Protokoll SARS-CoV-2 koronaviiruse inaktiveerimiseks ultrahelitöötlusega

Hielscher VialTweeter on ainulaadne ultraheli mitme proovi ettevalmistamise üksus, mida kasutatakse koronaviiruse SARS-COV-2 inaktiveerimiseks. VialTweeter võimaldab valmistada korraga kuni 10 proovipudelit ja on seega ideaalne seade proovide masstöötlemiseks.

Koronaviiruse SARS-CoV-2 inaktiveerimine VialTweeteriga

Pärast fikseeriva aine eemaldamist pesti monokihte kolm korda fosfaatpuhvri lisandiga soolalahusega (PBS) enne rakkude kraapimist 1 ml MEM / 5% FBS ja ultraheliga töödeldud (3 × 10 sekundit sisse, 10 sekundit välja 100% võimsuse ja amplituudiga), kasutades Hielscheri ultraheli protsessorit UP200St koos VialTweeteriga Manuse. Supernatandid selitati tsentrifuugimisega 3000 × g juures 10 minutit. 

Lugege allpool Welchi jt (2020) koroonaviiruse SARS-CoV-2 inaktiveerimise täielikku protokolli siit:

Rakud ja viirus

Vero E6 rakud (Vero C1008; ATCC CRL-1586) kultiveeriti modifitseeritud Eagle'i minimaalses olulises söötmes (MEM), millele oli lisatud 10% (v/v) vasika looteseerumit (FCS). Kasutatud viirus oli SARS-CoV-2 tüvi hCOV-19/England/2/2020, mille PHE eraldas esimesest patsiendiklastrist Ühendkuningriigis 29.01.2020. See viirus saadi lõigul 1 ja seda kasutati inaktiveerimise uuringutes lõigul 2 või 3.
SARS-CoV-2 inaktiveerimiseks ning reaktiivi tsütotoksilisuse eemaldamiseks kasutatavate reaktiivide ja kemikaalide kohta vt Welchi jt (2020) teaduslikku aruannet.

Viiruse inaktiveerimine detergentide abil – SARS-CoV-2 koroonaviiruse inaktiveerimise protokoll, autorid Welch et al. 2020

SARS-CoV-2 inaktiveerimine

Kaubanduslike toodete puhul viiruspreparaadid (koekultuuri vedelik, tiitrid vahemikus 1 × 10⁶ kuni 1 × 10⁸ PFU/ml) töödeldi kolmes eksemplaris reaktiividega tootja kasutusjuhendis soovitatud kontsentratsioonides ja kokkupuuteaegadel, kui need olid kättesaadavad, või katselaborite poolt konkreetselt nõutud kontsentratsioonide ja aegade jooksul. Kui tootja andis kontsentratsioonivahemiku, kontrolliti toote ja proovi madalaimat suhet (st madalaimat soovitatavat kontsentratsiooni uuritavas tootes). Proovi transporditoru reaktiive testiti, kasutades ühe mahuosa koekultuuri vedeliku ja kümne mahuosa reaktiivi suhet, välja arvatud juhul, kui tootja on määranud proovivedeliku ja reaktiivi mahusuhte. Detergente, fiksaatoreid ja lahusteid testiti näidatud kontsentratsioonides näidatud aegadel. Kõik inaktiveerimise etapid viidi läbi toatemperatuuril (18–25 °C). Alternatiivsete proovitüüpide testimiseks torgati viirus näidatud proovimaatriksisse vahekorras 1:9, seejärel töödeldi seda katsereaktiividega eespool kirjeldatud viisil. Kõik katsed hõlmasid kolmekordset kontrollprooviga töödeldud proovi, milles oli uuritava reaktiivi asemel samaväärne kogus fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahust. Vahetult pärast nõutavat kokkupuuteaega töödeldi 1 ml töödeldud proovi, kasutades sobivalt valitud filtreerimismaatriksit. Reaktiivi eemaldamine inaktiveerimise testimiseks viidi läbi suuremas tsentrifuugimiskolonni vormingus, kasutades Pierce 4mL detergentide eemaldamise spin-kolonne (Thermo Fisher), või täites tühjad Pierce'i 10 ml mahutavusega tsentrifuugikolonnid (Thermo Fisher) SM2 biohelmeste, Sephacryl S-400HR või Sephadex LH-20-ga, et saada 4 ml pakitud helmeid/vaiku. Puhastamiseks Amiconi filtrite abil puhastati 2 × 500 μl proovid kahe tsentrifugaalfiltri abil eelnevalt kirjeldatud meetodil ja koondati seejärel kokku. Glutaraldehüüdi eemaldamisega formaldehüüdi ja formaldehüüdi puhul kasutati ühte filtrit proovimahuga 1× 500 μl, mis resuspendeeriti pärast töötlemist 500 μl fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses ja lisati 400ul MEM / 5% FBS-ile. Nakatunud inaktiveerimiseks ühekihilised, 12,5 cm² Vero E6 rakkude kolvid (2,5 × 10⁶ rakud/kolb 2,5 ml MEM / 5% FBS) nakatusid MOI 0,001 juures ja inkubeeriti temperatuuril 37 °C / 5% CO₂ 24 tundi. Supernatant eemaldati ja rakud fikseeriti 5 ml formaldehüüdi või formaldehüüdi ja glutaaraldehüüdi abil toatemperatuuril 15 või 60 minutit. Fikseeriv aine eemaldati ja monokihid pesti kolm korda fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega enne rakkude kraapimist 1 ml MEM / 5% FBS-i ja ultraheliga töödeldud (3 × 10 sekundit sisse, 10 sekundit välja 100% võimsuse ja amplituudiga), kasutades UP200St koos VialTweeteri lisaseadmega (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatandid selitati tsentrifuugimisega 3000 × g juures 10 minutit.

SARS-CoV-2 koronaviiruse inaktiveerimiseks kasutatud reaktiivi üksikasjad ultraheli VialTweeteriga vastavalt Welchi jt protokollile 2020

Täieliku protokolli, sealhulgas Hielscher VialTweeteri kasutamise, leiate siit:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Keerukad ultraheli dismembraatorid ja rakkude katkestajad

Mitme prooviga ultrasonikaator VialTweeter on vaid üks paljudest ultraheli lahendustest proovide ettevalmistamiseks bioloogilistes, biokeemilistes ja kliinilistes laborites. Hielscher Ultrasonics pakub teie rakenduse jaoks ideaalset ultraheli dismembraatorit, nt rakkude lüüs, rakkude ekstraheerimine, koe homogeniseerimine, lüsaadi lahustumine, lahustamine, proovi degaseerimine jne.
Andke meile teada, kui palju proove peate tunnis ja päevas töötlema, kui eelistate otsest või kaudset ultrahelitöötlust ja milline on ultraheliproovi töötlemise eesmärk. Soovitame teile oma igapäevase töörutiini jaoks kõige sobivamat ultraheliseadet!
Hielscher Ultrasonics' digitaalsed ultraheli protsessorid on varustatud nutika tarkvaraga, automaatse andmete salvestamisega, lihtsate eelseadistamisvõimalustega temperatuuri reguleerimiseks, ultrahelitöötluse kestuseks, tsükli / impulsi režiimiks, samuti proovi valgustuseks ja brauseri kaugjuhtimispuldiga. Püüame muuta oma ultraheli seadmed võimalikult nutikaks, et teie uurimistöö ja töörutiin muutuksid võimalikult mugavaks ja edukaks.
Klõpsake siin, et leida rohkem rakendusi, sealhulgas ultraheli proovide ettevalmistamise protokolle VialTweeteriga!