Plasmiidide ettevalmistamine ultraheli abil

Ultraheli on usaldusväärne meetod plasmiidi DNA killustamiseks. Täpselt kontrollitav amplituud, pulsatsioonirežiim ja temperatuuri reguleerimine on ultrasonikaatori kõige olulisemad omadused mittekahjustava plasmiidi killustumiseks. Lisaks aitab teatud ainete kasutamine kaitsta plasmiidi lagunemise eest. Hielscher Ultrasonics pakub erinevaid lahendusi kontrollitud plasmiidide killustumiseks üksikutest viaalidest, samaaegselt paljude proovide ja mitme süvendiga plaatide ultrahelitöötlust. Lisateave eduka ultraheli plasmiidide killustatuse kohta!

Plasmiidi lõikamine ultraheli abil

Kui DNA proovid allutatakse ultraheli lainetele, tekitavad ultraheli genereeritud vibratsioonid akustilise kavitatsiooni vedelikus, mis nihutab või purustab mehaaniliste jõudude abil suure molekulmassiga DNA molekule. Sonikatsioon on kõige laialdasemalt kasutatav meetod DNA lahtiste lõikamiskatsete jaoks, sealhulgas rakendused, nagu kromatiini immunoprecipitation (ChIP), mille jaoks väikesed fragmendi suurused on kõrge eraldusvõime saavutamiseks üliolulised. (vrd Tseng et al., 2012)
Plasmiidne DNA (pDNA) on DNA spetsiifiline vorm, mida iseloomustab selle rõnga kuju ja mida leidub bakterites ja mõnedes eukarüootides.
Ülekoormatud pDNA on plasmiidi DNA soovitud vorm, kuna see näitab parimaid tulemusi allavoolu protsessides, nagu automatiseeritud sekveneerimine ja transfektsioon. Ultraheli sobib pDNA, sealhulgas ülekoormatud pDNA edukaks killustamiseks.
(2008) näitasid, et plasmiidide ultrahelitöötlus, mis teadaolevalt killustab ülekoormatud DNA-d, on tõhus viis järjestuse phred20 lugemispikkuste parandamiseks niivõrd, et need ei erine oluliselt Beckman Coulteri kontrollmallist või ensümaatiliselt lineariseeritud plasmiididest.

Plasmiidvektorite kasutamine

Plasmiide kasutatakse sageli geenide kloonimise, ülekandmise ja manipuleerimise vahenditena. Kui plasmiide kasutatakse nendel eesmärkidel eksperimentaalselt, nimetatakse neid vektoriteks. DNA fragmente või geene saab sisestada plasmiidvektorisse, luues nn rekombinantse plasmiidi. Plasmiidvektoreid kasutatakse sõidukitena rekombinantse DNA juhtimiseks peremeesrakku ja need on molekulaarse kloonimise põhikomponent.
“Mitteviiruslikke vektoreid uuritakse põhjalikult nende võimaliku kasutamise kohta geeniteraapias erinevate keeruliste haiguste raviks. Mitteviiruslikud vektorid kaitsevad plasmiidi DNA-d füüsikalise, keemilise ja ensümaatilise lagunemise eest ning toimetavad DNA molekuli sihtkohta. Näiteks katioonsed liposoomid, kitosaan ja teised positiivselt laetud nanoosakesed moodustavad elektrostaatiliste interaktsioonide kaudu plasmiidi DNA-ga komplekse. Kuid kergesti moodustuvad katioonsed liposoomid / plasmiidsed DNA kompleksid on suhteliselt suured (st 300–400 nm) ja oma olemuselt heterogeensed, mistõttu on neid raske farmatseutilistes rakendustes kasutada. Suuri ja heterogeenseid plasmiidseid DNA/liposoome, plasmiidi DNA / aerosoole ja plasmiidide DNA / peptiidide komplekse saab ultraheli abil vähendada väiksemateks ja homogeenseteks osakesteks.” (Sarker et al., 2019)
Silmapaistev näide plasmiidvektorite kasutamisest on CRISPR–Cas9. CRISPR–Cas9 süsteem tarnitakse rakkudesse tavaliselt ühe suure plasmiidina või mitme väiksema plasmiidina, mis kodeerivad sihtjärjestust, CRISPR-i juhendit ja Cas9.

DNA-ga laetud PLGA nanoosakeste ultraheli ettevalmistamine nanoprecipitationi abil

(2020) kasutas polü(piim-ko-glükoolhapet) (PLGA), et moodustada nanoosakeste kandja mudeli CRISPR–Cas9 plasmiidi kohaletoimetamiseks primaarsesse luuüdist saadud makrofaagidesse. PLGA nanoosakeste nanopresadestamiseks kasutati PLGA-d kahe erineva otsarühmaga (ester ja amiinrühmad) eesmärgiga, et positiivselt laetud amiini otsakorgid suurendaksid kapseldamise efektiivsust ja koormust selle ja DNA negatiivselt laetud selgroo vahelise laengu interaktsioonide tõttu. 50 ml polüpropüleenist koonilises tsentrifuugiküvetis lahustati 100 mg Pluronic F127 20 ml autoklaavitud DI vees keerise segamise teel, millele järgnes 30 min õrn ultrahelitöötlus ultrahelivanniga (vaata CupHorn). Lisati autoklaavitud magnetsegaja ja lahust segati kiirusel 600 pööret minutis 30 minutit, samal ajal kui teised lahused valmistati. Kogu aeg kasutati klaasnõude asemel plastist laborinõusid, et minimeerida DNA mittespetsiifilist adsorptsiooni. Lahustati eraldi PLGA lahused dimetüülformamiidis (44,48 mg/ ml) ja THF-is lahustatud TIPS-pentatseeni lahused (0,667 mg/ml). PLGA jäeti DMF-is vaikselt märjaks 30 minutiks, enne kui seda 30 minutiks ultraheliga töödeldi (täieliku protokolli kohta vt Jo et al., 2020)

Plasmiidi DNA kaitse ultrahelitöötluse ajal

DNA, sealhulgas plasmiidid ja ülekoormatud plasmiidid, on väga tundlik lagunemine. Kõik kättesaadavad killustamismeetodid on tuntud teatavate puuduste poolest. Ultraheli DNA killustumine on üks eelistatud meetodeid, kuna kontrollitud ultrahelitöötlus koos kaitsemeetmetega võimaldab vähendada DNA ahelate nihke- ja soojusest põhjustatud kahjustusi.
Lisaks madala amplituudi seadetele, pulsatsioonirežiimile ja temperatuuri reguleerimisele ultraheli DNA lõikamise ajal näitas teatud ainete kasutamine märkimisväärset kaitsvat toimet DNA lagunemise vastu. Näiteks kaitsevad erinevad polümeerid, peptiidid ja lipiidid plasmiidi DNA-d ultraheliuuringu ajal.

Plasmiidi DNA ja plasmiidi DNA / IL nanokomplekside stabiilsust ultraheli nihkestressi vastu uuriti agaroosgeeli elektroforeesi testi abil. Nii plasmiidi DNA kui ka plasmiidi DNA / IL nanokompleksidele tehti ultraheli nihkestress erinevatel ajahetkedel. Plasmiidi DNA puutus kokku ultraheli nihkestressiga 0, 10, 20, 30 ja 40 minutit. Kuid plasmiidi DNA / IL nanokompleksid puutusid ultraheli nihkepingega kokku 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ja 120 minutit.
(uuring ja pilt: ©Sarker et al., 2019)

(2019) näitasid, et kui plasmiidi DNA / ioonse vedeliku (pDNA / IL) nanostruktuure allutati ultraheli nihkestressile 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ja 120 min ning kompleksis kaubanduslikult kättesaadava katioonse geeni manustamisainega lipofektamiin, oli fluorestseeruvate positiivsete rakkude protsent 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, Vastavalt 65% ja 50% (vt allolevat joonist). Fluorestseeruvate positiivsete rakkude protsent suurenes, kui nanostruktuuridele tehti ultraheli nihkestress 10 ja 20 minutit ning seejärel vähenes aeglaselt.

Ioonse vedeliku [Bmim][PF6] mõju plasmiidi DNA kohaletoimetamisele COS7 rakkudesse. Plasmiidi DNA / IL (ioonne vedelik) nanokompleksidele tehti ultraheli nihkepinge kuni 120 minutit ja kompleksiti LA-ga enne COS7 rakkudesse toimetamist. Andmed näitavad GFP positiivsete HeLa rakkude keskmist arvu (%) loendatuna 10 erinevas mikroskoopilises väljas ja katse viidi läbi mitu korda kolmel erineval päeval. (Uuring ja graafik: ©Sarker et al., 2019)

Ultraheli lüsaadi ettevalmistamine

Ultraheli rakkude lüüsi protokoll
Alustage rikastatud proovist rakkudest, mis valmistati ette rakkude eraldamise meetodil (nt immunomagnetiline rakkude eraldamine, fluorestsentsaktiveeritud rakkude sorteerimine, tihedusgradiendi tsentrifuugimine, immunodensity rakkude isoleerimine).
Rakuproovid peavad näitama lüüsipuhvri mahtu, mis sobib eksperimentaalse eesmärgi ja sondi tüüpi ultrasonikaatori jaoks.
Eelistatud on hüpotoonilised puhvrid, kuna need suurendavad ultraheli rakkude lüüsi. On oluline, et lisaaineid ja soolakontsentratsiooni kasutataks asjakohasel viisil.
Valige oma ultraheli lüüsiseade: Viaalide kaudseks ultrahelitöötluseks on soovitatav VialTweeter või CupHorn. Mitmekihiliste plaatide puhul on UIP400MTP ideaalne ultrasonikaator. Ja klassikaline sondi tüüpi ultrahelitöötlus, ultraheli homogenisaator, nagu UP100H või UP200Ht koos mikro-otsaga, on kõige sobivamad.
Sondi tüüpi ultrahelitöötluse protokoll: Asetage ultrasonikaatori sond proovi mahuni mikrotsentrifuugitorus ja sonikeerige umbes 10 sekundit. Sõltuvalt DNA proovist võib ultrahelitöötlust korrata veel üks või kaks korda. Nõutav ultraheli energiasisend (Ws / ml) sõltub proovi viskoossusest ja DNA tüübist. Jahutamine jäävanni ja ultrasonikaatori pulsatsioonirežiimi kaudu aitab vältida proovi termilist lagunemist.
Pärast ultraheli lüüsi tsentrifuugitakse proov pelletijäätmete eraldamiseks (mis sisaldab lüüsimata rakke, tuumasid ja lüüsimata organelle)
Kui proovi kohe edasi ei töödelda, võib seda eluvõimelisuse säilitamiseks säilitada sobival temperatuuril.

Ultrasonikaatorid DNA killustumiseks

Hielscher Ultrasonics pakub erinevaid ultrahelipõhiseid platvorme DNA, RNA ja kromatiini killustumiseks. Nende erinevate platvormide hulka kuuluvad ultraheli sondid (sonotroodid), kaudsed ultrahelitöötluse lahendused mitme toru või mitme kaevuga plaatide (nt 96-süvendi plaadid, mikrotiiterplaadid), sonoreaktorite ja ultraheli kuppelplaatide samaaegseks ettevalmistamiseks. Kõiki DNA lõikamise platvorme toidavad sagedusega häälestatud, suure jõudlusega ultraheli protsessorid, mis on täpselt kontrollitavad ja annavad reprodutseeritavaid tulemusi.

Ultraheli protsessorid mis tahes proovi numbri ja suuruse jaoks

Hielscheri mitme prooviga ultrasonikaatoritega VialTweeter (kuni 10 katseklaasi jaoks) ja UIP400MTP (mikroplaatide / mitmekihiliste plaatide jaoks) muutub kergesti võimalikuks vähendada proovi töötlemise aega intensiivse ja täpselt kontrollitava ultraheliuuringu tõttu, saades samal ajal soovitud DNA fragmendi, suuruse jaotuse ja saagise. Ultraheli DNA killustatus muudab plasmiidi ettevalmistamise sammud tõhusaks, usaldusväärseks ja skaleeritavaks. Protokolle saab lineaarselt skaleerida ühest kuni mitmele proovile, rakendades konstantseid ultraheli parameetreid.
Ühe kuni viie sõrmega sondi ultrasonikaatorid sobivad ideaalselt väiksemate proovinumbrite valmistamiseks. Hielscheri labori ultrasonikaatorid on saadaval erineva võimsustasemega, nii et saate valida oma DNA-ga seotud rakenduse jaoks ideaalse ultraheli katkestaja.