Bioengineered bakteriliike, nagu E. coli, samuti geneetiliselt muundatud imetajate ja taimerakkude tüüpe kasutatakse laialdaselt biotehnoloogias molekulide ekspressimiseks. Nende sünteesitud biomolekulide vabastamiseks on vaja usaldusväärset rakuhäirete tehnikat. Suure jõudlusega ultraheliuur on tõestatud meetod tõhusaks ja usaldusväärseks rakulüsiiniks – kergesti skaleeritav suurtele läbilaskevõimetele. Hielscheri ultraheli pakub teile suure jõudlusega ultraheli seadmeid tõhusaks rakulüüsiks, et toota suures koguses kvaliteetseid biomolekule.

Molekulide ekstraheerimine rakutehastest

Paljude biomolekulide tootmiseks võib mikroobsete rakutehastena kasutada erinevaid projekteeritud mikroobe ja taimerakke, sealhulgas Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana ja vetikad. Need rakutehased võivad toota valke, lipiide, biokeemilisi, polümeere, biokütuseid ja oleokemikaale, mida kasutatakse toidu või toorainena tööstuslikeks rakendusteks. Rakutehastena kasutatavaid rakke kasvatatakse suletud bioreaktorides, kus nad saavad saavutada kõrge efektiivsuse, spetsiifilisuse ja madala energiavajaduse.
Sihtmolekulide eraldamiseks bioengineered rakukultuuridest peavad rakud olema häiritud, et rakusisene materjal vabaneks. Ultraheli rakkude häirijad on hästi välja kujunenud kui väga usaldusväärne ja tõhus meetod rakkude lagunemiseks ja ühendite vabanemiseks.

Mikroobsete rakkude tehased on metaboolselt konstrueeritud rakud, mida kasutatakse erinevate väärtuslike ühendite sünteesiks. Ultraheli rakkude katkemine on tõhus ja usaldusväärne meetod väärtuslike ühendite vabastamiseks raku sisemusest.
uuring ja graafika: ©Villaverde, 2010.

Ultraheli rakkude häirijate eelised

Mittetermilise, kerge, kuid väga tõhusa tehnoloogiana kasutatakse ultraheli häirijaid laboris ja tööstuses rakkude lüsumeerimiseks ja kvaliteetsete ekstraktide tootmiseks, nt kasutatakse molekulide eraldamiseks rakutehastest.

Võimsus-ultraheli mikroobide rakutehaste tõhusaks häirimiseks

Ultraheli rakkude häirijate mehhanism ja mõju:
Ultraheli rakkude katkemine kasutas ultraheli lainete jõudu. Ultraheli homogenisaator / rakuhäiitor on varustatud titaanisulamist valmistatud sondiga (aka sonotrode), mis võngub kõrgel sagedusel umbes 20 kHz. See tähendab, et ultraheli sond ühendab 20 000 vibratsiooni sekundis ultraheliga töödeldud vedelikku. Vedelikuga ühendatud ultrahelilaineid iseloomustavad vahelduvad kõrgsurve / madala rõhu tsüklid. Madala rõhu tsükli ajal vedelik laieneb ja tekivad minuti vaakummullid. Need väga väikesed mullid kasvavad mitme vahelduva rõhutsükli jooksul, kuni nad ei suuda enam energiat absorbeerida. Sel hetkel lagunevad kavitatsioonimullid vägivaldselt ja loovad kohapeal erakordse energiarikka keskkonna. Seda nähtust nimetatakse akustiliseks kavitatsiooniks ja seda iseloomustavad lokaalselt väga kõrged temperatuurid, väga kõrged rõhud ja nihejõud. Need nihepinged purustavad tõhusalt rakuseinu ja suurendavad massiülekannet raku sisemuse ja ümbritseva lahusti vahel. Puhtalt mehaanilise tehnikana kasutatakse laialdaselt ultraheli loodud nihkejõude ja soovitatavat protseduuri bakteriaalsete rakkude katkemiseks, samuti valkude isoleerimiseks. Lihtsa ja kiire rakukatkestuse meetodina sobib ultrahelitöötlus ideaalselt väikeste, keskmise suurusega ja suurte mahtude isoleerimiseks. Hielscheri digitaalsed ultraheliatorid on varustatud täpse ultrahelikontrolli seadete selge menüüga. Kõik ultrahelitöötlusandmed salvestatakse automaatselt sisseehitatud SD-kaardile ja on lihtsalt kättesaadavad. Keerukad soojuse hajutamise võimalused, nagu väline jahutamine, ultraheli lagunemisprotsessi ajal pulseeriv režiimis jne ultraheli lagunemisprotsessis, tagavad ideaalse protsessitemperatuuri säilitamise ja seeläbi ekstraheeritud soojustundlike ühendite tervesuse.

Uuringud rõhutavad ultrahelirakkude katkemise ja ekstraheerimise tugevaid külgi

Prof Chemat jt (2017) jätkab oma uuringus, et "ultraheli abil ekstraheerimine on roheline ja majanduslikult elujõuline alternatiiv tavapärastele toidu- ja looduslike toodete tehnikatele. Peamised eelised on ekstraheerimis- ja töötlemisaja vähenemine, kasutatud energia ja lahustite hulk, ühikute toimingud ja CO₂ heitkogused."
Gabig-Ciminska jt (2014) kasutasid DNA vabastamiseks spooride lüüsi uurimiseks kõrgsurve homogenisaatorit ja ultrahelirakkude dsintegraatorit. Võrreldes mõlemat rakukatkestuse meetodit, järeldab uurimisrühm, et spoori DNA rakulüüsi osas "on analüüsitud, kasutades kõrge rõhu homogenisatsiooni rakulüsaate. Hiljem mõistsime, et ultrahelirakkude katkemine on selleks otstarbeks silmapaistvaid eeliseid. See on üsna kiire ja seda saab töödelda väikeste valimimahtude jaoks." (Gabig-Ciminska jt, 2014)

Biomolekulid rakutehastest toiduainete tootmiseks

Mikroobsete rakkude tehased on elujõuline ja tõhus tootmismetoodika, mis kasutab mikroobseid organisme, et toota suurt saagikust kohalikest ja mitte-kohalikest metaboliitidest mikroobsete mikroorganismide, näiteks bakterite, pärmide, seente jne metaboolse biotehnoloogia abil. Lahtised ensüümid toodetakse näiteks mikroorganismide abil, nagu Aspergillus oryzae, seened ja bakterid. Neid lahtiseid ensüüme kasutatakse toidu ja joogi tootmiseks, samuti põllumajanduses, bioenergias ja majapidamises hooldamiseks.
Teatud bakterid, nagu Acetobacter xylinum ja Gluconacetobacter xylinus, toodavad fermentatsiooniprotsessi ajal tselluloosi, kus nanokiud sünteesitakse alt üles protsessis. Bakteriaalne tselluloos (tuntud ka kui mikroobne tselluloos) on keemiliselt samaväärne taimse tselluloosiga, kuid sellel on kõrge kristalliseerumine ja kõrge puhtus (vaba ligniinist, hemitselluloosist, pektiinist ja muudest biogeensetest komponentidest) ning tselluloosi nanokiust jutustatud kolmemõõtmelise (3D) retikuleeritud võrgu ainulaadne struktuur. (vrd Zhong, 2020) Võrreldes taimsest tselluloosist on bakteriaalne tselluloos jätkusuutlikum ja toodetud tselluloos on puhas, mis ei vaja keerulisi puhastusetappe. Ultraheli ja lahusti ekstraheerimine NaOH või SDS (naatriumdotsüülsulfaat) abil on bakteriaalse tselluloosi eraldamiseks bakterirakkudest väga tõhusad.

Biomolekulid farmaatsia- ja vaktsiinitootmise rakutehastest

Üks silmapaistvamaid farmaatsiatooteid, mis on saadud rakutehastest, on inimese insuliin. Bioengineered insuliini tootmiseks kasutatakse peamiselt E. coli ja Saccharomyces cerevisiae. Kuna biosünteldud nanosuurused molekulid pakuvad suurt biosobivust, on bioloogilised nanoosakesed, nagu ferritiinid, soodsad paljude biotöödeks. Lisaks on metaboolselt muundatud mikroobide tootmine saadud saagikuses sageli oluliselt tõhusam. Näiteks artemisiiinhappe, resveratrooli ja lükopeeni tootmine on kümnekordistunud mitme sajakordseks ning on juba loodud või on tööstuslikus mastaabis tootmises. (vrd Liu et al.; Microb. Raku fakt. 2017)
Näiteks valgupõhised nano-suurusega biomolekulid, millel on ise kokkupandavad omadused, nagu ferritiini ja viiruselaadsed osakesed, on vaktsiini arenguks eriti huvitavad, kuna need jäljendavad nii patogeenide suurust kui ka struktuuri ning on sobivad antigeenide pinna konjugatsioonile, et soodustada koostoimet immuunrakkudega. Selliseid molekule ekspresseerivad nn rakutehased (nt konstrueeritud E. coli tüved), mis toodavad teatud sihtmolekuli.

Ultrahelilüsiini ja E. coli BL21 protokoll ferritiini vabastamiseks

Ferritiini on valk, mille esmane funktsioon on raua säilitamine. Ferritiin näitab paljutõotavaid võimeid ise kokkupandavate nanoosakestena vaktsiinides, kus seda kasutatakse vaktsiini kohaletoimetamise vahendina (nt SARS-Cov-2 ogavalgud). Sun et teaduslikud uuringud. al. (2016) näitab, et rekombinantne ferritiini võib vabaneda lahustuva vormina Escherichia colist madala NaCl kontsentratsiooni korral (≤50 mmol/L). Ferritiini väljendamiseks E. coli BL21-s ja ferrtiini vabastamiseks rakendati edukalt järgmist protokolli. Rekombinantne pET-28a/ferritiini plasmiid muudeti E coli BL21 (DE3) tüveks. Ferritiini E coli BL21 (DE3) rakke kultiveeriti LB kasvukandjal 0,5% kanamütsiiniga 37 °C juures ja indutseeriti OD600-l 0,6,4% isopropüül-β-D-thiogalactopyranoside 3 tundi 37 °C juures. Seejärel koristati lõplik kultuur tsentrifuugiga 8000 g juures 10 minutit 4 °C juures ja pellet koguti. Seejärel taaskasutati pellet lB keskkonnas (1% NaCl, 1% tüpone, 0,5% pärmiekstrakt)/lüüsipuhvris (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) ja NaCl lahuse erinevates kontsentratsioonides (vastavalt 0, 50, 100, 170 ja 300 mmol/L). Bakterirakulüsüüsi puhul rakendati ultrahelitöötlust impulssrežiimis: nt ultrasonikaator UP400St 100% amplituudiga, mille töötsükkel on 5 sekundit SEES, 10 sekundit VÄLJA lülitatud, 40 tsükli jooksul) ja seejärel tsentrifuug 10 000 g juures 15 minutit 4 °C juures. Supernatanti ja sadet analüüsis naatriumdotsüülsulfaat polüakrülamiidi geelelektroforees (SDS-PAGE). Kõik naatriumdotsüülsulfaadiga värvitud geelid skaneeriti kõrgresolutsiooniga skanneriga. Geelpilte analüüsiti Magic Chemi 1D tarkvara abil. Optimaalse selguse huvides tuvastati valguribad parameetrite reguleerimise teel. Ansamblite andmed saadi tehnilistest trilikaatidest. (vrd Sun et al., 2016)

Ultraheli rakuhäiitorid rakutehaste tööstuslikuks lüsiiniks

Ultrahelilüsüüs ja ekstraheerimine on usaldusväärne ja mugav meetod metaboliitide vabastamiseks rakutehastest, aidates seeläbi sihtmolekulide efektiivset tootmist. Ultraheli rakkude häirijad on saadaval laborist tööstusliku suurusega ja protsesse saab skaleerida täiesti lineaarseks.
Hielscheri ultraheli on teie pädev partner suure jõudlusega ultraheli häirijate jaoks ja tal on pikaajaline kogemus ultraheli süsteemide implanteerimisel pink-top ja tööstuslikes seadetes.
Kui tegemist on keeruka riist- ja tarkvaraga, vastavad Hielscheri ultraheli rakkude katkemise süsteemid kõigile optimaalse protsessi juhtimise, lihtsa toimimise ja kasutajasõbralikkuse nõuetele. Hielscheri ultraheliatorite kliendid ja kasutaja hindavad kasu, mida Hielscheri ultraheli rakkude häirijad ja väljatõmbajad võimaldavad täpset protsessi jälgimist ja kontrolli – digitaalse puuteekraani ja brauseri kaugjuhtimispuldi kaudu. Kõik olulised ultrahelitöötlusandmed (nt netoenergia, koguenergia, amplituud, kestus, temperatuur, rõhk) salvestatakse automaatselt CSV-failina integreeritud SD-kaardile. See aitab saavutada reprodutseeritavaid ja korratavaid tulemusi ning hõlbustab protsesside standardimist ning heade tootmistavade (cGMP) täitmist.
Loomulikult on Hielscheri ultraheliprotsessorid ehitatud 24/7 tööks täiskoormusel ja seetõttu saab neid usaldusväärselt kasutada tööstusliku tootmise seadetes. Suure töökindluse ja vähese hoolduse tõttu on ultraheli seadmete seisakud tõesti madalad. CIP (puhas kohapeal) ja SIP (steriliseerimine kohapeal) minimeerivad töömahukat puhastamist, eriti kuna kõik märjad osad on siledad metallpinnad (peidetud avasid ega pihusteid ei ole).

Alljärgnev tabel annab teile ülevaate meie ultrahelihitiste ligikaudse töötlemisvõimsusest: