Ultraheli DNA fragmenteerimine järgmise gen sekveneerimise jaoks
Järgmise põlvkonna sekveneerimine (NGS) nõuab genoomilise DNA usaldusväärset tükeldamist ja killustumist, et järjestada genoomilisi DNA ahelaid ja luua genoomiteeke. DNA kontrollitud killustatus DNA fragmentideks on oluline proovi ettevalmistamise etapp, mis on vajalik enne DNA järjestamist. Ultraheli on osutunud tõhusaks ja usaldusväärseks tehnikaks teatud pikkusega DNA fragmendimiseks. Ultraheli DNA fragmendimise protokollid saavutavad reprodutseeritavaid killustatuse tulemusi. Hielscheri ultrasonikaatorid on võimelised tootma laia valikut genoomilisi DNA fragmentide suuruse jaotusi, mis on täpselt kontrollitavad tööparameetrite kaudu. Kuna Hielscheri ultraheli DNA nihkesüsteemid on saadaval nii ühe kui ka mitme viaali ja mikroplaatide jaoks, muutub proovi ettevalmistamine väga tõhusaks.
E. coli EDL933 genoomse DNA elektroforeesianalüüsid, mida oli ultraheliga seostatud 0 - 15 minutiga. L näitab DNA ladderit. (Basselet jt, 2008)
- korratavad / reprodutseeritavad tulemused
- täpselt reguleeritav, et saada teatud killu pikkus
- Kiire töötlemine
- järjepidevad DNA fragmendimise tulemused
- seadmed mis tahes proovimahu jaoks (nt mitu viaali või mikroplaati)
- suur läbilaskevõime
- täpne temperatuuri reguleerimine
- lihtne ja kasutajasõbralik töö
Järgmise põlvkonna sekveneerimine: ultraheli DNA fragmenteerimine raamatukogu ettevalmistamiseks
Järgmise põlvkonna järjestuse läbiviimiseks tuleb teha (1) raamatukogu ettevalmistamise, 2) järjestuse ja 3) andmeanalüüsi kolm põhietappi. Raamatukogu ettevalmistamise ajal on DNA killustatud, seejärel parandatakse (lihvitakse) fragmendi otsad, lisades ühe adenoide aluse ja sihtfragmendid teisendatakse kahekordseks DNA-ks. Lõpuks on niinimetatud adapterid kinnitatud sideme, PCR-i või sildistamisega, nii et lõplikku teegi DNA-toodet saab sekveneerimiseks kvantifitseerida.
DNA fragmenteerimine ultrahelitöötluse abil: Eriti kui lühiloetavad sekveneerimistehnoloogiad, nagu Illumina, mis ei suuda pikemaid DNA fragmente kergesti lugeda, tuleb DNA-d killustada teatud suuruseni, mida on võimalik ultraheliga usaldusväärselt saavutada.
Ultraheli saab usaldusväärselt kasutada DNA, RNA ja kromatiini killustatuse jaoks.
Kuidas ultraheli DNA fragmenteerimine toimib?
Ultrahelitöötlus, tuntud ka kui akustiliste proovide töötlemine, on laialdaselt kasutatav meetod DNA fragmendimiseks. Ultraheli DNA nihke jaoks puutuvad proovid kontrollitud seisundis kokku ultraheli lainetega. Ultraheli DNA killustatuse tööpõhimõte põhineb ultraheli lainete tekitatud vibratsioonil ja kavitatsioonil. Ultraheli (akustilisest) kavitatsioonist tulenevad nihkejõud purustavad suure molekulmassiga DNA molekulid. Ultrahelitöötluse seadistamine, nagu intensiivsus (amplituud, kestus), pulsatsioonirežiim ja temperatuur, võimaldavad täpset DNA killustumist teatud DNA fragmentide soovitud pikkuseni. Kuigi DNA-d vähendatakse sageli ultraheliuuringu abil 100 kuni 600 bp-ni, võib kergemate ultraheli tingimuste rakendamisel saada pikemaid DNA fragmente kuni 1300 bp.
Ultraheli DNA nihke ChIP ajal – Kromatiini immuunsadestamine
Kohandatud Jkwchuist CC-BY-SA.03 alusel
Temperatuuri reguleerimine DNA lagunemise vältimiseks
DNA kaheahelaline molekulaarne kuju on kõrgendatud temperatuuri suhtes väga tundlik, nii et täpne kontroll temperatuuri üle proovi ettevalmistamise etapis on usaldusväärsete analüüsitulemuste oluline tegur.
Kas kasutate Hielscheri sondi ultrasonikaatoreid, VialTweeter või UIP400MTP – pidev temperatuuri jälgimine ja juhtimine on tagatud ühendatava temperatuurianduri ja nutiseadme tarkvara tõttu. Temperatuuri säilitamiseks teatud vahemikus saate määrata ülemise ja alumise temperatuuripiiri. Järelikult peatub ultrasonikaator niipea, kui see temperatuuripiir on ületatud, ja jätkab automaatselt sonicate, kui temperatuur on langenud seatud ∆T võrra.
Hielscheri ultrasonikaatorite keerukas tarkvara tagab ideaalsete näidisravi tingimuste usaldusväärse hoolduse.
Massiproovi DNA fragmenteerimine UIP400MTP multi-well plaadi ultrasonikaatoriga
Viimase kümne aasta jooksul on valimite arv bioteaduses märkimisväärselt kasvanud. See tähendab, et väga suurt hulka proove (nt 384, 1536 või 3456 kaevu mikroplaadi kohta) tuleb töödelda proovi ettevalmistamine ja analüüsimine järjekindlalt võrdsetel tingimustel, et saada võrreldavaid ja kehtivaid tulemusi. UIP400MTP-ga järgib Hielscher Ultrasonics massiproovide töötlemise trendi. UIP400MTP on ultraheliator proovide valmistamiseks mikroplaatide abil. UIP400MTP saab töödelda plaate 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 või 3456 kaevudega. Sõltuvalt mikroplaadi tüübist võib iga kaev tavaliselt hoida proovimahte kümnete nanoliitrite ja mitme milliliitri vahel. Laialdaselt kasutatakse bioteaduste uuringutes UIP400MTP-d väga sageli proovide ettevalmistamiseks enne teste, nagu ELISA (ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs) või PCR, enne valguanalüüsi, samuti kromatiini valmistamiseks enne CHiP ja CHiP-seq, histone modifitseerimise tuvastamist ja muid analüütilisi ravimeetodeid (nt geelelektroforees, massispektromeetria).
VialTweeter kuni 10 viaali proovi praparatsiooniks
VialTweeter on laialdaselt kasutatav labori ultrasonikaator VialTweeter, mis võimaldab samaaegselt kuni 10 viaali efektiivset ja mugavat ultrahelitöötlust. Kuna viaalid ja katseklaasid (nt Eppendorfi viaalid, krüoviaalid, tsentrifuugitorud) sonicated kaudselt, välditakse ristsaastumist. Kuna igale proovile edastatakse sama ultraheli intensiivsus, on kõik ultrahelitöötluse tulemused homogeensed ja reprodutseeritavad. VialTweeter pakub kõiki nutikaid funktsioone, nagu meie teised digitaalsed seadmed (nt nutikas menüü, programmeeritavad seaded, temperatuuri juhtimine, kaugjuhtimine jne), et tagada suurim kasutajamugavus.
Microwelli plaatide mitme sõrmega sondid
Saadaval ultraheli sondi homogenisaatorid UP200Ht ja UP200St, mitme sõrmega sondid 4 või 8 sõrmega on mugav võimalus sonicate mitu proovi samal ajal samadel tingimustel. Näiteks sonotrode MTP-24-8-96 on kaheksa sõrme sond, mis sobib ideaalselt automaatsetesse süsteemidesse integreerimiseks või mitmekaevuliste plaatide kaevude tõhusaks käsitsi prooviettevalmistamiseks. Mitme sõrmega sonotrode sobib ideaalselt laboritele, kus töödeldakse enamasti keeduklaase ja katseklaase, kasutades standardset ultraheli sonotrode. Mitme sõrmega ja standardseid sonde saab mõne minuti jooksul kiiresti muuta, muutes ühe sondi ultrasonikaatori mitme sondi ultraheli häirijaks.
Hielscheri ultrasonikaatorid DNA fragmenteerimiseks
Hielscher Ultrasonics pakub erinevaid ultrahelipõhiseid platvorme DNA, RNA ja kromatiini killustatuse jaoks. Nende erinevate platvormide hulka kuuluvad ultraheli sondid (sonotroodid), kaudsed ultrahelitöötluslahendused mitme toru või mitmekaevuliste plaatide (nt 96-kaevuplaadid, mikrotiterplaadid), sonorektooride ja ultraheli tasside samaaegseks ettevalmistamiseks. Kõik DNA nihke platvormid töötavad sagedusega häälestatud, suure jõudlusega ultraheli protsessoritega, mis on täpselt kontrollitavad ja annavad reprodutseeritavaid tulemusi.
Ultraheli protsessorid mis tahes proovi numbri ja suuruse jaoks
Hielscheri mitme proovi ultrasonikaatoritega VialTweeter (kuni 10 katseklaasi) ja UIP400MTP (mikroplaatide/ multiwell plaatide jaoks) on lihtne vähendada proovide töötlemise aega intensiivse ja täpselt kontrollitava ultraheliuuringu tõttu, saades samal ajal soovitud DNA fragmendi suuruse jaotuse ja saagise. Ultraheli DNA fragmenteerimine muudab proovi ettevalmistamise tõhusaks, usaldusväärseks ja skaleeritavaks. Protokolle saab lineaarselt skaleerida ühest kuni arvukate proovideni, rakendades pidevalt kontrollitud ultraheli.
Ühe kuni viie sõrmega sondi ultrasonikaatorid sobivad ideaalselt väiksemate proovinumbrite valmistamiseks. Hielscheri laboratoorsed ultrasonikaatorid on saadaval erineva suurusega, nii et saame soovitada teile ideaalset seadet teie rakenduse ja nõuete jaoks.
täpne protsessi juhtimine
Täpselt kontrollitavad ultrahelitöötlusseaded on üliolulised, kuna ammendav ultrahelitöötlus võib hävitada DNA, RNA ja kromatiini, kuid ebapiisav ultraheli nihke tulemuseks on liiga pikad DNA ja kromatiini fragmendid. Hielscheri digitaalseid ultrasonikaatoreid saab kergesti seadistada täpse ultrahelitöötluse parameetrile. Spetsiifilisi ultrahelitöötlussätteid saab salvestada ka programmeeritud sättena sama protseduuri kiireks kordamiseks.
Kogu ultrahelitöötlus protokollitakse automaatselt ja salvestatakse CSV-failina sisseehitatud SD-kaardile. See võimaldab tehtud katsete täpset dokumenteerimist ja võimaldab ultrahelitöötluse toiminguid hõlpsalt läbi vaadata.
Brauseri kaugjuhtimispuldi kaudu saab kõiki digitaalseid ultrasonikaatoreid kasutada ja jälgida mis tahes standardse brauseri kaudu. Täiendava tarkvara installimine ei ole vajalik, kuna LAN-ühendus võimaldab väga lihtsat plug-n-play seadistust.
Kõrgeim kasutajasõbralikkus ultraheli proovi valmistamisel
Kõik Hielscheri ultrasonikaatorid on mõeldud suure jõudlusega ultraheli pakkumiseks, olles samal ajal alati väga kasutajasõbralikud ja kergesti töötavad. Kõik seaded on hästi struktureeritud selges menüüs, millele pääseb hõlpsasti juurde värvilise puuteekraani või brauseri kaugjuhtimispuldi kaudu. Programmeeritavate seadistuste ja automaatse andmesalvestusega nutikas tarkvara tagab optimaalsed ultrahelitöötlusseaded usaldusväärsete ja reprodutseeritavate tulemuste saavutamiseks. Puhas ja hõlpsasti kasutatav menüüliides muudab Hielscheri ultrasonikaatorid kasutajasõbralikeks ja tõhusateks seadmeteks.
Alljärgnev tabel annab teile märku meie labori ultrasonikaatorite ligikaudsest töötlemisvõimsusest, mis sobivad ideaalselt proovide ettevalmistamiseks, nagu DNA ja RNA fragmenteerumine, rakkude lüüs ja valgu ekstraheerimine:
| Seade | Võimsus [W] | Tüüp | Maht [ml] |
|---|---|---|---|
| Led, mida sa ei pea booking.com-i külastajaid vastu | 400 | mikroplaatide puhul | 6 – 3456 kaevu | VialTweeter | 200 | kuni 10 viaalile pluss klambri võimalus | 0.5 – 1.5 |
| UP50H | 50 | Probe-tüüpi | 0.01 – 250 |
| UP100H | 100 | Probe-tüüpi | 0.01 – 500 |
| Uf200 ः t | 200 | Probe-tüüpi | 0.1 – 1000 |
| UP200St | 200 | Probe-tüüpi | 0.1 – 1000 |
| UP400St | 400 | Probe-tüüpi | 5.0 – 2000 |
| CupHorn | 200 | CupHorn, sonoreactor | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | saastevaba voolukamber |
Võta meiega ühendust! / Küsi meiega!
Ultraheli mitmeprooviline ettevalmistusseade VialTweeter võimaldab samaaegset ultrahelitöötlust kuni 10 viaali. Mis klamber-on seade VialPress, kuni 4 täiendavat torud saab vajutada ees intensiivne ultrahelitöötlus.
Sonotrode MTP-24-8-96 on kaheksa ultraheli sondid ultraheli töötluse kaevud mikrotiiter plaadid.
Kirjandus/viited
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Faktid Tasub teada
Mis on järgmise põlvkonna järjestamine?
Järgmise põlvkonna sekveneerimine, ka Next Gen Sequencing (NGS), suure läbilaskevõimega järjestamine või teise põlvkonna järjestamine, viitab massiivse paralleelse järjestuse lähenemisviisile, kus väga suured (massiivsed) miljonite fragmentide DNA kogused järjestatakse samaaegselt paralleelselt jooksu kohta.
Järgmise põlvkonna järjestuse läbiviimiseks tuleb teha (1) raamatukogu ettevalmistamise, 2) järjestuse ja 3) andmeanalüüsi kolm põhietappi. Raamatukogu ettevalmistamise ajal tuleb DNA ahelad killustada teatud pikkusega DNA fragmentideks. Ultrahelitöötlus on üks eelistatud tehnikaid DNA fragmendimiseks.
DNA sekveneerimise käigus nukleotiidide järjekord DNA-s – tuntud kui nukleiinhappe järjestus – määratakse. Nukleiinhappe järjestus koosneb neljast nukleotiidalusest – adeniin, tsütosiin, guaniin, tüümiin – millist koodi teabe saamiseks.
Järgmise põlvkonna sekveneerimine juhib teadusuuringuid bioteaduses ja personaalmeditsiinis, kuna DNA ja RNA sekveneerimist kasutatakse suurel määral genoomilistes uuringutes, vähiuuringutes, haruldaste ja komplekssete haiguste uurimises, mikroobide uuringutes, põllumajandusgenoomikas ja paljudes teistes uurimisvaldkondades.
Järgmise põlvkonna järjestamine vs Mangeri järjestamine
Kuigi järgmise põlvkonna sekveneerimise (NGS) abil on võimalik järjestada tohutul hulgal genoomilisi proove, on Sanger Sequencing (tuntud ka kui ahela lõpetamise meetod või esimese põlvkonna sekveneerimine) võimeline järjestama ainult väikeseid valiminumbreid. Sanger sekveneerimine järjestab korraga ainult ühe DNA fragmendi ja seda saab saavutada ühe päevaga. Tänu oma aktuaalsusele peetakse Sangeri järjestuseks ka kuldstandardtehnoloogiat, mida kasutatakse järgmise põlvkonna järjestuse abil saadud tulemuste kontrollimiseks.
Mangeri sekveneerimisel saavutatakse lugemispikkus ligikaudu 800bp (tavaliselt 500-600bp rikastamata DNA-ga). Sanger'i järjestuse pikemad lugemispikkused näitavad märkimisväärseid eeliseid võrreldes teiste sekveneerimismeetoditega, eriti genoomi korduvate piirkondade järjestamisel. Lühiloetavate järjestuse andmete probleem on eriti probleem uute genoomide (de novo) järjestamisel ja väga ümberkorraldatud genoomisegmentide järjestamisel, tavaliselt need, mida täheldatakse vähi genoomides või struktuuriliste variatsioonidega kromosoomide piirkondades. [cp. Morozova ja Marra, 2008]
Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid Lab et tööstuslik suurus.