Biotehnoloogiliste rakkude ultraheli lüüs tööstuslikus tootmises

Biotehnoloogiliselt muundatud bakteriliike, nagu E. coli, samuti geneetiliselt muundatud imetajate ja taimerakkude tüüpe, kasutatakse biotehnoloogias laialdaselt molekulide ekspresseerimiseks. Nende sünteesitud biomolekulide vabastamiseks on vaja usaldusväärset rakkude katkestamise tehnikat. Suure jõudlusega ultraheliuuring on tõestatud meetod tõhusaks ja usaldusväärseks rakkude lüüsiks – kergesti skaleeritav suurtele läbilaskevõimetele. Hielscher Ultrasonics pakub teile suure jõudlusega ultraheli seadmeid tõhusaks rakkude lüüsiks, et toota suurtes kogustes kvaliteetseid biomolekule.

Molekulide ekstraheerimine rakutehastest

Paljude biomolekulide tootmiseks võib mikroobirakkude tehastena kasutada mitmesuguseid tehismikroobe ja taimerakke, sealhulgas Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana ja vetikad. Need rakutehased võivad toota valke, lipiide, biokemikaale, polümeere, biokütuseid ja õlikemikaale, mida kasutatakse toiduna või toorainena tööstuslikes rakendustes. Rakutehastena kasutatavaid rakke kultiveeritakse suletud bioreaktorites, kus nad suudavad saavutada kõrge efektiivsuse, spetsiifilisuse ja madala energiavajaduse.
Sihtmolekulide eraldamiseks bioloogiliselt muundatud rakukultuuridest tuleb rakud katkestada nii, et rakusisene materjal vabaneks. Ultraheli rakkude häirijad on hästi välja kujunenud kui väga usaldusväärne ja tõhus tehnika rakkude lagunemiseks ja ühendite vabastamiseks.

Mikroobirakkude tehased on metaboolselt konstrueeritud rakud, mida kasutatakse erinevate väärtuslike ühendite sünteesiks. Ultraheli rakkude häirimine on tõhus ja usaldusväärne meetod väärtuslike ühendite vabastamiseks raku sisemusest.
uurimus ja graafik: ©Villaverde, 2010.

Ultraheli rakkude katkestajate eelised

Mittetermilise, kerge, kuid väga tõhusa tehnoloogiana kasutatakse ultraheli häireid laboris ja tööstuses rakkude lüüsimiseks ja kvaliteetsete ekstraktide tootmiseks, nt kasutatakse molekulide eraldamiseks rakutehastest.

Power-ultraheli mikroobirakkude tehaste tõhusaks katkestamiseks

Ultraheli rakkude katkestajate mehhanism ja mõju:
Ultraheli rakkude katkestamine kasutas ultraheli lainete jõudu. Ultraheli homogenisaator / raku katkestaja on varustatud titaanisulamist valmistatud sondiga (aka sonotrode), mis võngub kõrgel sagedusel umbes 20 kHz. See tähendab, et ultraheli sond ühendab ultraheliga töödeldud vedelikku 20 000 vibratsiooni sekundis. Vedelikuga ühendatud ultraheli laineid iseloomustavad vahelduvad kõrgsurve / madala rõhu tsüklid. Madala rõhu tsükli ajal vedelik laieneb ja tekivad minutilised vaakummullid. Need väga väikesed mullid kasvavad mitme vahelduva rõhutsükli jooksul, kuni nad ei suuda täiendavat energiat absorbeerida. Sel hetkel implodeeruvad kavitatsioonimullid ägedalt ja loovad lokaalselt erakordse energiatiheda keskkonna. Seda nähtust nimetatakse akustiliseks kavitatsiooniks ja seda iseloomustavad lokaalselt väga kõrged temperatuurid, väga kõrged rõhud ja nihkejõud. Need nihkepinged lõhuvad tõhusalt rakuseinu ja suurendavad massiülekannet raku sisemuse ja ümbritseva lahusti vahel. Puhtalt mehaanilise tehnikana kasutatakse laialdaselt ultraheli genereeritud nihkejõude ja soovitatavat protseduuri bakterirakkude katkestamiseks, samuti valkude eraldamiseks. Lihtsa ja kiire rakkude katkestamise meetodina on ultrahelitöötlus ideaalne väikeste, keskmise suurusega ja suurte mahtude eraldamiseks. Hielscheri digitaalsed ultrasonikaatorid on varustatud selge menüüga seadete täpseks ultrahelitöötluse juhtimiseks. Kõik ultrahelitöötluse andmed salvestatakse automaatselt sisseehitatud SD-kaardile ja on lihtsalt kättesaadavad. Soojuse hajutamise keerukad võimalused, nagu väline jahutus, ultrahelitöötlus pulsirežiimis jne ultraheli lagunemisprotsessi ajal, tagavad ideaalse protsessitemperatuuri säilitamise ja seeläbi ekstraheeritud soojustundlike ühendite puutumatuse.

Uuringud rõhutavad ultraheli rakkude katkemise ja ekstraheerimise tugevaid külgi

(2017) jätkab oma uuringus, et "ultraheli abil ekstraheerimine on roheline ja majanduslikult elujõuline alternatiiv tavapärastele toiduainete ja looduslike toodete tehnikatele. Peamised eelised on ekstraheerimis- ja töötlemisaja vähenemine, kasutatud energia ja lahustite kogus, ühiktoimingud ja CO₂ heitkogused."
(2014) kasutasid DNA vabastamiseks spooride lüüsi uuringus kõrgsurve homogenisaatorit ja ultrahelirakkude dsintegraatorit. Võrreldes mõlemat rakkude katkestamise meetodit, järeldab uurimisrühm, et spooride DNA rakulüüsi osas on "analüüs tehtud, kasutades rakulüsaate kõrgsurve homogeniseerimisest. Hiljem mõistsime, et ultraheli rakkude häirimisel on selleks otstarbeks silmapaistvad eelised. See on üsna kiire ja seda saab töödelda väikeste proovimahtude jaoks. (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Rakutehaste biomolekulid toiduainete tootmiseks

Mikroobirakkude tehased on elujõuline ja tõhus tootmismetoodika, mis kasutab mikroobseid organisme, et toota mikroobsete ja mitte-natiivsete metaboliitide suurt saagikust mikroobsete mikroorganismide, nagu bakterid, pärmid, seened jne, metaboolse biotehnoloogia abil. Hulgiensüüme toodetakse näiteks mikroorganismide abil nagu Aspergillus oryzae, seened ja bakterid. Neid hulgiensüüme kasutatakse toidu ja jookide tootmiseks, samuti põllumajanduses, bioenergias ja majapidamises.
Teatud bakterid nagu Acetobacter xylinum ja Gluconacetobacter xylinus toodavad tselluloosi käärimisprotsessi käigus, kus nanokiud sünteesitakse alt-üles protsessis. Bakteriaalne tselluloos (tuntud ka kui mikroobne tselluloos) on keemiliselt samaväärne taimse tselluloosiga, kuid sellel on kõrge kristallilisuse aste ja kõrge puhtusaste (ilma ligniini, hemitselluloosi, pektiini ja muude biogeensete komponentideta), samuti tselluloosi nanokiududega kootud kolmemõõtmelise (3D) võrkkesta ainulaadne struktuur. (vrd Zhong, 2020) Võrreldes taimset päritolu tselluloosiga on bakteriaalne tselluloos jätkusuutlikum ja toodetud tselluloos on puhas, vajamata keerulisi puhastusetappe. Ultraheli ja lahusti ekstraheerimine NaOH või SDS (naatriumdodetsüülsulfaat) abil on väga tõhusad bakteriaalse tselluloosi eraldamiseks bakterirakkudest.

Biomolekulid rakutehastest farmaatsia- ja vaktsiinitootmiseks

Üks silmapaistvamaid rakutehastest saadud farmaatsiatooteid on iniminsuliin. Biotehnoloogilise insuliini tootmiseks kasutatakse peamiselt E. coli ja Saccharomyces cerevisiae'd. Kuna biosünteesitud nanosuuruses molekulid pakuvad suurt bioühilduvust, on bioloogilised nanoosakesed, nagu ferritiin, kasulikud paljude biotöötlusrakenduste jaoks. Lisaks on metaboolselt konstrueeritud mikroobide tootmine saadud saagises sageli oluliselt tõhusam. Näiteks artemisiinhappe, resveratrooli ja lükopeeni tootmine on kasvanud kümnekordselt mitmesaja kordini ning on juba välja kujunenud või arenemas tööstuslikuks tootmiseks. (vrd Liu et al.; Mikroob. Raku fakt. 2017)
Näiteks on vaktsiini väljatöötamiseks eriti huvitavad valgupõhised nanosuuruses biomolekulid, millel on isekoostuvad omadused, nagu ferritiin ja viirusetaolised osakesed, kuna need jäljendavad nii patogeenide suurust kui ka struktuuri ning on võimelised antigeene pinnakonjugeerima, et soodustada koostoimet immuunrakkudega. Sellised molekulid ekspresseeritakse nn rakutehastes (nt konstrueeritud E. coli tüved), mis toodavad teatud sihtmolekuli.

Ultraheli lüüsi protokoll ja E. coli BL21 ferritiini vabastamiseks

Ferritiin on valk, mille esmane funktsioon on raua säilitamine. Ferritiin näitab paljulubavaid võimeid ise kokkupandavate nanoosakestena vaktsiinides, kus seda kasutatakse vaktsiinide manustamise vahendina (nt SARS-Cov-2 ogavalgud). Teaduslikud uuringud Sun et. (2016) näitab, et rekombinantne ferritiin võib vabaneda lahustuva vormina Escherichia coli'st madalatel NaCl kontsentratsioonidel (≤50 mmol/l). Ferritiini ekspresseerimiseks E. coli BL21-s ja ferrtiini vabastamiseks rakendati edukalt järgmist protokolli. Rekombinantne pET-28a/ferritiini plasmiid muundati E coli BL21 (DE3) tüveks. Ferritiini E coli BL21 (DE3) rakke kultiveeriti LB kasvukeskkonnas 0,5% kanamütsiiniga 37 ° C juures ja indutseeriti OD600 juures 0,6 0,4% isopropüül-β-D-tiogalaktopüranosiidiga 3 tundi 37 ° C juures. Seejärel koguti lõppkultuur tsentrifuugimise teel 8000 g juures 10 minutit 4 °C juures ja pellet koguti kokku. Seejärel resuspendeeriti pellet LB söötmes (1% NaCl, 1% tüfoon, 0,5% pärmiekstrakt)/lüüsipuhvris (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) ja erinevates NaCl lahuse kontsentratsioonides (vastavalt 0, 50, 100, 170 ja 300 mmol/L). Bakterirakkude lüüsi puhul rakendati ultrahelitöötlust impulsi režiimis: nt kasutades Ultrasonikaator UP400St 100% amplituudiga töötsükliga 5 sekundit SEES, 10 sekundit VÄLJAS, 40 tsüklit) ja seejärel tsentrifuugitakse 10 000 g juures 15 minutit 4 °C juures. Supernatanti ja sadet analüüsiti naatriumdodetsüülsulfaadi polüakrüülamiidgeeli elektroforeesiga (SDS-PAGE). Kõik naatriumdodetsüülsulfaadiga värvitud geelid skaneeriti kõrgresolutsiooniga skanneriga. Geelipilte analüüsiti Magic Chemi 1D tarkvara abil. Optimaalse selguse huvides tuvastati parameetrite reguleerimisega valguribad. Ansamblite andmed saadi tehnilistest kolmikutest. (vrd Sun et al., 2016)

Ultraheli rakkude häirijad rakutehaste tööstuslikuks lüüsiks

Ultraheli lüüs ja ekstraheerimine on usaldusväärne ja mugav meetod metaboliitide vabastamiseks rakutehastest, aidates seeläbi kaasa sihtmolekulide tõhusale tootmisele. Ultraheli rakkude katkestajad on saadaval laborist tööstuslikule suurusele ja protsesse saab skaleerida täiesti lineaarselt.
Hielscher Ultrasonics on teie pädev partner suure jõudlusega ultraheli häirijate jaoks ja tal on pikaajaline kogemus ultraheli süsteemide implanteerimise valdkonnas pink-top ja tööstuslikes seadetes.
Kui tegemist on keeruka riist- ja tarkvaraga, siis Hielscher Ultrasonics rakkude katkestamise süsteemid täidavad kõiki nõudeid optimaalse protsessi juhtimise, lihtsa kasutamise ja kasutajasõbralikkuse kohta. Hielscheri ultrasonikaatorite kliendid ja kasutaja hindavad kasu, mida Hielscheri ultraheli rakkude häirijad ja ekstraktorid võimaldavad protsessi täpset jälgimist ja kontrolli – digitaalse puuteekraani ja brauseri kaugjuhtimispuldi kaudu. Kõik olulised ultrahelitöötluse andmed (nt netoenergia, koguenergia, amplituud, kestus, temperatuur, rõhk) salvestatakse automaatselt CSV-failina integreeritud SD-kaardile. See aitab saada reprodutseeritavaid ja korratavaid tulemusi ning hõlbustab protsesside standardimist ja heade tootmistavade (cGMP) täitmist.
Loomulikult on Hielscheri ultraheli protsessorid ehitatud 24/7 tööks täiskoormusel ja neid saab seetõttu usaldusväärselt kasutada tööstuslikes tootmisseadetes. Kõrge töökindluse ja madala hoolduse tõttu on ultraheli seadmete seisakud tõesti madalad. CIP (clean-in-place) ja SIP (steriliseerimine kohapeal) omadused minimeerivad töömahukat puhastamist, eriti kuna kõik märjad osad on siledad metallpinnad (puuduvad peidetud avad või düüsid).

Allolev tabel annab teile ülevaate meie ultrasonikaatorite ligikaudsest töötlemisvõimsusest: