BL21 rakkude lüüs ultraheli abil
BL21 rakud on E. coli tüvi, mida kasutatakse laialdaselt uurimislaborites, biotehnoloogias ja tööstuslikus tootmises tänu nende võimele ekspresseerida valke väga tõhusalt. Ultraheli rakkude katkestamine, lüüsimine ja valgu ekstraheerimine on tavaline meetod sihitud valkude eraldamiseks ja kogumiseks BL21 rakkude raku sisemusest. Ultraheli häirib rakku täielikult ja vabastab kõik takerdunud valgud, muutes 100% valgust kättesaadavaks.
BL21 rakud valgu ekspressiooniks
BL21 rakk on keemiliselt pädev E. coli bakteritüvi, mis sobib transformatsiooniks ja kõrge taseme valgu ekspressiooniks, kasutades T7 RNA polümeraasi-IPTG induktsioonisüsteemi. BL21 rakud võimaldavad kõrge efektiivsusega valgu ekspressiooni mis tahes geenis, mis on T7 promootori kontrolli all. E. coli tüvi BL21(DE3) on T7 RNA polümeraasil põhinev valgutootmistüvi, mis on kombineeritud T7 promootoripõhiste ekspressioonivektoritega ja mida kasutatakse laialdaselt laborites ja tööstuses rekombinantsete valkude tootmiseks. BL21(DE3) transkribeerib rekombinantset valku kodeeriva geeni ekspressiooni kromosomaalselt kodeeritud T7 RNA polümeraas (T7 RNAP), mis transkribeerib kaheksa korda kiiremini kui tavaline E. coli RNAP. See muudab tüve BL21(DE3) väga tõhusaks ja muudab selle üheks eelistatumaks valgu ekspressioonirakkude süsteemiks.
Ultraheli lüüsi ja valgu ekstraheerimise protokoll BL21 rakkudest
BL21 rakkude lüüs viiakse enamasti läbi ultraheli abil koos naatriumlauroüülsarkosinaadiga (tuntud ka kui sarkosüül) lüüsipuhvrina. Ultraheli rakkude katkestamise ja valgu ekstraheerimise eelised seisnevad ultrasonikaatorite usaldusväärsuses, reprodutseeritavuses, samuti lihtsas, ohutus ja kiires töös. Allolev protokoll annab ultraheli BL21 rakkude lüüsi jaoks samm-sammult suuna:
- Šaperoonvalkude eemaldamiseks resuspendeeriti BL21 bakterigraanulid 50 ml jääkülmas Sodium Tris-EDTA (STE) puhvris (mis koosnes 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, millele oli lisatud 100 mM PMSF).
- Lisatakse 500 ul lüsosüümi (10 mg/ ml) ja rakke inkubeeritakse jääl 15 minutit.
- Seejärel lisatakse 500 ul DTTd ja 7 ml sarkosüüli (10% (w/v) täidetud STE puhverlahuses).
- Oluline on hoida kõik puhastuspuhvrid jääkülmana ja hoida proove kogu aeg jääl. Kõik puhastusetapid tuleks võimaluse korral läbi viia külmas ruumis.
- Ultraheli lüüsi ja valgu ekstraheerimise jaoks töödeldakse proove ultraheliga VialTweeter MultiSample Ultrasonicator 4 x 30 sekundit 100% amplituudiga 2-minutilise intervalliga iga ultrahelitöötluse vahel. Teise võimalusena on sondi tüüpi ultraheli homogenisaator mikro-otsaga, nt UP200Ht S26d2-ga (3 x 30 sek, 2 min. paus ultraheli tsüklite vahel, 80% amplituud) saab kasutada.
- Edasisteks puhastamisetappideks tuleb proove kuni edasise töötlemiseni hoida jääl või -80 °C juures.
Ultraheli raku katkestaja UP200St mikrootsikuga S26d2 lüüsi ja valgu ekstraheerimiseks
Ultraheli lüüs prescise temperatuuri kontrolli all
Täpne ja usaldusväärne temperatuuri reguleerimine on bioloogiliste proovide käitlemisel ülioluline. Kõrged temperatuurid käivitavad proovides termiliselt indutseeritud valkude lagunemise.
Nagu kõik mehaanilised proovide ettevalmistamise tehnikad, tekitab ultrahelitöötlus soojust. Kuid, proovide temperatuuri saab VialTweeteri kasutamisel hästi kontrollida. Tutvustame teile erinevaid võimalusi proovide temperatuuri jälgimiseks ja kontrollimiseks, valmistades neid analüüsimiseks ette VialTweeteri ja VialPressiga.
- Proovi temperatuuri jälgimine: VialTweeterit juhtiv ultraheli protsessor UP200St on varustatud intelligentse tarkvara ja ühendatava temperatuurianduriga. Ühendage temperatuuriandur UP200St-ga ja sisestage temperatuurianduri ots ühte katseklaasi. Digitaalse värvilise puutetundliku ekraani abil saate UP200St menüüs seadistada oma proovi ultrahelitöötluse jaoks konkreetse temperatuurivahemiku. Ultrasonikaator peatub automaatselt, kui maksimaalne temperatuur on saavutatud, ja peatub, kuni proovi temperatuur on seatud temperatuuri ∆ madalama väärtuseni. Seejärel algab ultrahelitöötlus automaatselt uuesti. See nutikas funktsioon hoiab ära kuumusest põhjustatud lagunemise.
- VialTweeteri plokki saab eeljahutada. Pange VialTweeteri plokk (ainult sonotrode ilma andurita!) külmkappi või sügavkülma, et titaanplokk eeljahutada, aitab proovi temperatuuri tõusu edasi lükata. Võimaluse korral saab proovi ka ise eeljahutada.
- Kasutage ultrahelitöötluse ajal jahutamiseks kuiva jääd. Kasutage kuiva jääga täidetud madalat salve ja asetage VialTweeter jääle, et kuumus saaks kiiresti hajuda.
Kliendid kogu maailmas kasutavad VialTweeterit ja VialPressi oma igapäevaseks proovide ettevalmistamiseks bioloogilistes, biokeemilistes, meditsiinilistes ja kliinilistes laborites. UP200St protsessori intelligentne tarkvara ja temperatuuri reguleerimine, temperatuuri kontrollitakse usaldusväärselt ja välditakse kuumusest tingitud proovi lagunemist. Ultraheli proovide ettevalmistamine VialTweeteri ja VialPressiga annab väga usaldusväärseid ja reprodutseeritavaid tulemusi!
Leidke oma lüüsirakenduse jaoks optimaalne ultraheli katkestaja
Hielscher Ultrasonics on pikaajaline kogenud suure jõudlusega ultraheli rakkude häirijate ja homogenisaatorite tootja laboritele, pink-top ja tööstuslikele süsteemidele. Teie bakterirakukultuuri suurus, teie uurimis- või tootmiseesmärk ja töödeldava raku maht tunnis või päevas on olulised tegurid, et leida oma rakenduse jaoks õige ultraheli rakkude katkestaja.
Hielscher Ultrasonics pakub erinevaid lahendusi mitme proovi (kuni 10 viaali koos VialTweeteriga) ja massiproovide (st mikrotiiterplaatide / ELISA plaatide UIP400MTP) samaaegseks ultrahelitöötluseks, samuti klassikaline sondi tüüpi labori ultrasonikaator, millel on erinevad võimsustasemed 50 kuni 400 vatti täielikult tööstuslikele ultraheli protsessoritele kuni 16 000 vatti ühiku kohta kaubanduslike rakkude katkestamiseks ja valgu ekstraheerimiseks suurtes tootmistes. Kõik Hielscheri ultrasonikaatorid on ehitatud 24/7/365 operatsiooni jaoks täiskoormuse all. Töökindlus ja usaldusväärsus on meie ultraheli seadmete põhijooned.
Kõik digitaalsed ultraheli homogenisaatorid on varustatud nutika tarkvara, värvilise puutetundliku ekraani ja automaatse andmete protokollimisega, mis muudavad ultraheli seadme mugavaks töövahendiks laboris ja tootmisrajatistes.
Andke meile teada, milliseid rakke, millise mahuga, millise sagedusega ja millise sihtmärgiga peate oma bioloogilisi proove töötlema. Soovitame teile kõige sobivamat ultraheli rakkude katkestajat teie protsessinõuete jaoks.
Allolev tabel annab teile ülevaate meie ultraheli süsteemide ligikaudsest töötlemisvõimsusest kompaktsetest käeshoitavatest homogenisaatoritest ja MultiSample Ultrasonicators tööstuslikest ultraheli protsessoritest kaubanduslike rakenduste jaoks:
| Partii maht | Voolukiirus | Soovitatavad seadmed |
|---|---|---|
| 96-süvendi / mikrotiiterplaadid | mujal liigitamata | UIP400MTP |
| 10 viaali à 0,5 kuni 1,5 ml | mujal liigitamata | VialTweeter UP200St juures |
| 0.01 kuni 250 ml | 5 kuni 100 ml / min | UP50H |
| 0.01 kuni 500 ml | 10 kuni 200 ml / min | UP100H |
| 10 kuni 2000 ml | 20 kuni 400 ml / min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 kuni 20L | 0.2 kuni 4L / min | UIP2000hdT |
| 10 kuni 100L | 2 kuni 10L/min | UIP4000hdT |
| mujal liigitamata | 10 kuni 100 L / min | UIP16000 |
| mujal liigitamata | Suurem | klaster UIP16000 |
Võta meiega ühendust! / Küsi meilt!
UIP400MTP plaadi sonikaator suure läbilaskevõimega rakkude katkemise korral 96 süvendiga plaatidel
Ultrasonikaator UP200Ht 2 mm mikrotiibiga S26d2 väikeste proovide ultraheliga töötlemiseks
Lisateavet selle kohta, kuidas saate kasutada oma ultraheli koe homogenisaatorit puhverlahuste tõhusaks ja usaldusväärseks ettevalmistamiseks!
Faktid, mida tasub teada
Escherichia coli bakterid
Escherichia coli on bakteritüüp, mis ei ole spooride moodustamine, gramnegatiivne ja mida iseloomustab sirge varda vorm. E.coli baktereid leidub inimeste ja loomade keskkonnas, toidus ja soolestikus. E. coli on tavaliselt liikuv, kasutades peritrichous flagella, kuid on ka mittemotiilseid tüüpe. E.coli on nn fakultatiivselt anaeroobsed kemoorganotroofsed organismid, mis tähendab, et nad on võimelised nii hingamisteede kui ka fermentatiivseks ainevahetuseks. Enamik E.coli tüüpe on healoomulised ja täidavad organismis kasulikke funktsioone, nt pärsivad kahjulike bakteriliikide kasvu, sünteesivad vitamiine jne.
Escherichia coli bakterirakk nn B-tüüpi on E.coli tüvede erikategooria, mida kasutatakse laialdaselt teadusuuringutes, et uurida selliseid mehhanisme nagu bakteriofaagi tundlikkus või piirangute muutmise süsteemid. Lisaks hinnatakse E.coli baktereid usaldusväärseks tööhobuseks valgu ekspressiooniks biotehnoloogia ja bioteaduste laborites. Näiteks kasutatakse E.coli selliste ühendite sünteesimiseks nagu valgud ja oligosahhariidid tööstuslikus mastaabis. Spetsiifiliste tunnuste tõttu, nagu proteaasi puudus, madal atsetaadi tootmine kõrge glükoosisisalduse juures ja suurenenud läbilaskvus, on E. coli B-rakud geneetiliselt muundatud valkude tootmiseks kõige sagedamini kasutatavad peremeesrakud.
Rekombinantne valk
Rekombinantsed valgud (rProt) omandavad olulist tähtsust mitmesugustes harudes, sealhulgas keemiatööstuses, farmaatsia-, kosmeetika-, inim- ja loomameditsiinis, põllumajanduses, toidu- ja jäätmekäitlustööstuses.
Rekombinantse valgu tootmine nõuab ekspressioonisüsteemi kasutamist. Rekombinantse DNA tootmiseks kasutatavate rakusüsteemide ekspressioonina võib kasutada nii prokarüootseid kui ka eukarüootseid rakke. Kuigi bakterirakke kasutatakse valgu ekspressiooniks kõige laialdasemalt selliste tegurite tõttu nagu madal hind, lihtne mastaapsus ja lihtsad keskkonnatingimused, on imetajate, pärmi, vetikate, putukate ja rakkude vabad süsteemid loodud alternatiivid. Valgu tüüp, funktsionaalne aktiivsus ja ekspresseeritud valgu nõutav saagis mõjutavad valgu ekspressiooniks kasutatava rakusüsteemi valikut.
Rekombinantse valgu ekspresseerimiseks tuleb konkreetne rakk transfekteerida DNA vektoriga, mis sisaldab rekombinantse DNA malli. Seejärel kultiveeritakse malliga transfekteeritud rakke. Rakumehhanismi tagajärjel transkribeerivad ja tõlgivad rakud huvipakkuvat valku, tootes seeläbi sihitud valku.
Kuna ekspresseeritud valgud on rakumaatriksisse takerdunud, tuleb valkude vabastamiseks rakk lüüsida (katkestada ja purustada). Järgnevas puhastusetapis valk eraldatakse ja puhastatakse.
Esimene ravis kasutatud rekombinantne valk oli rekombinantne iniminsuliin 1982. aastal. Tänapäeval toodetakse kogu maailmas meditsiiniliseks raviks rohkem kui 170 tüüpi rekombinantset valku. Tavaliselt kasutatavad rekombinantsed valgud, mida kasutatakse meditsiinis, on näiteks rekombinantsed hormoonid, interferoonid, interleukiinid, kasvufaktorid, kasvaja nekroosifaktorid, vere hüübimisfaktorid, trombolüütilised ravimid ja ensüümid selliste suurte haiguste raviks nagu diabeet, kääbus, müokardiinfarkt, kongestiivne südamepuudulikkus, aju apopleksia, hulgiskleroos, neutropeenia, trombotsütopeenia, aneemia, hepatiit, reumatoidartriit, astma, Crohni tõbi ja vähiravi. (vrd Phuc V. Pham, ajakirjas Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Kirjandus / Viited
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter sonikaator 10 proovi samaaegseks ultrahelitöötluseks, nt BL21 rakkude häirimiseks
Suure jõudlusega ultraheli! Hielscheri tootevalik hõlmab kogu spektrit kompaktsest labori ultrasonikaatorist üle pink-top ühikute kuni täistööstuslike ultraheli süsteemideni.