Plasmiidi ettevalmistus ultraheli töötlusega

Ultraheli töötlus on usaldusväärne meetod plasmiidse DNA fragmenteerimiseks. Täpselt reguleeritav amplituud, pulsatsioonirežiim ja temperatuuri kontroll on ultraheliseadme kõige olulisemad omadused plasmiidi kahjustamata fragmenteerimiseks. Lisaks aitab teatud ainete kasutamine kaitsta plasmiidi lagunemise eest. Hielscher Ultrasonics pakub mitmesuguseid lahendusi kontrollitud plasmiidi fragmenteerimiseks üksikutes viaalides, paljude proovide samaaegseks sonikeerimiseks ning mitmekoopaliste plaatide jaoks. Lugege lähemalt eduka ultraheliga plasmiidi fragmenteerimise kohta!

Plasmiidi nihkelõhkumine ultraheli töötlusega

Kui DNA proovid puutuvad kokku ultrahelilainetega, tekitavad ultraheli abil loodud vibratsioonid vedelikus akustilise kavitatsiooni, mis lõikab või katkestab suure molekulmassiga DNA molekule mehaaniliste jõudude toimel. Sonikeerimine on kõige laialdasemalt kasutatav meetod DNA hulgilõikamise katsetes, sealhulgas sellistes rakendustes nagu kromatiini immunosadestamine (ChIP), kus väikesed fragmendi suurused on kõrge eraldusvõime saavutamiseks absoluutselt hädavajalikud. (vrd Tseng et al., 2012)
Plasmiidne DNA (pDNA) on DNA spetsiifiline vorm, mida iseloomustab rõngakujuline struktuur ja mida leidub bakterites ning mõnedes eukarüootides.
Superspiraliseerunud pDNA on plasmiidse DNA soovitud vorm, sest see annab parimaid tulemusi järgnevates protsessides, nagu automatiseeritud sekveneerimine ja transfektsioon. Ultraheli töötlus sobib pDNA, sealhulgas superspiraliseerunud pDNA, edukaks fragmenteerimiseks.
Thompson et al. (2008) näitasid, et plasmiidi sonikeerimine, mille puhul on teada, et see fragmenteerib superspiraliseerunud DNA-d, on tõhus viis sekveneerimise phred20 lugemispikkuste parandamiseks nii, et need ei erine oluliselt Beckman Coulteri kontrollmatriitsist ega ensümaatiliselt lineariseeritud plasmiididest.

Plasmiidvektorite kasutamine

Plasmiide kasutatakse sageli vahendina geenide kloonimiseks, ülekandmiseks ja manipuleerimiseks. Kui plasmiide kasutatakse katsetes nendel eesmärkidel, nimetatakse neid vektoriteks. DNA fragmente või geene saab sisestada plasmiidvektorisse, luues nn rekombinantse plasmiidi. Plasmiidvektoreid kasutatakse kandjatena rekombinantse DNA viimiseks peremeesrakku ja need on molekulaarse kloonimise võtmekomponent.
„Mitteviirusvektoreid uuritakse laialdaselt nende võimaliku kasutamise tõttu geeniteraapias mitmesuguste keerukate haiguste raviks. Mitteviirusvektorid kaitsevad plasmiidset DNA-d füüsikalise, keemilise ja ensümaatilise lagunemise eest ning toimetavad DNA molekuli sihtkohta. Näiteks katioonsed liposoomid, kitosaan ja muud positiivselt laetud nanoosakesed moodustavad plasmiidse DNA-ga komplekse elektrostaatiliste vastastikmõjude kaudu. Kergesti tekkivad katioonsete liposoomide/plasmiidse DNA kompleksid on aga suhteliselt suured (st 300–400 nm) ja olemuselt heterogeensed, mistõttu on neid raske farmaatsiarakendustes kasutada. Suuri ja heterogeenseid plasmiidse DNA/liposoomide, plasmiidse DNA/aerosoolide ja plasmiidse DNA/peptiidide komplekse saab ultraheli töötluse abil vähendada väiksemateks ja homogeenseteks osakesteks.” (Sarker et al., 2019)
Silmapaistev näide plasmiidvektorite kasutamisest on CRISPR–Cas9. CRISPR–Cas9 süsteem viiakse rakkudesse tavaliselt ühe suure plasmiidi või mitme väiksema plasmiidina, mis kodeerivad sihtjärjestust, CRISPR-juhti ja Cas9.

DNA-ga laetud PLGA nanoosakeste ultraheliga ettevalmistus nanosadestamise teel

Jo jt (2020) kasutasid polü(piim-ko-glükoolhapet) (PLGA), et moodustada nanoosakeste kandja mudel-CRISPR–Cas9 plasmiidi viimiseks primaarsetesse luuüdist pärinevatesse makrofaagidesse. PLGA nanoosakeste nanosadestamiseks kasutati PLGA-d kahe erineva otsarühmaga (estri- ja amiinrühmad) eesmärgiga, et positiivselt laetud amiinotsakud suurendaksid kapseldumise efektiivsust ja laadimist tänu laengute vastastikmõjule nende ja DNA negatiivselt laetud selgroo vahel. 50 mL polüpropüleenist koonilises tsentrifuugitorus lahustati 100 mg Pluronic F127 20 mL-s autoklaavitud DI vees keerissegamise teel, millele järgnes 30 min õrn ultraheli töötlus ultrahelivannis (vt CupHorn). Lisati autoklaavitud magnetsegamisvarras ja lahust segati kiirusel 600 RPM 30 min, kuni valmistati teisi lahuseid. DNA mittespetsiifilise adsorptsiooni minimeerimiseks kasutati kogu töö vältel klaasnõude asemel plastikust laborinõusid. Eraldi valmistati DMF-is lahustatud PLGA lahused (44,48 mg/ ml) ja THF-is lahustatud TIPS-pentatseeni lahused (0,667 mg/ml). PLGA-d jäeti DMF-is 30 min vaikselt märguma, enne kui seda 30 min sonikeeriti. (täielik protokoll: vt Jo jt, 2020)

Plasmiidse DNA kaitse sonikeerimise ajal

DNA, sealhulgas plasmiidid ja superspiraliseerunud plasmiidid, on lagunemise suhtes väga tundlik. Kõikidel olemasolevatel fragmenteerimismeetoditel on teatud puudused. Ultraheli DNA fragmenteerimine on üks eelistatud meetodeid, kuna kontrollitud sonikeerimine koos kaitsemeetmetega võimaldab vähendada nihke- ja kuumusest tingitud DNA ahelate kahjustamist.
Lisaks madalatele amplituudi seadistustele, pulseerivale režiimile ja temperatuuri kontrollile ultraheli DNA nihkamise ajal näitas teatud ainete kasutamine olulist kaitsvat toimet DNA lagunemise vastu. Näiteks kaitsevad plasmiidset DNA-d ultraheli töötluse ajal mitmesugused polümeerid, peptiidid ja lipiidid.

Plasmiidse DNA ning plasmiidse DNA/IL nanokomplekside stabiilsust ultraheli nihkepinge suhtes uuriti agaroosgeel-elektroforeesi analüüsiga. Nii plasmiidne DNA kui ka plasmiidse DNA/IL nanokompleksid allutati ultraheli nihkepingele erinevatel ajapunktidel. Plasmiidset DNA-d mõjutati ultraheli nihkepingega 0, 10, 20, 30 ja 40 minutit. Plasmiidse DNA/IL nanokomplekse aga mõjutati ultraheli nihkepingega 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ja 120 minutit.
(uuring ja pilt: ©Sarker jt, 2019)

Sarker jt (2019) näitasid, et kui plasmiidse DNA / ioonse vedeliku (pDNA/IL) nanostruktuurid allutati ultraheli nihkepingele 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ja 120 min ning kompleksiti kaubanduslikult saadava katioonse geenide viimise vahendiga lipofektamiin, oli fluorestseeruvalt positiivsete rakkude osakaal vastavalt 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% ja 50% (vt allolevat diagrammi). Fluorestseeruvalt positiivsete rakkude osakaal suurenes, kui nanostruktuurid allutati ultraheli nihkepingele 10 ja 20 min, ning seejärel vähenes aeglaselt.

Ioonse vedeliku mõju [Bmim][PF6] plasmiidse DNA viimisele COS7 rakkudesse. Plasmiidse DNA/IL (ioonne vedelik) nanokompleksid allutati ultraheli nihkepingele kuni 120 minutit ja kompleksiti LA-ga enne COS7 rakkudesse viimist. Andmed näitavad GFP-positiivsete HeLa rakkude keskmist arvu (%), mis loendati 10 erinevas mikroskoobi vaateväljas, ning katset tehti mitu korda kolmel erineval päeval. (Uuring ja diagramm: ©Sarker jt, 2019)

Lüsaadi ettevalmistamine ultraheli abil

Rakkude lüüsi protokoll ultraheliga
Alustage rikastatud rakuproovist, mis on valmistatud rakkude eraldamise meetodiga (nt immunomagnetiline rakkude eraldamine, fluorestsentsaktiveeritud rakkude sortimine (FACS), tihedusgradient-tsentrifuugimine, immunotihedusel põhinev rakkude isoleerimine).
Rakuproovides peab olema katseeesmärgile ja sondtüüpi ultraheliseadmele sobiv kogus lüüsipuhvrit.
Hüpotoonilised puhvrid on eelistatud, kuna need tugevdavad rakkude ultraheli lüüsi. On oluline, et lisandeid ja soolakontsentratsiooni kasutataks sobival viisil.
Valige oma ultraheli lüüsiseade: viaalide kaudseks sonikeerimiseks on soovitatavad VialTweeter või CupHorn. Mitme süvendiga plaatide jaoks on ideaalne ultraheliseade UIP400MTP. Klassikaliseks sondtüüpi sonikeerimiseks sobib kõige paremini ultraheli homogenisaator, nagu UP100H või UP200Ht koos mikrotipiga.
Sondtüüpi sonikeerimise protokoll: Asetage ultraheliseadme sond mikrotsentrifuugitoru proovimahtu ja sonikeerige ligikaudu 10 sekundit. Olenevalt DNA proovist võib sonikeerimist korrata veel ühe või kaks korda. Vajalik ultraheli energiasisend (Ws/mL) sõltub proovi viskoossusest ja DNA tüübist. Jahutus jääveevannis ja ultraheliseadme pulsatsioonirežiim aitavad vältida proovi termilist lagunemist.
Pärast ultraheli lüüsi tsentrifuugitakse proov, et eraldada sette praht (mis sisaldab lüüsimata rakke, tuumi ja lüüsimata organelle).
Kui proovi ei töödelda kohe edasi, võib seda säilitada sobival temperatuuril, et säilitada selle elujõulisust.

Ultraheliseadmed DNA fragmenteerimiseks

Hielscher Ultrasonics pakub mitmesuguseid ultrahelil põhinevaid platvorme DNA, RNA ja kromatiini fragmenteerimiseks. Need erinevad platvormid hõlmavad ultraheli sonde (sonotroode), kaudse sonikeerimise lahendusi mitme tuubi või mitme süvendiga plaadi (nt 96-süvendiga plaadid, mikrotiiterplaadid) samaaegseks proovide ettevalmistamiseks, sonoreaktoreid ja ultraheli cuphorne. Kõiki DNA nihkele (shearing) mõeldud platvorme käitavad sagedusele häälestatud suure jõudlusega ultraheliprotsessorid, mis on täpselt juhitavad ja annavad reprodutseeritavaid tulemusi.

Ultraheliprotsessorid mis tahes proovide arvule ja mahule

Hielscheri mitme proovi ultraheliseadmetega VialTweeter (kuni 10 katseklaasile) ja UIP400MTP (mikroplaatidele/mitme süvendiga plaatidele) on lihtne lühendada proovide töötlemise aega tänu intensiivsele ja täpselt juhitavale ultraheli töötlusele, saavutades samal ajal soovitud DNA fragmentide suurusjaotuse ja saagise. Ultraheli abil DNA fragmenteerimine muudab plasmiidi ettevalmistamise etapid tõhusaks, usaldusväärseks ja skaleeritavaks. Protokolle saab lineaarselt skaleerida ühelt proovilt paljudele proovidele, rakendades püsivaid ultrahelparameetreid.
Ühe kuni viie sõrmega sondultraheliseadmed sobivad ideaalselt väiksema arvu proovide ettevalmistamiseks. Hielscheri laboriultraheliseadmed on saadaval erineva võimsusega, nii et saate valida oma DNA-ga seotud rakenduse jaoks ideaalse ultraheli desintegraatori.