tõhusalt rakusisu, näiteks biomolekulid.
  • Suurem levik: Sondi / sonotrode tekitatud ultraheli lained võivad tungida sügavale proovi, jõudes suurema arvu E. coli rakkudeni ja töödeldes neid ühtlaselt. See aitab tagada, et lüüs on kogu proovis ühtlasem, mille tulemuseks on suurem rakkude katkestamise efektiivsus.
  • Vähendatud töötlemisaeg: Sondi tüüpi ultrasonikaatori poolt tarnitud energia on väga kontsentreeritud ja lokaliseeritud, mis viib kiire ja tõhusa rakkude lüüsini. Võrreldes teiste meetoditega, nagu helmeste peksmine või ensümaatiline lüüs, võib ultrahelitöötlus saavutada E. coli lüüsi mõne minuti või isegi sekundi jooksul. Kuigi paljud alternatiivsed tehnikad, nagu külmsulatamine, nõuavad mitut raviringi, avab ultraheli lüüs rakud ühes protsessietapis.
  • Temperatuuri kontroll: Tipptasemel ultrasonikaatorid on varustatud temperatuuriandurite ja nutika tarkvaraga, mis võimaldab seada maksimaalse protsessi temperatuuri. Ultrasonikaator peatub automaatselt, kui temperatuuri piir on saavutatud ja käivitab ultrahelitöötlusprotsessi, kui saavutatakse seatud temperatuuripunkt. Proovide jahutamine jäävannis on lihtne meetod proovi temperatuuri madalal hoidmiseks ja kuumusest tingitud proovi lagunemise vältimiseks.
  • Skaleeritavus: Sondi tüüpi ultrasonikaatorid on saadaval erinevates suurustes, alates pihuseadmetest kuni suuremahuliste tööstusmudeliteni. See muudab need sobivaks väikeste koguste töötlemiseks laboris või suuremate biotöötlusrakenduste jaoks, nt vaktsiinide tootmiseks või molekulide biosünteesiks.
  • Mitmekülgsus: Ultrasonikaatoreid saab kasutada mitmesugustes rakendustes peale rakulüüsi, nagu DNA lõikamine, valgu ekstraheerimine, koe homogeniseerimine, nanoosakeste dispersioon ja emulgeerimine. Seetõttu tagab sondi tüüpi ultrasonikaatorisse investeerimine mitmekülgsuse uurimis- või tööstuskeskkonnas.
  • Sondi tüüpi ultrasonikaatorid nagu UP200St on usaldusväärsed koe homogenisaatorid ja rakupurustid, seetõttu kasutatakse neid laialdaselt proovide ettevalmistamiseks geneetikas, nt E.coli lüüsi jaoks

    Valgu ekstraheerimine E.coli rakkudest toimub tõhusalt ultraheli sond UP200St

    Sondi tüüpi ultrasonikaator pakub E. coli lüüsile palju eeliseid. Usaldusväärne ja täpne kontroll ultraheli protsessi parameetrite üle võimaldab soovitud tulemuste saavutamiseks optimeerida tööparameetreid, nagu võimsus, kestus ja proovide käitlemine.
     

    Infonõue




    Pange tähele, et meie Privaatsuspoliitika.


     

    See õpetus selgitab, millist tüüpi sonikaator sobib kõige paremini teie proovide ettevalmistamise ülesannete jaoks, nagu lüüs, rakkude katkestamine, valkude eraldamine, DNA ja RNA killustumine laborites, analüüs ja uuringud. Valige oma rakenduse, proovi mahu, proovi numbri ja läbilaskevõime jaoks ideaalne sonikaatori tüüp. Hielscher Ultrasonicsil on teile ideaalne ultraheli homogenisaator!

    Kuidas leida täiuslik sonikaator rakkude katkestamiseks ja valkude ekstraheerimiseks teaduses ja analüüsis

    Video pisipilt

    Ultraheli DNA killustatust kasutatakse sageli proovi valmistamise sammuna järgmise põlvkonna sekveneerimisel (NGS)

    E. coli EDL933 genoomse DNA elektroforeetilised analüüsid, millele tehti 0 – 15 min ultraheli. L tähistab DNA redelit.
    (uuring ja pilt: ©Basselet et al. 2008)

    Rakkude katkestamine ultraheli kavitatsiooni abil

    Ultraheli sondi tüüpi homogenisaatorid töötavad umbes 20 000 tsükliga sekundis (20 kHz juures) ja põhjustavad kavitatsiooni vedelikes või suspensioonides. Akustiline kavitatsioon mikroskoopilised vaakumilaadsete rõhkude ja kõrgete temperatuuride piirkonnad, mis rebivad rakud laiali. Kuigi temperatuur võib ulatuda mitme tuhande kraadini Celsiuse järgi, on kavitatsioonimahud nii väikesed, et need ei soojenda protsessi oluliselt. Ultraheli genereeris akustilise kavitatsiooni ja nihkejõud perforeerivad või purustavad bakterirakkude, näiteks E.coli rakumembraani. Hielscheri ultrasonikaatorid võimaldavad täpset kontrolli protsessi parameetrite üle, nagu ultraheli intensiivsus, amplituud, energiasisend ja temperatuur. Seega saab ultraheli lüüsiprotsessi optimaalselt kohandada vastavalt rakutüübile, rakukultuurile ja protsessi eesmärgile.
     

    Ultraheli lüüsi eelised

    • täpne kontroll lüüsi (intensiivsus, amplituud, temperatuur)
    • usaldusväärsed, reprodutseeritavad tulemused
    • optimaalne kohandamine konkreetsete proovidega
    • temperatuuri kontroll
    • väga väikeste kuni väga suurte proovide jaoks (μL kuni liitrit)
    • Puhtmehaaniline töötlemine
    • kasutajasõbralik ja ohutu kasutamine
    • lineaarne skaalat alates laborist tootmiseni
    Ultraheli seade VialTweeter võimaldab üheaegselt proove ette valmistada kuni 10 viaali samade protsessitingimuste juures. (Klõpsa suurendamiseks!)

    VialTweeter ultrahelilüüsi jaoks

    Infonõue




    Pange tähele, et meie Privaatsuspoliitika.


    Ultraheli homogenisaator vs muud lüüsimeetodid

    Kuigi keemiline ja ensümaatiline lüüs võib olla problemaatiline – kuna keemiline lüüs võib muuta valgu struktuure ja tuua kaasa puhastusprobleeme ja ensümaatiline lüüs nõuab pikki inkubatsiooniaegu ja ei ole reprodutseeritav – ultraheli häired on keerukas, kiire raku katkestusmeetod.
    Ultraheli lüüs põhineb ainult mehaanilistel jõududel. Kemikaale ei lisata, ultrahelitöötlus purustab rakuseina nihkejõududega. Keemiline lüüs võib muuta valgu struktuuri ja tekitada puhastusprobleeme. Ensümaatiline katkestus nõuab pikka inkubatsiooniaega ja ei ole reprodutseeritav. E.coli bakterirakkude ultraheli rakkude katkestamine on kiire, lihtne, usaldusväärne ja reprodutseeritav. Sellepärast kasutatakse Hielscheri ultrasonikaatoreid bioloogilistes ja biokeemilistes laborites üle maailma proovide ettevalmistamiseks, eel-ananlüütikumideks, in vitro diagonstikaks ja mitmekülgseteks analüüsideks.

    Ultraheli lüüsi üldised soovitused

    Sonikatsioon on kõige populaarsem tehnika väga väikeste, keskmiste ja suurte rakususpensioonide hulga lüüsimiseks – alates pico-liitritest kuni 100 l / h (kasutades ultraheli voolu raku). Rakud lüüsitakse vedela lõike ja kavitatsiooniga. DNA-d lõigatakse ka ultrahelitöötluse ajal, seega pole rakususpensioonile vaja lisada DNaasi.
     

    Temperatuuri reguleerimine ultraheli E.coli lüüsi ajal
    Ultraheli rakkude katkestaja UP100H (100W) rakkude katkestamiseks ja taimeühendite ekstraheerimiseks.Proovi eeljahutamisel ja proovi hoidmisel ultraheliga töötlemisel jääl võib kergesti vältida proovi temperatuuri halvenemist.
    Ideaaljuhul tuleks proove lüüsi ajal hoida jääkülmana, kuid enamiku proovide puhul piisab, kui temperatuur ei tõuse üle kultuuri või koeallika temperatuuri. Seetõttu on soovitatav hoida suspensiooni jääl ja sonikeerida mitme lühikese ultraheli impulsiga 5-10 sek ja pausidega 10-30 sek. Pauside ajal võib soojus hajuda, et taastada madal temperatuur. Suuremate rakuproovide jaoks on saadaval erinevad jahutussärkidega voolurakureaktorid.
    Loe siit üksikasjalikke näpunäiteid ja soovitusi edukaks ultraheli lüüsiks!

    E. coli lüsaatide ultraheli valmistamise protokollid

    Teadlased kasutavad Hielscheri ultraheli homogenisaatoreid E.coli rakkude katkestamiseks. Allpool leiate erinevaid testitud ja tõestatud protokolle E.coli lüüsi jaoks, kasutades Hielscheri ultraheli homogenisaatoreid erinevate E. coli seotud rakenduste jaoks.
     

    See videoklipp näitab Hielscheri ultraheli homogenisaatorit UP100H, ultrasonikaatorit, mida kasutatakse laialdaselt proovide ettevalmistamiseks laborites.

    Ultraheli homogenisaator UP100H

    Video pisipilt

    Rakkude kasv, ristsidumine ja E. coli rakuekstraktide valmistamine ultraheli abil

    SeqA ja RNA polümeraasi ChIP-kiibi E. coli MG1655 või MG1655 ΔseqA kasvatati temperatuuril 37 ° C OD600 ligikaudu 0,15 ml 50 ml LB-s (+ 0,2% glükoos), lisati 27 ui formaldehüüdi (37%) ml kohta (lõppkontsentratsioon 1%). Crosslinking viidi läbi aeglaselt loksutades (100 pööret minutis) toatemperatuuril 20 minutit, millele järgnes 10 ml 2,5 M glütsiini (lõplik kontsentratsioon 0,5 M) karastamist. Kuumakatsete eksperimentide korral kasvatati E. coli MG1655 65 ml LB söötmes 30 ° C juures OD-ga600 umbes 0,3. Seejärel viidi 30 ml kultuuri eelsoojendatud kolbi temperatuuril 43 °C ja ülejäänut hoiti temperatuuril 30 °C. Ristsidumine ja kustutamine toimus nii, nagu eespool kirjeldatud, välja arvatud see, et rakke hoiti 5 minutit temperatuuril 30 või 43 °C, enne kui neid toatemperatuuril aeglaselt loksutati. Rakud koguti tsentrifuugimise teel ja pesti kaks korda külma TBS-iga (pH 7,5). Pärast resuspensiooni 1 ml lüüsipuhvris (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sahharoosi, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lüsosüümi) ja inkubeerimist 37 °C juures 30 minutit, millele järgnes 4 ml IP puhvri lisamine, töödeldi rakke jääl 12 korda 30 sekundi ja 30 sekundi vaheaegadega, kasutades Hielscheri ultraheli protsessorit UP400St 100% võimsuse seadistusega. Pärast tsentrifuugimist 10 minutit 9000 g juures säilitati -20 °C juures 800 μl supernatandi alikvoote. (Waldminghaus 2010)
     

    Ensüümide ületootmine ja puhastamine ultraheli sondiga

    Ultrasonicator UP100H on labori homogeniseerija, mida sageli kasutatakse rakukultuuri plaatide proovide ettevalmistamiseks.Dekahistidiini (His10)-märgistatud valkude ületootmiseks muundati E. coli BL21(DE3) pET19b konstruktsioonidega. Üleöö eelkultuur koguti tsentrifuugimise teel ja 1% kasutati ekspressioonikultuuri inokuleerimiseks. PET19mgtB-d kandvaid rakke kasvatati 22 °C juures, kuni optiline tihedus 600 nm juures (OD600) oli 0,7. Kultuur viidi üle temperatuurini 17 °C ja indutseeriti 100 μM IPTG-ga. 16 tunni pärast koguti kultuur tsentrifuugimise teel 7 500 × g juures 4 °C juures. Rakud resuspendeeriti 50 mM fosfaatpuhvri lisandiga soolalahuses (PBS) 0,3 M NaCl-ga pH 7,4 juures ja katkestati ultraheliga S2 mikro-otsa sonotrode juures Hielscheri ultrasonikaatoris UP200St tsükliga 0,5 ja amplituudiga 75%.
    Dekahistidiini märgistatud GtfC ületootmine indutseeriti 37 ° C juures OD-ga600 0,6, kasutades 100 uM IPTG-d. Seejärel rakke inkubeeriti 4 tundi, koristati ja lüüsiti, nagu eespool MgtB puhul kirjeldatud.
    Toorrakuekstraktid tsentrifuugiti 15 000 × g ja 4 °C juures, et settida rakujäätmeid. Selitatud ekstraktid laaditi 1 ml HisTrap FF Crude kolonnidesse, kasutades ÄKTAprime Plus süsteemi. Ensüümid puhastati vastavalt tootja protokollile Tema märgistatud valkude gradiendi elueerimiseks. Elueeritud valgulahuseid dialüüsiti kaks korda 1,000 mahuosa 50 mM fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega, pH 7,4, 0,3 M NaCl-ga 4 °C juures. Puhastamist analüüsis 12% SDS-PAGE. Valgu kontsentratsioon määrati Bradfordi meetodil, kasutades Roti-Quanti. (Rabausch et al. 2013)
     

    E. coli bakterite valgu ultraheli ekstraheerimine
    Huvipakkuv suhkruvalk (käesoleval juhul, Arabidopsis thaliana MTV1) on sulatatud GST-märgisega ja ekspresseeritakse BL21 Escherichia coli (E. coli) rakkudes.

    1. Võetakse üks GST-MTV1 ja GST pellet (mis vastab 50 ml bakterikultuurile) ja suspendeeritakse uuesti 2,5 ml jääkülma ekstraheerimise puhvris.
    2. Kasutage ultrasonikaatorit UP100H (varustatud MS3 mikrotip-sonotrode'iga väikeste koguste jaoks umbes 2-5 ml), et häirida bakterirakke, kuni need on lüüsitud, mida näitab vähenenud läbipaistmatus ja suurenenud viskoossus. See tuleb läbi viia jääl ja soovitatav on sonikeerida intervallidega (nt 10 sek ultraheliga töötlemine, millele järgneb 10-sekundiline paus jääl ja nii edasi). Tuleb olla ettevaatlik, et mitte liiga kõrge intensiivsusega ultraheliga sonikeerida. Kui tuvastatakse vahutamine või valge sademe moodustumine, tuleb intensiivsust vähendada.
    3. Lüüsitud bakterite lahus viiakse 1,5 ml mikrotsentrifuugiküvettidesse ja tsentrifuugitakse 4 °C juures, 16 000 x g 20 minutit.

     

    Ultraheli sondid kasutavad akustilise kavitatsiooni jõude raku häirimiseks ning molekulide ja DNA eraldamiseks E.coli-st.

    Sondi tüüpi ultrasonikaatorid nagu UP400St E.coli tõhusaks lüüsimiseks kasutatakse akustilise kavitatsiooni tööpõhimõtet.

    Rekombinantse valgu ekspressioonianalüüs ja puhastamine ultrahelitöötluse abil

    E. coli pellet töödeldi ultraheliga Hielscheri ultrasonikaatoriga UP100H. Selleks resuspendeeriti rakupellet jahutatud lüüsipuhvris (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) ja jahutati jääl 10 minutit. Seejärel töödeldi rakususpensiooni ultraheliga 10 lühikese 10-sekundilise purunemisega, millele järgnes jahutamiseks intervall 30 s. Lõpuks eemaldati rakujäätmed ultratsentrifuugimisega 4 ° C juures 15 minutit kiirusel 14000 pööret minutis. rPR-ekspressiooni kinnitamiseks kasutati supernatanti 12% polüakrüülamiidgeeliga ning analüüsiti SDS-PAGE ja Western blot-meetodil. rPR-i puhastamine toimus Ni2+-NTA vaigu (Invitrogen, USA) abil vastavalt tootja juhendile. Selles etapis kasutati natiivset puhastusmeetodit. Puhastatud valgu puhtust hinnati elektroforeesi abil 12% polüakrüülamiidgeelil ja sellele järgnenud Coomassie sinisel värvimisel. Puhastatud valgu kontsentratsiooni mõõdeti Micro BCA valguanalüüsi komplektiga (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)
     

    See video näitab 200 vatti ultraheli kuppelsarve laboriproovide hajutamiseks, homogeniseerimiseks, ekstraheerimiseks või degaseerimiseks.

    Ultraheli cuphorn (200 vatti)

    Video pisipilt

    Ultraheli homogenisaatorid E. coli lüüsi jaoks

    Hielscher Ultrasonics projekteerib, toodab ja tarnib suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid E. coli bakterite ja teiste rakutüüpide, kudede ja rakukultuuride usaldusväärseks ja tõhusaks lüüsiks.
    Ultraheli sondide lai portfell ja kaudsed ultrahelitöötlussüsteemid võimaldavad meil pakkuda teile ideaalset ultraheli koe homogenisaatorit teie rakkude katkestamise ja ekstraheerimise rakenduse jaoks.

    Disain, tootmine ja nõustamine – Kvaliteet Valmistatud Saksamaal

    Hielscheri ultraheliatoreid saab brauseri juhtimise kaudu kaugjuhtida. Ultrahelitöötlusparameetreid saab jälgida ja kohandada täpselt protsessi nõuetele.Hielscheri ultrasonikaatorid on tuntud oma kõrgeimate kvaliteedi- ja disainistandardite poolest. Nutikas tarkvara, intuitiivne menüü, programmeeritavad seaded ja automaatne andmete protokollimine on vaid mõned Hielscheri ultrasonikaatorite funktsioonid. Töökindlus ja lihtne kasutamine võimaldavad meie ultrasonikaatorite sujuvat integreerimist uurimis- ja biotehnoloogiarajatistesse. Isegi karmid tingimused ja nõudlikud keskkonnad on Hielscheri ultrasonikaatorite poolt kergesti käsitsetavad.

    Hielscher Ultrasonics on ISO sertifitseeritud ettevõte ja paneb erilist rõhku suure jõudlusega ultrasonikaatoritele, millel on tipptasemel tehnoloogia ja kasutajasõbralikkus. Loomulikult on Hielscheri ultrasonikaatorid CE-nõuetele vastavad ja vastavad UL, CSA ja RoHs nõuetele.

    Alljärgnev tabel annab teile ülevaate meie ultrahelihitiste ligikaudse töötlemisvõimsusest:

    partii Köide flow Rate Soovitatavad seadmed
    mitme kaevu / mikrotiiterplaadid e.k. Led, mida sa ei pea booking.com-i külastajaid vastu
    CupHorn viaalide või keeduklaasi jaoks e.k. Ultraheli kastanahk
    Ultraheli mikrovoolu reaktor e.k. GDmini2
    kuni 10 viaali 0,5 kuni 1,5 ml lahusega e.k. VialTweeter
    0.5 kuni 1,5 ml e.k. VialTweeter
    1 kuni 500 ml 10 kuni 200 ml / min UP100H
    10 kuni 2000 ml 20 kuni 400 ml / min Uf200 ः t, UP400St
    0.1 kuni 20 l 0.2 kuni 4 l / min UIP2000hdT
    10 kuni 100 l 2 kuni 10 l / min UIP4000
    e.k. 10 kuni 100 l / min UIP16000
    e.k. suurem klastri UIP16000

    Võta meiega ühendust! / Küsi meiega!

    Küsige lisateavet

    Palun kasutage allolevat vormi, et taotleda lisateavet ultraheli koe homogenisaatorite ja rakupurustite, lüüsirakenduste ja hindade kohta. Meil on hea meel arutada teie protsessi teiega ja pakkuda teile ultraheli homogenisaatorit, mis vastab teie nõuetele!









    Palun pange tähele, et meie Privaatsuspoliitika.


    Video näitab ultraheli proovi ettevalmistamise süsteemi UIP400MTP, mis võimaldab usaldusväärset proovi ettevalmistamist mis tahes standardse mitme kaevu plaadiga, kasutades suure intensiivsusega ultraheli. UIP400MTP tüüpilised rakendused hõlmavad rakkude lüüsi, DNA-d, RNA-d ja kromatiini lõikamist ning valkude ekstraheerimist.

    Ultrasonikaator UIP400MTP multi-well plaadi ultrahelitöötluseks

    Video pisipilt

    Ultraheli E. coli lüüsi lisaprotokollid

    Allitsiiniga modifitseeritud valgud E. colis, kasutades ultraheli VialTweeterit

    VialTweeter ultraheliprotsessoris UP200STSulfhüdriili sisalduse määramine 5,5'-dithiobis (2-nitrobensoehape) (DTNB) määramine
    Mopsi minimaalse söötme (1:100) inokuleerimiseks kasutati E. coli MG1655 öökultuuri. Kultuuri kasvatati aeroobselt, kuni saavutati A600 0, 4. Kultuur jagati stressiraviks kolmeks 15 ml kultuuriks. Töötlemata kultuur toimis negatiivse kontrollina. Ühele ülejäänud kahest kultuurist lisati 0,79 mM allitsiini (128 μg ml-1) või 1 mM diamiidi. Kultuure inkubeeriti 15 minutit, 5 ml igast kultuurist koguti tsentrifuugimise teel (8,525 × g, 4 °C, 10 minutit). Rakke pesti kaks korda 1 ml fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, säilitati enne kasutamist anaeroobselt) ja tsentrifuugiti (13 000 × g, 4 °C, 10 min). Rakud resuspendeeriti lüüsipuhvris (fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahus 6 mM guanidiiniumHCl-ga, pH 7,4) enne 4 ° C juures ultraheliga katkestamist (VialTweeter ultrasonikaator, Hielscher GmbH, Saksamaa) (3 × 1 min). Rakujäätmed granuleeriti tsentrifuugimise teel (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant kanti magnetsegamisvardaga 3,5 ml QS-makroküvetile (10 mm) ja segati 1 ml lüüsipuhvriga. Proovide ekstinktsiooni jälgiti 412 nm juures Jasco V-650 spektrofotomeetriga, mis oli varustatud PSC-718 reguleeritava temperatuuriga kambrihoidjaga toatemperatuuril. Lisati 100 μl 3 mM ditiobis(2-nitrobensoehape) lahust. Väljasuremist jälgiti, kuni see saavutas küllastumise. Tiooli kontsentratsiooni arvutamiseks kasutati ekstinktsioonitegurit ε412 = 13 700 M-1 cm-1 tio-2-nitrobensoehappe (TNB) jaoks. Rakulised tiooli kontsentratsioonid arvutati, võttes aluseks E. coli rakkude koguse 6,7 × 10-15 liiter ja raku tihedus A600 = 0, 5 (vastab 1 × 10-le8 rakud milliliitrites-1 kultuur). (Müller jt, 2016)
     

    In vivo glutatiooni määramine ultraheli rakupurusti abil

    E.coli MG1655 kasvatati MOPS-i minimaalses söötmes kogumahus 200ml, kuni saavutati A600 0,5. Kultuur jagati stressiraviks 50 ml kultuurideks. Pärast 15-minutilist inkubeerimist 0,79 mM allitsiini, 1 mM diamiidi või dimetüülsulfoksiidiga (kontroll) koguti rakud 4,000 g juures 4 °C juures 10 minutit. Rakke pesti kaks korda KPE puhvriga enne graanulite resuspensiooni 700 μl KPE puhvris. Deproteiinimiseks lisati 300 l 10% (w / v) sulfosalitsüülhapet enne rakkude katkestamist ultraheliga (3 x 1 min; VialTweeter ultraheligaator). Supernatandid koguti pärast tsentrifuugimist (30 minutit, 13 000 g, 4 ° C). Sulfosalitsüülhappe kontsentratsioonid vähenesid 1% ulatuses, lisades 3 mahtu KPE puhvrit. Kogu-glutatiooni ja GSSG mõõtmised viidi läbi nagu eespool kirjeldatud. Rakulised glutatiooni kontsentratsioonid arvutati, võttes aluseks E. coli rakkude koguse 6,7×10-15 liiter ja raku tihedus A600 0,5 (vastab 1-le×108 rakud milliliitrites-1 kultuur). GSH kontsentratsioonid arvutati, lahutades 2 [GSSG] kogu glutatioonist. (Müller jt, 2016)

    Inimese mAspAT-i ekspressioon E. coli's, kasutades ultraheli homogenisaatorit

    Ultraheli rakkude hävitaja UP400St (400 W) intratsellulaarse aine ekstraheerimiseks (nt valgud, organellid, DNA, RNA jne)E. coli BL21 (DE3) üksiku kolooniaga, mis sisaldab ekspressioonivektorit 30 ml Luria-Bertani (LB) söötmes, mis sisaldab 100 μg / ml ampitsilliini, ja seejärel kultiveeritakse 37 ° C juures, kuni optiline tihedus (OD600) jõudis 0,6. Rakud koguti tsentrifuugimisel 4000 x g juures 10 minutit ja resuspendeeriti 3 L värskes LB söötmes, mis sisaldas 100 μg / ml ampitsilliini.
    Seejärel indutseeriti valgu ekspressioon 1 mM isopropüül-β-ᴅ-1-tiogalaktopüranosiidiga (IPTG) 20 tundi 16 ° C juures. Rakud koguti tsentrifuugimise teel 8 000 × g juures 15 minutit ja pesti puhvriga A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). 3 L kultuurist saadi ligikaudu 45 g (märgkaaluga) rakke. Pärast tsentrifuugimist resuspendeeriti rakugraanulid 40 ml (1 L kultuuri puhul) jääkülma ekstraheerimise puhvris A ja lüüsiti ultraheliga jääkülmal temperatuuril, kasutades Hielscheri ultraheli rakupurustit UP400St. Rakkude lüüsi tsentrifuugiti kiirusel 12 000 pööret minutis 15 minutit, et eraldada lahustuvad (supernatant) ja sadestunud (pelleti) fraktsioonid. (Jiang et al. 2015)
     



    Faktid Tasub teada

    E. coli

    Escherichia coli (E. coli) on gramnegatiivne, fakultatiivselt anaeroobne, rod-kujuline, kolibakteristlik perekonna Escherichia perekond, mis levib tavaliselt soojavereliste organismide (endotermid) alumist soolestikku. Erinevate omadustega on palju E. coli tüvesid (või alatüüpe). Enamik E. coli tüvesid on inimestele ohutud, nt B ja K-12 tüved, mida sageli kasutatakse laborite teadustöös rakendamiseks. Kuid mõned tüved on kahjulikud ja võivad põhjustada tõsiseid haigusi.
    E. coli mängib olulist rolli kaasaegses bioloogilises initsiatioris ja tööstuslikus mikrobioloogias, kuna baktereid on lihtne manipuleerida. Tavalised laboratooriumirakendused, mis hõlmavad tihti E. coli kasutamist, näiteks rekombinantse desoksüribonukleiinhappe (DNA) tekitamiseks või modellorganismi toimimiseks.
    E. coli on heteroloogsete valkude saamiseks väga mitmekülgne peremeesorganism ning E. coli-s sisalduvate rekombinantsete valkude saamiseks on saadaval mitmesuguseid valkude ekspressioonisüsteeme. Kasutades plasmiide, mis võimaldavad valgu kõrge taseme ekspresseerimist, saab bakteritesse viia geene, mis võimaldab selliste valkude tootmist tööstuslikus fermentatsiooniprotsessis suures koguses.
    E.coli kasutatakse insuliini tootmiseks rakutehastena. Edasised rakendused hõlmavad modifitseeritud E. coli rakkude kasutamist vaktsiinide ja immobiliseeritud ensüümide väljatöötamiseks ja tootmiseks, biokütuste tootmiseks ning bioremediatsiooniks.
    Tüvi K-12 on E. coli mutantse vorm, mis ületab ensüümi leeliseline fosfataas (ALP). See mutatsioon tekib geeni defekti tõttu, mis kodeerib ensüümi pidevalt. Kui geen toodab ilma igasuguse inhibeerimiseta toodet, on see tuntud kui konstitutiivne aktiivsus. Seda spetsiifilist mutantset vormi kasutatakse ALP ensüümi eraldamiseks ja puhastamiseks.
    E. coli baktereid kasutatakse laialdaselt ka rakutehastena. Projekteeritud mikroobe (nt bakterid) ja taimerakke saab kasutada nn rakutehastena. Need geneetiliselt muundatud rakud toodavad molekule, kemikaale, polümeere, valke ja muid aineid, mida kasutatakse näiteks farmaatsia-, toidu- ja keemiatööstuses. Selliste bioengineered rakkude sisemuses toodetud molekulide vabastamiseks on ultraheli lüüs tavaline meetod rakuseinte häirimiseks ja sihtainete ülekandmiseks ümbritsevasse vedelikku. Loe lähemalt bioengineereeritud rakkude lüüsi kohta!

    Ultraheli DNA murdepinna

    Ultraheli nihkejõud on tavaliselt kasutatav meetod molekulide, organellide ja valkude vabastamiseks raku sisemusest ning DNA ahelate purustamiseks tükkideks. Akustiline kavitatsioon purustab rakuseinad ja membraanid, et eraldada rakkudest DNA ja tekitada umbes 600-kohaseid fragmente – 800 bp pikkune, mis on analüüsi jaoks ideaalne.
    Kliki siia, et saada rohkem teavet ultraheli homogenisaatorite DNA fragmenteerumise kohta!

    Kirjandus/viited


    Suure jõudlusega ultraheli! Hielscheri tootevalik hõlmab kogu spektrit kompaktsest labori ultraheliaatorist pink-top üksuste üle täistööstuslike ultrahelisüsteemideni.

    Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid Lab et tööstuslik suurus.


    Meil on hea meel arutada teie protsessi.

    Võtame ühendust.