SARS-CoV-2 Coronavirus Inaktiveerimise protokoll ultraheliga

Hielscher VialTweeter on unikaalne ultraheli mitmeprooviline ettevalmistusüksus, mida kasutatakse coronavirus SARS-COV-2 inaktiveerimiseks. VialTweeter võimaldab valmistada korraga kuni 10 prooviviaali ja on seega ideaalne massproovi töötlemise ühik.

SARS-CoV-2 Coronaviiruse inaktiveerimine VialTweeteriga

Pärast fiksaatori eemaldamist pesti monokihiid kolm korda fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) enne rakkude kraapimist 1mL MEM / 5% FBS-i ja ultraheliga (3 × 10 sekundit 100% võimsuse ja amplituudi juures), kasutades Hielscheri ultraheli protsessorit UP200St koos VialTweeter Manuse. Supernatandid selgitati tsentrifuugides 3000 × g juures 10 minutit. 

Loe täielikku protokolli siin SARS-CoV-2 coronavirus inactivation poolt Welch et al. (2020) allpool:

Rakud ja viirus

Vero E6 rakud (Vero C1008; ATCC CRL-1586) kultiveeritud modifitseeritud Eagle'i minimaalses olulises keskkonnas (MEM), millele lisandus 10% (v/v) loote vasika seerum (FCS). Kasutatud viirus oli SARS-CoV-2 tüvi hCOV-19/England/2/2020, isoleeritud PHE esimese patsiendi klastri Uk 29/01/2020. See viirus saadi 1.
SARS-CoV-2 inaktiveerimiseks kasutatavate reaktiivide ja kemikaalide kohta ning reaktiivi tsütotoksilisuse eemaldamise kohta vt Welch et al. (2020) teaduslikku aruannet.

Viiruse inaktiveerimine detergentide poolt – SARS-CoV-2 Coronavirus Inaktiveerimise protokoll Welch et al. 2020

SARS-CoV-2 inaktiveerimine

Kaubanduslike toodete puhul on viirusepreparaadid (koekultuuri vedelik, tiitrid vahemikus 1 × 10⁶ kuni 1 × 10⁸ PFU/ml) raviti kolmes eksemplaris reaktiividega kontsentratsioonides ja kokkupuuteaegadel, mis on soovitatud tootja kasutusjuhendis, kui need on olemas, või kontsentratsioonide ja aegade puhul, mida katselaborid konkreetselt nõuavad. Kui tootja on andnud kontsentratsioonide vahemiku, kontrolliti toote ja proovi väikseimat suhet (st uuritava toote väikseimat soovitatavat kontsentratsiooni). Proovi transporditoru reaktiive kontrolliti, kasutades koekultuurivedeliku ühe mahujakümne mahu osa reaktiivi suhet, välja arvatud juhul, kui tootja on kindlaks määranud proovivedeliku ja reaktiivi mahusuhte. Detergente, fiksaate ja lahusteid kontrolliti kindlaksmääratud kontsentratsioonides ettenähtud aegadel. Kõik inaktiveerimisetapid viidi läbi toatemperatuuril (18...25 °C). Alternatiivsete proovitüüpide testimiseks tembiteritakse viirus näidatud proovimaatriksisse suhtega 1:9, seejärel töödeldi eespool kirjeldatud katsereaktiividega. Kõik katsed hõlmasid katsereaktiivi asemel kolmekiitaatset kontrollproovi, mille pbs-ekvivalentmaht oli samaväärne. Vahetult pärast nõutavat kontaktiaega töödeldi 1 ml töödeldud proovi sobivalt valitud filtreerimismaatriksiga. Reaktiivi eemaldamine inaktiveerimiseks viidi läbi suuremas tsentrifuugimiskolonnivormingus, kasutades Pierce 4mL detergentide eemaldamise spinnikolonne (termofisher), või täites tühjad Pierce 10ml võimsusetsentrifuugisambad (Termofisher) SM2 Bio-Helmede, Sephacryli S-400HR või Sephadex LH-20 abil, et anda 4ml pakitud helmed/resin. Amiconfiltrite abil puhastamiseks puhastati kaks × 500 μl proovi, kasutades eespool kirjeldatud meetodil kahte tsentrifugaalfiltrit, seejärel koondati kokku. Glutaaldehüüdi eemaldamisel kasutati formaldehüüdi ja formaldehüüdi puhul ühte filtrit 1× 500 μl proovi mahuga, mis resuspendeeriti pärast töötlemist 500 μl PBS-is ja lisati 400 ul MEM/5% FBS-ile. Inaktiveerimiseks nakatunud monokihid, 12.5 cm² vero E6 rakkude (2,5 × 10⁶ 2,5 ml MEM/5% FBS) nakatunud MOI 0,001 juures ja inkubeeriti 37 °C/5% CO₂ 24 tunni jooksul. Supernatant eemaldati ja rakud fikseeriti 5 ml formaldehüüdi või formaldehüüdi ja glutaaraldehüüdi abil toatemperatuuril 15 või 60 minutit. Fixative eemaldati ja monokihid pestud kolm korda PBS enne kraapides rakud 1mL MEM / 5% FBS ja sonicated (3 × 10 sekundit välja 100% võimsus ja amplituud) kasutades UP200St koos VialTweeter arestimine (Hiel Ultraheli Technology). Supernatandid selgitati tsentrifuugides 3000 × g juures 10 minutit.

Sars-CoV-2 koronaarviiruse inaktiveerimiseks kasutatava reaktiivi üksikasjad ultraheliVialTweeteriga vastavalt Welch et al. 2020 protokollile

Täielik protokoll, sealhulgas hielscherVialTweeteri kasutamine, leiate siit:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Keerukad ultraheli dismembrators ja rakkude disruptors

Mitme proovi ultrasonicator VialTweeter on vaid üks paljudest ultraheli lahendusi proovide ettevalmistamiseks bioloogilistes, biokeemilistes ja kliinilistes laborites. Hielscher Ultrasonics pakub teie rakenduse jaoks ideaalset ultraheli dismembratorit, nt rakkude lüüsi, rakkude ekstraheerimist, kudede homogeniseerimist, lüsate lahustumist, lahustamist, proovi degaseerimist jne.
Andke meile teada, kui palju proove peate tund ja päeva kohta töötlema, kui eelistate otsest või kaudset ultrahelitöötlust ja milline on ultraheli proovi töötlemise eesmärk. Soovitame teile kõige sobivam ultraheli üksus oma igapäevast tööd rutiinist!
Hielscher Ultrasonics'i digitaalsed ultraheli protsessorid on varustatud nutika tarkvaraga, automaatse andmesalvestusega, temperatuuri reguleerimise lihtsaeelsete valikutega, ultrahelitöötluse kestusega, tsükli / impulsi režiimiga, samuti proovi valgustusega ja brauseri kaugjuhtimispuldiga. Püüame muuta meie ultraheli seadmed võimalikult targaks, nii et teie uurimistöö ja töö rutiin muutub võimalikult mugavaks ja edukaks.
Klõpsake siin, et leida rohkem rakendusi, sealhulgas ultraheli proovi ettevalmistamise protokollid VialTweeteriga!