Kuidas sonikatsioon võib lüsosüümi bakterirakkude lüüsi jaoks ülelaadida
, Kathrin Hielscher, avaldatud Hielscheri uudistes
Bakterirakkude lõhkumine on kriitiline samm biotehnoloogias, farmaatsiauuringutes ja valkude tootmises. Üheks kõige levinumaks vahendiks on lüsosüüm, ensüüm, mis nõrgestab bakterite rakuseinu. Kuid kuigi lüsosüüm on tõhus, ei ole see sageli piisavalt kiire või võimas, et seda kasutada. – eriti kui tegemist on tihedate kultuuride või valkude üleekspresseerimiseks loodud bakteritega.
Siinkohal tulebki mängu sonikatsioon. Teadlased tuginevad üha enam ultrahelitöötlusele, et oluliselt parandada lüsosüümidel põhinevat rakulüüsi. Lüsosüümi ja sonikatsioon moodustavad koos kasutades väga tõhusa, täiendava süsteemi, mis annab kiiremaid, täielikumad ja paremini korratavaid tulemusi.
Miks lüsosüüm üksi jääb sageli puudulikuks
Lüsosüüm lagundab peptidoglükaani, mis on bakterite rakuseinte peamine struktuuriline komponent. See ensümaatiline lähenemisviis on õrn ja laialdaselt kasutatav, eriti E. coli puhul. Reaalsetes laboritingimustes võib lüsosüümiga töötlemine üksi olla siiski piirav.
Levinud väljakutsed on järgmised:
- Rakkude mittetäielik lagunemine suure tihedusega või agregeeritud kultuurides
- Pikk inkubatsiooniaeg
- Vähenenud tõhusus üleekspresseerivate või stressiga kohanenud bakterite puhul
- Partiide erinevus
Need piirangud võivad negatiivselt mõjutada järgnevaid protsesse, nagu valkude ekstraheerimine, selitamine ja puhastamine, vähendades lõppkokkuvõttes saagist ja järjepidevust.
Lüsosüümi ja sonatsiooni sünergia taga olev teadus
Soniseerimine toob vedelikuproovi sisse suure intensiivsusega ultrahelilained. Need lained tekitavad mikroskoopilisi mullid, mis kiiresti kokku kukuvad protsessis, mida nimetatakse kavitatsiooniks. Tekkinud nihkejõud, rõhumuutused ja mikrojugad lõhuvad füüsiliselt rakustruktuure.
Kui sonikatsiooni kasutatakse pärast või koos lüsotsüümtöötlusega, tugevdavad need kaks meetodit teineteist mitmel olulisel viisil:
- Lihtsam juurdepääs rakuseinale
Lüsosüüm nõrgestab bakterite rakuseinu, muutes selle palju haavatavamaks ultraheli poolt tekitatud mehaaniliste jõudude suhtes. - Kiirem rakkude lüüs
Ultraheli energia lühendab oluliselt aega, mis on vajalik rakkude täieliku lagunemise saavutamiseks, võrreldes ainult ensüümse töötlemisega. - Ühetaolisem töötlemine
Soniseerimine parandab segunemist, tagades, et kõik rakud puutuvad ühtlaselt kokku nii lüsosüümi kui ka mehaanilise stressiga. - Suurem valgusaagikus
Täielikum lüüs tähendab suuremat rakusiseste valkude, ensüümide ja metaboliitide vabanemist, mis parandab üldist taastumist.
Tüüpiline lüsosüümiga toetatud sonikatsiooni tööprotsess
Laboratooriumides, mis töötavad üleekspresseerivate bakteritüvedega, kombineeritakse ensümaatilist ja ultraheli lüüsi:
- Rakkude resuspensioon
Korjatud bakterite graanulid resuspendeeritakse sobivas lüüsipuhvris, mis sisaldab lüsosüümi, tavaliselt kontsentratsioonis 0,1-1 mg/ml. Kerge soniseerimine soodustab rakkude kiiret ja ühtlast resuspensiooni. - Ensümaatiline eeltöötlus
Suspensiooni inkubeeritakse 10-30 minutit kontrollitud temperatuuril (tavaliselt 4 °C ja 25 °C vahel), mis võimaldab lüsosüümil rakuseina nõrgestada. - ultraheli häired
Eeltöödeldud suspensioon sonikatsioonitakse Hielscheri ultraheliprotsessoriga, mille amplituud, impulssrežiim ja jahutus on optimeeritud. - Selgitus
Rakkude jäägid eemaldatakse tsentrifuugimise või filtreerimise teel, jättes selitatud lüsaadi, mis on rikas sihtvalkude poolest.
Miks teadlased valivad Hielscher Sonicators
Hielscheri ultrahelilaatorid sobivad tänu oma täpsusele ja paindlikkusele eriti hästi lüsosüümide abil toimuvaks rakulüüsiks. Peamised eelised on järgmised:
- Reguleeritav amplituud ja energiasisend korratavaks töötlemiseks
- Impulssrežiim, et vähendada kuumuse teket
- Tõhus kavitatsioon laias mahu- ja viskoossusvahemikus
- Lihtne skaleeritavus mikroliitrilistest laboriproovidest kuni tööstusliku tootmiseni
See kombinatsioon muudab Hielscheri süsteemid väärtuslikeks tööriistadeks nii teaduslaboratooriumides kui ka suuremahulistes tootmiskeskkondades.
Mitme kaevuga plaadi sonikaatori UIP400MTP suure läbilaskevõimega proovi ettevalmistamiseks
Tulemuste optimeerimise põhitegurid
Selleks, et saada lüsosüümide abil toimuvast sonikatsioonist kõige rohkem kasu, häälestavad teadlased hoolikalt mitmeid parameetreid:
- Lüsosüümi kontsentratsioon: Kasutage väikseimat efektiivset annust, et kontrollida kulusid ja minimeerida allapoole suunatud häireid.
- Ultraheli energia: Rakendage piisavalt võimsust, et tagada täielik lüüs, kahjustamata seejuures tundlikke valke.
- Temperatuuri juhtimine: Jahutussüsteemid või jäävannid aitavad kaitsta kuumuse suhtes tundlikke sihtmärke.
- Impulsside seaded: Aeg-ajalt toimuv sonikatsioon parandab kavitatsiooni tõhusust ja proovi stabiilsust.
Boost Lysosüümide Sonication!
Lüsosüümi kombineerimine ultraheli lõhkumisega pakub usaldusväärset ja suure jõudlusega lahendust bakterirakkude lüüsi jaoks. Sonikatsioon suurendab ensümaatilise töötlemise tõhusust, pakkudes kiiremat töötlemist, täielikumat lagundamist ja suuremat rakusiseste toodete saagist.
Täpselt kontrollitavate ja skaleeritavate ultrahelisüsteemidega, nagu need, mis on pärit Hielscherilt, saavad teadlased kohandada oma töövooge vastavalt kaasaegse biotehnoloogia nõudmistele. – kas väikeses laboris või tööstuslikul tootmisliinil.
Bakterite lüüs kõrge läbilaskevõimega koos UIP400MTP mikroplaatide sonikaatoriga
Kirjandus / Viited
- Ghosh, A., Bhar, K. & Siddhanta, A. (2019): Oxygen sequestration by Leghemoglobin is positively regulated via its interaction with another late nodulin, Nlj16 of Lotus japonicus. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology 28, 2019. 414–423.
- Hannah K. Lembke; Adeline Espinasse; Mckenna G. Hanson; Christian J. Grimme;Zhe Tan; Theresa M. Reineke; Erin E. Carlson (2023): Cationic Polymers Enable Internalization of Negatively Charged Chemical Probes into Bacteria. ACS Chem Biol . 2023 September 15; 18(9): 2063–2072.
- Müller MRA, Ehrmann MA, Vogel RF (2000): Multiplex PCR for the Detection ofLactobacillus pontis and Two Related Species in a Sourdough Fermentation. Applied Environmental Microbiology 66, 2000.
- Di Giosia, Matteo; Bomans, Paul; Bottoni, Andrea; Cantelli, Andrea; Falini, Giuseppe; Franchi, Paola; Guarracino, Giuseppe; Friedrich, Heiner; Lucarini, Marco; Paolucci, Francesco; Rapino, Stefania; Sommerdijk, Nico; Soldà, Alice; valle, Francesco ; Zerbetto, Francesco; Calvaresi, Matteo (2018): Proteins as Supramolecular Hosts for C60: A True Solution of C60 in Water. Nanoscale 10(21); 2018.
Korduma kippuvad küsimused
Mis on lüsosüümid?
Lüsosüümid on antimikroobsed ensüümid, mis katalüüsivad β(1→4) glükosiidsete sidemete hüdrolüüsi peptidoglükaanis, mis on bakterite rakuseinte peamine struktuuriline komponent, mis viib rakuseina nõrgenemiseni ja lüüsi, eriti Gram-positiivsete bakterite ja permeabiliseeritud Gram-negatiivsete rakkude puhul.
Millised on rakulüüsi eelised ja piirangud lüsosoomide abil?
Raku lüüsimisel lüsosüümide abil on eeliseid, nagu näiteks kerged reaktsioonitingimused, valkude funktsionaalsuse säilitamine ja madal mehaaniline koormus, kuid seda piiravad aeglane kineetika, ebatäielik lüüs tihedates või resistentsetes bakterikultuurides, vähene tõhusus intaktsete Gram-negatiivsete välismembraanide suhtes ning muutlikkus sõltuvalt raku füsioloogiast ja kasvutingimustest.
Kuidas sonikatsioon intensiivistab lüsosüüme?
Soniseerimine intensiivistab lüsosüümi aktiivsust, lõhkudes ja permeabiliseerides mehaaniliselt bakterite rakuseinu kavitatsioonist tingitud nihkejõudude abil, mis suurendab ensüümi juurdepääsu peptidoglükaanile, kiirendab lüüsi kineetikat ning põhjustab rakkude täielikumat ja homogeensemat lõhustamist.
Hielscher Multi-Sample Sonicator mudelid UIP400MTP mikroplaatidele, VialTweeter ja CupHorn: kiire ja suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistamine