Bioloogiliselt muundatud rakkude ultraheli lüüs tööstuslikus tootmises

Bioloogiliselt muundatud bakteriliike, näiteks E. coli, ning geneetiliselt muundatud imetaja- ja taimerakutüüpe kasutatakse biotehnoloogias laialdaselt molekulide ekspresseerimiseks. Nende sünteesitud biomolekulide vabastamiseks on vaja usaldusväärset rakkude lõhkumise meetodit. Suure jõudlusega ultraheli töötlus on tõestatud meetod tõhusaks ja usaldusväärseks rakkude lüüsiks – seda on lihtne skaleerida suurtele läbilaskevõimetele. Hielscher Ultrasonics pakub teile suure jõudlusega ultraheliseadmeid tõhusaks rakkude lüüsiks, et toota suuri koguseid kvaliteetseid biomolekule.

Molekulide ekstraheerimine rakutehastest

Paljude erinevate biomolekulide tootmiseks saab mikroobsete rakutehastena kasutada mitmesuguseid muundatud mikroobe ja taimerakke, sealhulgas Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana ja vetikaid, muu hulgas veel paljusid teisi. Need rakutehased võivad toota valke, lipiide, biokemikaale, polümeere, biokütuseid ja oleokemikaale, mida kasutatakse toiduna või tööstuslike rakenduste tooraineks. Rakutehastena kasutatavaid rakke kasvatatakse suletud bioreaktorites, kus nad võivad saavutada suure tõhususe, spetsiifilisuse ja madala energiavajaduse.
Sihtmolekulide eraldamiseks bioloogiliselt muundatud rakukultuuridest tuleb rakud lõhkuda, et rakusisene materjal vabaneks. Ultraheli rakulõhkujad on hästi väljakujunenud väga usaldusväärse ja tõhusa meetodina rakkude desintegreerimiseks ja ühendite vabastamiseks.

Mikroobsed rakutehased on metaboolselt muundatud rakud, mida kasutatakse mitmesuguste väärtuslike ühendite sünteesiks. Ultraheli abil rakkude lõhkumine (desintegreerimine) on tõhus ja usaldusväärne meetod väärtuslike ühendite vabastamiseks raku seest.
uuring ja graafika: ©Villaverde, 2010.

Ultraheli rakulõhkujate eelised

Mittetermilise, õrna, kuid väga tõhusa tehnoloogiana kasutatakse ultraheli lõhkujaid laboris ja tööstuses rakkude lüüsimiseks ning kvaliteetsete ekstraktide tootmiseks, nt molekulide eraldamiseks rakutehastest.

Võimsusultraheli mikroobsete rakutehaste tõhusaks lõhkumiseks

Ultraheli rakulõhkujate toimemehhanism ja mõjud:
Ultraheli abil toimuv rakkude lõhkumine kasutab ultrahelilainete jõudu. Ultraheli homogenisaator / rakulõhkuja on varustatud sondiga (ehk sonotroodiga), mis on valmistatud titaanisulamist ja võngub kõrgel sagedusel ligikaudu 20 kHz. See tähendab, et ultrahelisond juhib sonikeeritavasse vedelikku 20 000 võnget sekundis. Vedelikku juhitud ultrahelilaineid iseloomustavad vahelduvad kõrgsurve- ja madalsurvetsüklid. Madalsurvetsükli ajal vedelik paisub ja tekivad pisikesed vaakumimullid. Need väga väikesed mullid kasvavad mitme vahelduva survetsükli jooksul, kuni nad ei suuda enam energiat juurde neelata. Sel hetkel kavitatsioonimullid implodeeruvad vägivaldselt ja tekitavad lokaalselt erakordselt energiatiheda keskkonna. Seda nähtust tuntakse akustilise kavitatsioonina ning seda iseloomustavad lokaalselt väga kõrged temperatuurid, väga kõrged rõhud ja nihkejõud. Need nihkepinged purustavad tõhusalt rakuseinu ja suurendavad massiülekannet rakusisemuse ja ümbritseva lahusti vahel. Puhtalt mehaanilise meetodina on ultrahelis tekitatud nihkejõud laialdaselt kasutusel ning soovitatav protseduur bakterirakkude lõhkumiseks, samuti valkude isoleerimiseks. Lihtsa ja kiire rakkude lõhkumise meetodina sobib sonikeerimine ideaalselt väikeste, keskmiste ja suurte mahtude isoleerimiseks. Hielscheri digitaalsed sonikaatorid on varustatud selge seadete menüüga ultraheli töötluse täpseks juhtimiseks. Kõik sonikeerimise andmed salvestatakse automaatselt sisseehitatud SD-kaardile ja need on lihtsasti kättesaadavad. Keerukad soojuse hajutamise võimalused, nagu väline jahutus, sonikeerimine impulssrežiimis jms ultraheliga desintegreerimise protsessi ajal, tagavad ideaalse protsessitemperatuuri säilimise ja seeläbi ekstraheeritud kuumustundlike ühendite terviklikkuse.

Uuringud toonitavad ultraheli abil toimuva rakkude lõhkumise ja ekstraheerimise tugevusi

Prof. Chemat et al. (2017) võtab oma uuringus kokku, et „ultraheliga toetatud ekstraheerimine on roheline ja majanduslikult elujõuline alternatiiv toidu ja looduslike saaduste tavapärastele meetoditele. Peamised eelised on ekstraheerimis- ja töötlemisaja, kasutatava energia- ja lahustikoguse, ühikoperatsioonide ning CO₂ heitkoguste vähenemine.”
Gabig-Ciminska et al. (2014) kasutasid oma uuringus spooride lüüsimiseks DNA vabastamise eesmärgil kõrgsurvehomogenisaatorit ja ultraheli rakudesintegraatorit. Kahte rakkude lõhkumise meetodit võrreldes jõuab uurimisrühm järeldusele, et spoori-DNA rakulüüsi osas „on analüüs tehtud kõrgsurvehomogeniseerimisel saadud rakulüsaate kasutades. Hiljem mõistsime, et ultraheli abil toimuval rakkude lõhkumisel on selleks otstarbeks silmapaistvad eelised. See on üsna kiire ja seda saab rakendada väikeste proovimahtude puhul.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Rakutehaste biomolekulid toiduainete tootmiseks

Mikroobsed rakutehased on elujõuline ja tõhus tootmismeetod, mis kasutab mikroorganisme looduslike ja mittelooduslike metaboliitide suure saagise tootmiseks, rakendades mikroobsete organismide, nagu bakterite, pärmide, seente jms, metaboolset biotehnoloogilist muundamist. Massensüüme toodetakse näiteks mikroorganismidega, nagu Aspergillus oryzae, seened ja bakterid. Neid massensüüme kasutatakse toidu- ja joogitootmises, aga ka põllumajanduses, bioenergias ja majapidamishoolduses.
Teatud bakterid, nagu Acetobacter xylinum ja Gluconacetobacter xylinus, toodavad fermentatsiooniprotsessi käigus tselluloosi, kus nanokiud sünteesitakse alt-üles protsessis. Bakteriaalne tselluloos (tuntud ka kui mikroobne tselluloos) on keemiliselt samaväärne taimse tselluloosiga, kuid sellel on kõrge kristallilisuse aste ja kõrge puhtus (vaba ligniinist, hemitselluloosist, pektiinist ja teistest biogeensetest komponentidest) ning ainulaadne tselluloosi nanokiududest kootud kolmemõõtmeline (3D) võrgustik. (vrd Zhong, 2020) Võrreldes taimset päritolu tselluloosiga on bakteriaalne tselluloos jätkusuutlikum ja toodetud tselluloos on puhas, mistõttu ei vaja keerukaid puhastusetappe. Ultraheli töötlus (sonikeerimine) ja lahustiga ekstraheerimine NaOH või SDS-iga (naatriumdodetsüülsulfaat) on bakteriaalse tselluloosi eraldamiseks bakterirakkudest väga tõhusad.

Biomolekulid rakutehastest farmaatsia- ja vaktsiinitootmiseks

Üks silmapaistvamaid rakutehastest saadud farmaatsiatooteid on inimese insuliin. Bioinseneeritud insuliini tootmiseks kasutatakse peamiselt E. coli ja Saccharomyces cerevisiae. Kuna biosünteesitud nanosuuruses molekulid pakuvad kõrget biosobivust, on bioloogilised nanoosakesed, nagu ferritiin, kasulikud paljudes biotootmise rakendustes. Lisaks on tootmine metaboolselt muundatud mikroobides saadud saagise poolest sageli märkimisväärselt tõhusam. Näiteks on artemisiinhappe, resveratrooli ja lükopeeni tootmine suurenenud kümnekordselt kuni mitusada korda ning on juba kasutusel või arendamisel tööstusliku mastaabiga tootmiseks. (vrd Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Näiteks on isekoonduvate omadustega valgupõhised nanosuuruses biomolekulid, nagu ferritiin ja viirusetaolised osakesed, vaktsiinide arendamiseks eriti huvipakkuvad, kuna need jäljendavad nii patogeenide suurust kui ka struktuuri ning sobivad antigeenide pinnakonjugatsiooniks, et soodustada koostoimet immuunrakkudega. Selliseid molekule ekspresseeritakse nn rakutehastes (nt muundatud E. coli tüvedes), mis toodavad teatud sihtmolekuli.

Ultraheliga lüüsimise ja E. coli BL21 protokoll ferritiini vabastamiseks

Ferritiin on valk, mille peamine ülesanne on raua säilitamine. Ferritiin näitab paljutõotavaid võimalusi isekoonduvate nanoosakestena vaktsiinides, kus seda kasutatakse vaktsiini kandjana (nt SARS-Cov-2 spike-valgud). Sun et. al. (2016) teadusuuring näitab, et rekombinantset ferritiini saab Escherichia coli’st vabastada lahustuval kujul madalatel NaCl kontsentratsioonidel (≤50 mmol/L). Ferritiini ekspresseerimiseks E. coli BL21-s ja ferrtiini vabastamiseks rakendati edukalt järgmist protokolli. Rekombinantne pET-28a/ferritin plasmiid transformeeriti E coli BL21 (DE3) tüvesse. Ferritiini E coli BL21 (DE3) rakke kasvatati LB kasvukeskkonnas 0,5% kanamütsiiniga temperatuuril 37°C ning indutseeriti OD600 väärtusel 0,6 0,4% isopropüül-β-D-tiogalaktopüranosiidiga 3 tunni jooksul temperatuuril 37°C. Lõplik kultuur koguti seejärel tsentrifuugimisega kiirusel 8000g 10 minutit temperatuuril 4°C ja sade koguti. Seejärel suspendeeriti sade uuesti LB keskkonnas (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% pärmiekstrakt)/lüüsipuhvris (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) ja erinevate kontsentratsioonidega NaCl lahuses (vastavalt 0, 50, 100, 170 ja 300 mmol/L). Bakterirakkude lüüsimiseks rakendati sonikeerimist impulssrežiimis: nt kasutades ultraheli seadet UP400St 100% amplituudil, töötsükliga 5 sekundit sees, 10 sekundit väljas, 40 tsüklit) ja seejärel tsentrifuugiti kiirusel 10 000g 15 minutit temperatuuril 4°C. Supernatant ja sade analüüsiti naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidgeelelektroforeesi (SDS-PAGE) abil. Kõik naatriumdodetsüülsulfaadiga värvitud geelid skaneeriti kõrge eraldusvõimega skanneriga. Geelipilte analüüsiti tarkvaraga Magic Chemi 1D. Optimaalse selguse saavutamiseks tuvastati valgutriibud parameetreid kohandades. Triipude andmed saadi tehnilistest kolmekordsetest kordustest. (vrd Sun et al., 2016)

Ultraheli rakulõhkujad rakutehaste tööstuslikuks lüüsiks

Ultraheli lüüs ja ekstraktsioon on usaldusväärne ja mugav meetod metaboliitide vabastamiseks rakutehastest, toetades seeläbi sihtmolekulide tõhusat tootmist. Ultraheli rakulõhkujad on saadaval laborimõõtmetest tööstusliku suuruseni ning protsesse saab skaleerida täiesti lineaarselt.
Hielscher Ultrasonics on teie pädev partner suure jõudlusega ultraheli lõhkujate osas ning tal on pikaajaline kogemus ultraheli süsteemide kasutuselevõtul laua- ja tööstuslikes tingimustes.
Keerukate riist- ja tarkvaralahenduste osas vastavad Hielscher Ultrasonicsi rakkude lõhkumise süsteemid kõigile optimaalse protsessijuhtimise, lihtsa kasutamise ja kasutajasõbralikkuse nõuetele. Hielscher ultrasonicatorite kliendid ja kasutajad hindavad eelist, et Hielscheri ultraheli rakulõhkujad ja ekstraktorid võimaldavad täpset protsessi jälgimist ja juhtimist – digitaalse puuteekraani ja brauseri kaugjuhtimise kaudu. Kõik olulised sonikeerimisandmed (nt netoenergia, koguenergia, amplituud, kestus, temperatuur, rõhk) salvestatakse automaatselt CSV-failina integreeritud SD-kaardile. See aitab saada reprodutseeritavaid ja korratavaid tulemusi ning hõlbustab protsessi standardimist ning heade tootmistavade (cGMP) täitmist.
Muidugi on Hielscheri ultraheli protsessorid ehitatud 24/7 tööks täiskoormusel ja neid saab seetõttu usaldusväärselt kasutada tööstuslikes tootmistingimustes. Tänu suurele töökindlusele ja väikesele hooldusvajadusele on ultraheliseadmete seisakuaeg tõesti väga lühike. CIP (clean-in-place) ja SIP (sterilize-in-place) funktsioonid vähendavad töömahukat puhastamist, eriti kuna kõik vedelikuga kokkupuutuvad osad on siledad metallpinnad (ilma peidetud avade või düüsideta).

Alljärgnev tabel annab ülevaate meie ultrahelitöötlusseadmete ligikaudsest töötlemisvõimsusest: