Protokoll SARS-CoV-2 koronaviiruse inaktiveerimiseks sonikeerimisega

Hielscher VialTweeter on ainulaadne ultraheli mitme proovi ettevalmistusseade, mida kasutatakse koronaviiruse SARS-COV-2 inaktiveerimiseks. VialTweeter võimaldab ette valmistada kuni 10 proovipudelit (viaali) samaaegselt ja on seetõttu ideaalne seade proovide masstöötluseks.

SARS-CoV-2 koronaviiruse inaktiveerimine seadmega VialTweeter

Pärast fikseerimisvahendi eemaldamist pesti monokihte kolm korda fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS), enne kui rakud kraabiti 1mL MEM/5% FBS-i ja sonikeeriti (3 × 10 sekundit sees, 10 sekundit väljas 100% võimsusel ja amplituudil), kasutades Hielscheri ultraheliprotsessorit UP200St koos VialTweeter lisaseadisega. Supernatandid selitati tsentrifuugimisega 3000 × g juures 10 minutit. Welchi jt (2020) täieliku protokolli SARS-CoV-2 koronaviiruse inaktiveerimiseks leiate allpool:

Rakud ja viirus

Vero E6 rakke (Vero C1008; ATCC CRL-1586) kasvatati modifitseeritud Eagle’i minimaalses essentsiaalses söötmes (MEM), millele oli lisatud 10% (v/v) vasikaloote seerumit (FCS). Kasutatud viirus oli SARS-CoV-2 tüvi hCOV-19/England/2/2020, mille PHE isoleeris Ühendkuningriigi esimesest patsientide klastrist 29/01/2020. Viirus saadi 1. passaažil ja seda kasutati inaktiveerimisuuringuteks 2. või 3. passaažil.
SARS-CoV-2 inaktiveerimiseks ning reagendi tsütotoksilisuse eemaldamiseks kasutatud reagentide ja kemikaalide kohta vaadake palun Welchi jt (2020) teaduslikku aruannet.

Viiruse inaktiveerimine detergentidega – SARS-CoV-2 koronaviiruse inaktiveerimise protokoll, Welch jt 2020

SARS-CoV-2 inaktiveerimine


Kaubanduslike toodete puhul töödeldi viirusepreparaate (koekultuuri vedelik, tiitrid vahemikus 1 × 10⁶ kuni 1 × 10⁸ PFU/ml) kolmes korduses reagentidega kontsentratsioonidel ja kontaktiaegadel, mis on soovitatud tootja kasutusjuhendis, kui need on olemas, või kontsentratsioonidel ja aegadel, mida katselaborid spetsiaalselt nõudsid. Kui tootja oli esitanud kontsentratsioonivahemiku, testiti toote ja proovi madalaimat suhet (st katsetatava toote madalaimat soovitatud kontsentratsiooni). Proovide transporttorude reagente testiti, kasutades suhet üks ruumala koekultuuri vedelikku kümne ruumala reagendi kohta, kui tootja ei olnud määranud proovivedeliku ja reagendi ruumalasuhet. Detergente, fikseerimisvahendeid ja lahusteid testiti näidatud kontsentratsioonidel näidatud aja jooksul. Kõik inaktiveerimisetapid viidi läbi ümbritseval toatemperatuuril (18 – 25°C). Alternatiivsete proovitüüpide testimiseks lisati viirus näidatud proovimaatriksisse suhtes 1:9 ning töödeldi seejärel katsereagentidega nagu eespool. Kõik katsed hõlmasid kolmes korduses kontrollproove, mida töödeldi näiviisiliselt samaväärse ruumala PBS-iga katsereagendi asemel. Vahetult pärast nõutud kontaktiaega töödeldi 1mL töödeldud proovi, kasutades sobivalt valitud filtreerimismaatriksit. Reagendi eemaldamine inaktiveerimistestide jaoks viidi läbi suuremas tsentrifuugikolonni formaadis, kasutades Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) või täites tühjad Pierce 10mL mahutavusega tsentrifuugikolonnid (Thermo Fisher) SM2 Bio-Beads’i, Sephacryl S-400HR või Sephadex LH-20-ga, et saada 4mL pakitud graanuleid/vaiku. Amicon’i filtritega puhastamiseks puhastati 2 × 500μl proovi kahe tsentrifugaalfiltriga varem kirjeldatud meetodil ning ühendati seejärel kokku. Formaldehüüdi ning formaldehüüdi koos glutaraldehüüdiga eemaldamiseks kasutati ühte filtrit 1× 500μl proovimahuga; töödeldud proov suspendeeriti pärast töötlemist uuesti 500μl PBS-is ja lisati 400ul MEM/5% FBS-ile. Nakatunud monokihtide inaktiveerimiseks kasutati 12,5 cm² kolbe Vero E6 rakkudega (2,5 × 10⁶ rakku/kolb 2,5mL MEM/5% FBS-is), mis nakatati MOI 0,001 juures ja inkubeeriti temperatuuril 37°C/5% CO₂ 24 tunni jooksul. Supernatant eemaldati ja rakud fikseeriti 5mL formaldehüüdi või formaldehüüdi ja glutaraldehüüdiga toatemperatuuril 15 või 60 minutit. Fikseerimisvahend eemaldati ja monokihte pesti kolm korda lahusega PBS, enne kui rakud kraabiti söötmesse 1mL MEM/5% FBS ja sonikeeriti (3 × 10 sekundit sees, 10 sekundit väljas 100% võimsusel ja amplituudil), kasutades seadet UP200St koos lisaseadisega VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatandid selitati tsentrifuugimisega 3000 × g juures 10 minutit.


Reagentide üksikasjad, mida kasutati SARS-CoV-2 koronaviiruse inaktiveerimiseks ultraheliseadmega VialTweeter vastavalt protokollile Welch et al. 2020

Täieliku protokolli, sealhulgas Hielscher VialTweeter kasutamise, leiate siit:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Tipptasemel ultraheli dismembraatorid ja rakudesintegraatorid

Mitme proovi ultraheli sonikaator VialTweeter on vaid üks paljudest ultraheli lahendustest proovide ettevalmistamiseks bioloogia-, biokeemia- ja kliinilaboratooriumides. Hielscher Ultrasonics pakub teie rakenduseks ideaalset ultraheli dismembraatorit, nt rakkude lüüsiks, rakkude ekstraheerimiseks, koe homogeniseerimiseks, lüsaadi solubiliseerimiseks, lahustamiseks, proovide degaseerimiseks jne.
Teavitage meid, mitu proovi peate töötlema tunnis ja päevas, kas eelistate otsest või kaudset sonikeerimist ning mis on ultraheliga proovitöötluse eesmärk. Soovitame teile oma igapäevase laboritöö jaoks kõige sobivamat ultraheliseadet!
Hielscher Ultrasonicsi digitaalsed ultraheliprotsessorid on varustatud nutika tarkvara, automaatse andmete registreerimise, lihtsate eelseadistusvõimalustega temperatuuri reguleerimiseks, sonikeerimise kestuse ja tsükli-/pulsirežiimi jaoks ning samuti proovi valgustuse ja brauseri kaudu kaugjuhtimisega. Püüame muuta oma ultraheliseadmed võimalikult nutikaks, et teie uurimis- ja töörutiin oleks võimalikult mugav ja edukas.
Klõpsake siia, et leida rohkem rakendusi, sealhulgas ultraheliga proovide ettevalmistamise protokolle seadmega VialTweeter!