BL21 rakkude lüüs ultraheli töötlusega

BL21 rakud on E. coli tüvi, mida kasutatakse laialdaselt teadus- ja uurimislaborites, biotehnoloogias ja tööstuslikus tootmises tänu nende võimele toota valke väga efektiivselt. Ultrahelil põhinev rakkude lõhkumine (desintegreerimine), lüüs ja valgu ekstraheerimine on levinud meetod, mille abil eraldatakse ja kogutakse soovitud valke BL21 rakkude sisemusest. Ultraheli töötlus lõhub raku täielikult ja vabastab kõik lõksustunud valgud, tehes 100% valgust kättesaadavaks.

BL21 rakud valgu ekspressiooniks

BL21 rakk on keemiliselt kompetentne E. coli bakteritüvi, mis sobib transformatsiooniks ja kõrgetasemeliseks valgu ekspressiooniks T7 RNA polümeraasi–IPTG indutseerimissüsteemi abil. BL21 rakud võimaldavad suure efektiivsusega ekspresseerida mis tahes geeni, mis on T7 promootori kontrolli all. E. coli tüvi BL21(DE3) on T7 RNA polümeraasil põhinev valgutootmistüvi, mida kombineeritakse T7 promootoril põhinevate ekspressioonivektoritega ning mida kasutatakse laialdaselt laborites ja tööstuses rekombinantsete valkude tootmiseks. BL21(DE3) tüves transkribeeritakse rekombinantset valku kodeeriva geeni ekspressiooni kromosomaalselt kodeeritud T7 RNA polümeraasi (T7 RNAP) abil, mis transkribeerib kaheksa korda kiiremini kui tavaline E. coli RNAP. See muudab tüve BL21(DE3) väga efektiivseks ja teeb sellest ühe eelistatuima valgu ekspressiooni rakusüsteemi.

BL21 rakkude ultraheli lüüsi ja valgu ekstraheerimise protokoll

BL21 rakkude lüüsi tehakse enamasti ultraheli töötlusega koos naatriumlauroüülsarkosinaadiga (tuntud ka kui sarkosüül) lüüsipuhvrina. Ultraheliga rakkude lõhkumise (desintegreerimise) ja valgu ekstraheerimise eelised seisnevad ultrasonikaatorite töökindluses, korratavuses ning lihtsas, ohutus ja kiires kasutuses. Allolev protokoll annab samm-sammulise juhise BL21 rakkude ultraheli lüüsiks:

• Šaperonvalkude eemaldamiseks suspendeeriti BL21 bakterite sademed uuesti 50 ml jääkülmas naatrium-Tris-EDTA (STE) puhvris (koostis: 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, millele on lisatud 100 mM PMSF).
• Seejärel lisatakse 500 ul lüsosüümi (10 mg/ ml) ja rakke inkubeeritakse jääl 15 min.
• Pärast seda lisatakse 500 ul DTT-d ja 7 ml sarkosüüli (10% (w/v), valmistatud STE puhvris).
• On oluline hoida kõik puhastuspuhvrid jääkülmana ja hoida proove kogu aeg jääl. Kõik puhastusetapid tuleks võimaluse korral läbi viia külmas ruumis.



• Ultraheli lüüsiks ja valgu ekstraheerimiseks sonikeeritakse proove VialTweeter MultiSample Ultrasonicator seadmes 4 x 30 sek 100% amplituudil, iga sonikeerimise vahel 2 min intervall. Alternatiivina võib kasutada sondtüüpi ultraheli homogenisaatorit mikrotipiga, nt UP200Ht koos S26d2-ga (3 x 30 sek, 2 min paus ultraheli tsüklite vahel, 80% amplituud).
• Järgmisteks puhastusetappideks tuleb proove hoida jääl või alternatiivina säilitada temperatuuril -80°C kuni edasise töötlemiseni.

Ultraheli lüüs täpse temperatuurikontrolli all

Täpne ja usaldusväärne temperatuurikontroll on bioloogiliste proovide käsitsemisel ülioluline. Kõrged temperatuurid käivitavad proovides termiliselt indutseeritud valgu lagunemise.
Nagu kõik mehaanilised proovide ettevalmistamise meetodid, tekitab ka sonikeerimine soojust. Seadet VialTweeter kasutades saab proovide temperatuuri siiski hästi kontrollida. Pakume teile mitmeid võimalusi oma proovide temperatuuri jälgimiseks ja kontrollimiseks, kui valmistate neid analüüsiks ette seadmetega VialTweeter ja VialPress.

1. Proovi temperatuuri jälgimine: ultraheli protsessor UP200St, mis juhib seadet VialTweeter, on varustatud intelligentse tarkvara ja ühendatava temperatuurianduriga. Ühendage temperatuuriandur seadmega UP200St ja sisestage anduri ots ühte proovitorusse. Digitaalse värvilise puuteekraani kaudu saate seadme UP200St menüüs määrata oma proovi sonikeerimiseks kindla temperatuurivahemiku. Sonikaator peatub automaatselt, kui maksimaalne temperatuur on saavutatud, ja jääb pausile, kuni proovi temperatuur langeb seatud temperatuuri ∆ madalama väärtuseni. Seejärel algab ultraheli töötlus automaatselt uuesti. See nutikas funktsioon hoiab ära kuumusest tingitud lagunemise.
2. Seadme VialTweeter plokki saab eelnevalt jahutada. Seadme VialTweeter ploki (ainult sonotrood ilma muundurita!) panemine külmkappi või sügavkülmikusse titaanploki eelnevaks jahutamiseks aitab edasi lükata proovi temperatuuri tõusu. Võimaluse korral saab ka proovi ennast eelnevalt jahutada.
3. Kasutage ultraheli töötluse ajal jahutamiseks kuivjääd. Kasutage kuivjääga täidetud madalat kandikut ja asetage VialTweeter jääle, et soojus saaks kiiresti hajuda.

Kliendid üle maailma kasutavad seadmeid VialTweeter ja VialPress oma igapäevases proovide ettevalmistustöös bioloogia-, biokeemia-, meditsiini- ja kliinilistes laborites. Protsessori UP200St intelligentse tarkvara ja temperatuurikontrolli abil hoitakse temperatuur töökindlalt kontrolli all ning kuumusest tingitud proovi lagunemist välditakse. Ultraheli abil proovide ettevalmistamine seadmetega VialTweeter ja VialPress annab väga usaldusväärseid ja korratavaid tulemusi!

Leidke oma lüüsirakenduse jaoks optimaalne ultraheli desintegraator

Hielscher Ultrasonics on pikaajalise kogemusega kõrgjõudlusega ultraheli rakulõhkujate ja homogenisaatorite tootja laborite, lauaseadmete ja tööstusliku mastaabiga süsteemide jaoks. Teie bakterirakukultuuri suurus, teie uurimis- või tootmiseesmärk ning tunnis või päevas töödeldavate rakkude maht on olulised tegurid, et leida oma rakenduse jaoks õige ultraheli rakulõhkuja.
Hielscher Ultrasonics pakub mitmesuguseid lahendusi mitme proovi samaaegseks sonikeerimiseks (kuni 10 viaali seadmega VialTweeter) ja masspoovide jaoks (st mikrotiiterplaadid / ELISA plaadid seadmega UIP400MTP), samuti klassikalisi sondtüüpi laboratoorseid sonikaatoreid erinevate võimsustasemetega 50 kuni 400 vatti kuni täielikult tööstuslike ultraheli protsessoriteni võimsusega kuni 16 000watts seadme kohta kommertslikuks rakkude lõhkumiseks ja valgu ekstraheerimiseks suuremahulises tootmises. Kõik Hielscher sonikaatorid on ehitatud 24/7/365 tööks täiskoormusel. Töökindlus ja usaldusväärsus on meie ultraheliseadmete põhiomadused.
Kõik digitaalsed ultraheli homogenisaatorid on varustatud nutika tarkvara, värvilise puuteekraani ja automaatse andmete protokollimisega, mis muudavad ultraheliseadme mugavaks tööriistaks laboris ja tootmisrajatistes.
Teatage meile, millist tüüpi rakke, mis mahus, millise sagedusega ja mis eesmärgiga te oma bioloogilisi proove töötlema peate. Soovitame teile teie protsessi nõuetele kõige sobivamat ultraheli rakulõhkujat.

Allolev tabel annab ülevaate meie ultraheli süsteemide ligikaudsest töötlemisvõimsusest kompaktsetest käeshoitavatest homogenisaatoritest ja mitme proovi sonikaatoritest kuni tööstuslike ultraheli protsessoriteni kommertsrakenduste jaoks:

Kirjandus / viited

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.