Plasmiidi ettevalmistamine ultraheli abil

Ultraheli on usaldusväärne meetod plasmiidi DNA fragmenteerimiseks. Täpselt kontrollitav amplituud, pulsatsioonirežiim ja temperatuuri reguleerimine on ultrasonikaatori kõige olulisemad omadused mittekahjustava plasmiidi killustumise jaoks. Lisaks aitab teatud ainete kasutamine kaitsta plasmiidi lagunemise eest. Hielscher Ultrasonics pakub erinevaid lahendusi kontrollitud plasmiidide killustumiseks üksikutest viaalidest, samaaegselt paljude proovide ultrahelitöötlusega ja mitme kaevu plaatidega. Lisateave eduka ultraheli plasmiidi killustatuse kohta!

Plasmiid lõikamine ultraheli abil

Kui DNA proovid allutatakse ultraheli lainetele, tekitavad ultraheli tekitatud vibratsioonid vedelikus akustilise kavitatsiooni, mis lõikab või purustab suure molekulmassiga DNA molekule mehaaniliste jõudude kaudu. Sonikatsioon on kõige laialdasemalt kasutatav meetod DNA lahtilõikamiskatsetes, sealhulgas rakendustes, näiteks kromatiini immunoprecipitatsioonis (ChIP), mille jaoks väikesed fragmentide suurused on kõrge eraldusvõime saavutamiseks üliolulised. (vrd Tseng et al., 2012)
PlasmiidNE DNA (pDNA) on DNA spetsiifiline vorm, mida iseloomustab selle rõnga kuju ja mida leidub bakterites ja mõnedes eukarüootides.
Ülekoormatud pDNA on plasmiidi DNA soovitud vorm, kuna see näitab parimaid tulemusi allavoolu protsessides, nagu automatiseeritud sekveneerimine ja transfektsioon. Ultraheli sobib pDNA, sealhulgas ülekoormatud pDNA, edukaks killustamiseks.
(2008) näitas, et plasmiidne ultrahelitöötlus, mis teadaolevalt killustab ülekoormatud DNA-d, on tõhus viis järjestuse phred20 lugemispikkuste parandamiseks niivõrd, et need ei erine oluliselt Beckman Coulteri kontrollmallist või ensümaatiliselt lineariseeritud plasmiididest.

Plasmiidvektorite kasutamine

Plasmiide kasutatakse sageli geenide kloonimise, ülekandmise ja manipuleerimise vahendina. Kui plasmiide kasutatakse nendel eesmärkidel eksperimentaalselt, nimetatakse neid vektoriteks. DNA fragmente või geene saab sisestada plasmiidvektorisse, luues nn rekombinantse plasmiidi. Plasmiidvektoreid kasutatakse kandjatena rekombinantse DNA juhtimiseks peremeesrakku ja need on molekulaarse kloonimise põhikomponent.
“Mitteviiruslikke vektoreid uuritakse põhjalikult nende võimaliku kasutamise kohta geeniteraapias erinevate keeruliste haiguste raviks. Mitteviiruslikud vektorid kaitsevad plasmiidi DNA-d füüsikalise, keemilise ja ensümaatilise lagunemise eest ning toimetavad DNA molekuli sihtkohta. Näiteks moodustavad katioonsed liposoomid, kitosaan ja muud positiivselt laetud nanoosakesed elektrostaatiliste interaktsioonide kaudu plasmiidi DNA-ga komplekse. Kuid kergesti moodustuvad katioonsed liposoomid / plasmiidi DNA kompleksid on suhteliselt suured (st 300–400 nm) ja heterogeensed, mistõttu neid on raske kasutada farmaatsiarakendustes. Suuri ja heterogeenseid plasmiidseid DNA/liposoome, plasmiidi DNA/aerosoole ja plasmiidi DNA/peptiidide komplekse saab ultraheli abil redutseerida väiksemateks ja homogeenseteks osakesteks.” (Sarker et al., 2019)
Silmapaistev näide plasmiidvektorite kasutamisest on CRISPR–Cas9. CRISPR–Cas9 süsteem tarnitakse rakkudesse tavaliselt ühe suure plasmiidina või mitme väiksema plasmiidina, mis kodeerivad sihtjärjestust, CRISPR-juhikut ja Cas9- d.

DNA-ga koormatud PLGA nanoosakeste ultraheli ettevalmistamine nanoprecipitationi abil

(2020) kasutas polü(piimhappe-ko-glükoolhapet) (PLGA), et moodustada nanoosakeste kandja mudeli CRISPR–Cas9 plasmiidi toimetamiseks primaarsetesse luuüdist saadud makrofaagidesse. PLGA nanoosakeste nanoprecipiteerimiseks kasutati kahe erineva lõpprühmaga (estri ja amiini rühmad) PLGA-d eesmärgiga, et positiivselt laetud amiini otsakapslid suurendaksid kapseldamise efektiivsust ja koormust selle ja DNA negatiivselt laetud selgroo vahelise laengu interaktsiooni tõttu. 50 ml polüpropüleenist koonilises tsentrifuugitorus lahustati 100 mg Pluronic F127 20 ml autoklaavitud DI vees keeriste segamise teel, millele järgnes 30 min õrna ultrahelitöötlust ultrahelivanni abil (vaata CupHorn). Lisati autoklaavitud magnetsegamisriba ja lahust segati 600 pööret minutis 30 minutit, samal ajal kui valmistati teised lahused. Dna mittespetsiifilise adsorptsiooni minimeerimiseks kasutati klaasnõude asemel kogu aeg plastist laboritarbeid. DMF-is lahustatud PLGA lahused (44,48 mg/ ml) ja THF-is lahustatud TIPS pentatseeni lahused (0,667 mg/ml) valmistati eraldi. PLGA jäeti DMF-is 30 minutiks vaikselt märjaks, enne kui see 30 minutiks ultraheliga töödeldakse (täieliku protokolli kohta vt Jo et al., 2020)

Plasmiidi DNA kaitse ultrahelitöötluse ajal

DNA, sealhulgas plasmiidid ja ülekoormatud plasmiidid, on väga tundlik lagunemine. Kõik olemasolevad killunemismeetodid on tuntud teatud puuduste poolest. Ultraheli DNA killustumine on üks eelistatud meetodeid, kuna kontrollitud ultrahelitöötlus koos kaitsemeetmetega võimaldab vähendada DNA ahelate nihke- ja kuumusest põhjustatud kahjustusi.
Lisaks madala amplituudi seadetele, pulsatsioonirežiimile ja temperatuuri reguleerimisele ultraheli DNA lõikamise ajal näitas teatud ainete kasutamine olulist kaitsvat toimet DNA lagunemise vastu. Näiteks kaitsevad erinevad polümeerid, peptiidid ja lipiidid ultraheliuuringu ajal plasmiidi DNA-d.

Plasmiidi DNA stabiilsust ja plasmiidi DNA / IL nanokomplekse ultraheli nihkepinge vastu uuriti agaroosgeeli elektroforeesi testi abil. Nii plasmiidi DNA kui ka plasmiidi DNA / IL nanokompleksid allutati ultraheli nihkepingele erinevatel ajahetkedel. Plasmiidi DNA puutus kokku ultraheli nihkepingega 0, 10, 20, 30 ja 40 minutit. Kuid plasmiidi DNA / IL nanokompleksid puutusid kokku ultraheli nihkepingega 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ja 120 minutit.
(uuring ja pilt: ©Sarker et al., 2019)

(2019) näitas, et kui plasmiidi DNA / ioonse vedeliku (pDNA / IL) nanostruktuuridele allutati ultraheli nihkepinge 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ja 120 min ning see oli kompleksis kaubanduslikult kättesaadava katioonse geeniülekande aine lipofektamiiniga, oli fluorestseeruvate positiivsete rakkude protsent 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, Vastavalt 65% ja 50% (vt allolevat joonist). Fluorestsentspositiivsete rakkude protsent suurenes, kui nanostruktuure allutati ultraheli nihkepingele 10 ja 20 minutit ning seejärel vähenes aeglaselt.

Ioonse vedeliku [Bmim][PF6] mõju plasmiidi DNA kohaletoimetamisele COS7 rakkudesse. Plasmiidi DNA / IL (ioonne vedelik) nanokompleksid allutati ultraheli nihkepingele kuni 120 minutit ja kompleksi LA-ga enne COS7 rakkudesse toimetamist. Andmed näitavad GFP positiivsete HeLa rakkude keskmist arvu (%) loendatud 10 erinevas mikroskoopilises väljas ja katse viidi läbi mitu korda kolmel erineval päeval. (Uuring ja graafik: ©Sarker et al., 2019)

Ultraheli lüsaadi ettevalmistamine

Ultraheli raku lüüsi protokoll
Alustatakse rikastatud rakuprooviga, mis valmistati ette rakkude eraldamise meetodil (nt immunomagnetiline rakkude eraldamine, fluorestsentsaktiveeritud rakkude sorteerimine (FACS), tihedusgradiendi tsentrifuugimine, immunodensity rakkude isoleerimine).
Rakuproovid peavad näitama lüüsipuhvri mahtu, mis sobib eksperimentaalse eesmärgi ja sondi tüüpi ultrasonikaatori jaoks.
Eelistatud on hüpotoonilised puhvrid, kuna need suurendavad ultraheli rakkude lüüsi. On oluline, et lisaaineid ja soola kontsentratsiooni kasutataks asjakohasel viisil.
Valige ultraheli lüüsiseade: Viaalide kaudseks ultrahelitöötluseks on soovitatav VialTweeter või CupHorn. Multiwell-plaatide puhul on UIP400MTP ideaalne ultrasonikaator. Ja klassikaline sondi tüüpi ultrahelitöötlus, ultraheli homogenisaator nagu UP100H või UP200Ht koos mikrootsaga on kõige sobivamad.
Sondi tüüpi ultrahelitöötluse protokoll: Asetage ultrasonikaatori sond mikrotsentrifuugtorusse proovi mahule ja sonikaadige umbes 10 sekundiks. Sõltuvalt DNA-proovist võib ultrahelitöötlust korrata veel üks või kaks korda. Vajalik ultraheli energiasisend (Ws / ml) sõltub proovi viskoossusest ja DNA tüübist. Jahutamine jäävanni ja ultrasonikaatori pulsatsioonirežiimi kaudu aitab vältida proovi termilise lagunemist.
Pärast ultrahelilüüsi tsentrifuugitakse proov pelletijäätmete eraldamiseks (mis sisaldavad sünteesimata rakke, tuumasid ja lüüsimata organelle)
Kui proovi kohe edasi ei töödelda, võib seda elujõulisuse säilitamiseks hoida sobival temperatuuril.

Dna killustatuse ultrasonikaatorid

Hielscher Ultrasonics pakub erinevaid ultrahelipõhiseid platvorme DNA, RNA ja kromatiini killustatuse jaoks. Nende erinevate platvormide hulka kuuluvad ultraheli sondid (sonotroodid), kaudsed ultrahelitöötluslahendused mitme toru või mitmekaevuliste plaatide (nt 96-kaevuplaadid, mikrotiterplaadid), sonorektooride ja ultraheli tasside samaaegseks ettevalmistamiseks. Kõik DNA nihke platvormid töötavad sagedusega häälestatud, suure jõudlusega ultraheli protsessoritega, mis on täpselt kontrollitavad ja annavad reprodutseeritavaid tulemusi.

Ultraheli protsessorid mis tahes proovi numbri ja suuruse jaoks

Hielscheri mitme proovi ultrasonikaatoritega VialTweeter (kuni 10 katseklaasi jaoks) ja UIP400MTP (mikroplaatide / multiwell plaatide jaoks) on intensiivse ja täpselt kontrollitava ultraheliuuringu tõttu hõlpsasti võimalik vähendada proovide töötlemise aega, saades samal ajal soovitud DNA fragmendi suuruse jaotuse ja saagise. Ultraheli DNA killustatus muudab plasmiidi ettevalmistamise etapid tõhusaks, usaldusväärseks ja skaleeritavaks. Protokolle saab lineaarselt skaleerida ühest kuni arvukate proovideni, rakendades konstantseid ultraheli parameetreid.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.