Inimese piima oligosahhariidide biosünteetiline tootmine

Inimese piima oligosahhariidide (HMO) biosüntees kääritamise või ensümaatiliste reaktsioonide teel on keeruline, ressursimahukas ja sageli väikese saagisega protsess. Ultraheli töötlus suurendab massiülekannet substraadi ja rakutehaste vahel ning stimuleerib rakkude kasvu ja ainevahetust. Seeläbi intensiivistab sonikeerimine kääritamis- ja biokeemilisi protsesse, mille tulemusena HMO-de tootmine on kiirem ja tõhusam.

Inimese piima oligosahhariidid

Inimese piima oligosahhariidid (HMO), tuntud ka kui inimese piima glükaanid, on suhkrumolekulid, mis kuuluvad oligosahhariidide rühma. HMO-de tuntud näited on 2’-fukosüülaktoos (2′-FL), laktoos-N-neotetraoos (LNnT), 3’-galaktosüülaktoos (3′-GL) ja difukosüülaktoos (DFL).
Kuigi inimese rinnapiim koosneb enam kui 150 erinevast HMO struktuurist, toodetakse praegu kommertsmahus ainult 2′-fukosüülaktoosi (2′-FL) ja laktoos-N-neotetraoosi (LNnT) ning neid kasutatakse toitelisandina piimasegudes imikutele.
Inimese piima oligosahhariidid (HMO) on tuntud oma tähtsuse poolest imikutoitumises. Inimese piima oligosahhariidid on ainulaadset tüüpi toitained, mis toimivad imiku soolestikus prebiootikumide, adhesioonivastaste antimikroobsete ainete ja immunomodulaatoritena ning aitavad oluliselt kaasa aju arengule. HMO-sid leidub eranditult inimese rinnapiimas; teised imetajate piimad (nt lehma-, kitse-, lamba-, kaameli- jne piim) ei sisalda seda spetsiifilist oligosahhariidide vormi.
Inimese piima oligosahhariidid on inimese piima kolmas kõige rohkem esinev tahke komponent, mis võib vees esineda kas lahustunud, emulgeeritud või suspendeeritud kujul. Laktoos ja rasvhapped on inimese piimas kõige rohkem esinevad tahked ained. HMO-sid esineb kontsentratsioonis 0,35–0,88 untsi (9,9–24,9 g)/ L. Teada on ligikaudu 200 struktuurilt erinevat inimese piima oligosahhariidi. Domineeriv oligosahhariid 80%-l kõigist naistest on 2′-fukosüülaktoos, mida esineb inimese rinnapiimas kontsentratsioonis ligikaudu 2,5 g/ L.
Kuna HMO-sid ei seedita, ei anna need toitumisse kalorilist panust. Seedimatute süsivesikutena toimivad need prebiootikumidena ning neid kääritab selektiivselt soodne soolestiku mikrofloora, eriti bifidobakterid.

Inimese piima oligosahhariidide biosüntees

Rakutehased ning ensümaatilised / kemoensümaatilised süsteemid on praegu kasutatavad tehnoloogiad HMO-de sünteesiks. HMO-de tööstuslikus mastaabis tootmiseks on mikroobsete rakutehaste kääritamine, biokeemiline süntees ja erinevad ensümaatilised reaktsioonid teostatavad HMO-de biotootmise viisid. Majanduslikel põhjustel on biosüntees mikroobsete rakutehaste abil praegu ainus tehnika, mida HMO-de tööstuslikul tootmistasandil kasutatakse.

HMO-de kääritamine mikroobsete rakutehaste abil

E.coli, Saccharomyces cerevisiae ja Lactococcus lactis on levinud rakutehased, mida kasutatakse bioloogiliste molekulide, näiteks HMO-de biotootmiseks. Kääritamine on biokeemiline protsess, kus mikroorganismide abil muudetakse substraat soovitud bioloogilisteks molekulideks. Mikroobsed rakutehased kasutavad substraadina lihtsaid suhkruid, mille nad muudavad HMO-deks. Kuna lihtsad suhkrud (nt laktoos) on külluslik ja odav substraat, püsib biosünteesiprotsess kuluefektiivne.
Kasvu- ja biokonversioonikiirust mõjutab peamiselt toitainete (substraadi) massiülekanne mikroorganismidele. Massiülekande kiirus on peamine tegur, mis mõjutab produkti sünteesi kääritamise ajal. Ultraheli töötlus (sonikeerimine) edendab tuntult massiülekannet.
Kääritamise ajal tuleb bioreaktoris valitsevaid tingimusi pidevalt jälgida ja reguleerida, et rakud saaksid kasvada võimalikult kiiresti ning toota seejärel soovitud biomolekule (nt oligosahhariidid, näiteks HMO-d; insuliin; rekombinantsed valgud). Teoreetiliselt algab produkti teke niipea, kui rakukultuur hakkab kasvama. Eriti geneetiliselt muundatud rakkudes, näiteks inseneeritud mikroorganismides, indutseeritakse see siiski tavaliselt hiljem, lisades substraadile kemikaali, mis suurendab soovitud biomolekuli ekspressiooni. Ultraheli bioreaktoreid (sonobioreaktor) saab täpselt juhtida ja need võimaldavad mikroobe sihipäraselt stimuleerida. Selle tulemuseks on kiirem biosüntees ja suuremad saagised.
Ultraheli lüüs ja ekstraheerimine: Keerukate HMO-de kääritamist võivad piirata madalad kääritustiitrid ning rakusisesena püsivad produktid. Ultraheli lüüsi ja ekstraheerimist kasutatakse rakusisese materjali vabastamiseks enne puhastamist ja järgnevaid protsesse.

Ultraheli abil edendatud kääritamine

Mikroobide, näiteks Escherichia coli, inseneeritud E.coli, Saccharomyces cerevisiae ja Lactococcus lactis kasvukiirust saab kiirendada, suurendades massiülekande kiirust ja rakuseina läbilaskvust kontrollitud madala sagedusega ultraheli töötluse (sonikeerimise) abil. Õrna, mittetermilise töötlusmeetodina kannab ultraheli töötlus kääritussöötmesse üksnes mehaanilisi jõude.
Akustiline kavitatsioon: Ultraheli töötluse (sonikeerimise) tööpõhimõte põhineb akustilisel kavitatsioonil. Ultraheli sond (sonotrood) suunab madala sagedusega ultraheli lained söötmesse. Ultraheli lained levivad läbi vedeliku ja tekitavad vahelduvaid kõrgrõhu (kokkusurumine) / madalrõhu (hõrenemine) tsükleid. Vedelikku vahelduvates tsüklites kokku surudes ja venitades tekivad pisikesed vaakumimullid. Need väikesed vaakumimullid kasvavad mitme tsükli jooksul, kuni jõuavad suuruseni, mille juures nad ei suuda enam energiat neelata. Maksimaalse kasvu hetkel vaakumimull implodeerub vägivaldselt ja tekitab lokaalselt äärmuslikud tingimused, mida tuntakse kavitatsiooni nähtusena. Kavitatsioonilises „kuumpunktis“ võib täheldada suuri rõhu- ja temperatuurierinevusi ning tugevaid nihkejõude vedeliku joadega kiirusel kuni 280m/sek. Nende kavitatsiooniefektide abil saavutatakse põhjalik massiülekanne ja sonoporatsioon (rakuseinte ja rakumembraanide perforeerimine). Substraadi toitained kantakse elusate tervete rakkudeni ja nende sisse, nii et rakutehased saavad optimaalselt toitu ning kasvu- ja konversioonikiirus kiireneb. Ultraheli bioreaktorid on lihtne, kuid väga tõhus strateegia biomassi töötlemiseks ühe anuma biosünteesiprotsessis.
Täpselt kontrollitud õrn ultraheli töötlus (sonikeerimine) on tuntud kääritusprotsesside intensiivistamise poolest.
Ultraheli töötlus (sonikeerimine) parandab „paljude elusrakke hõlmavate bioprotsesside produktiivsust substraadi omastamise suurendamise, rakkude poorsuse suurendamise kaudu kiirendatud tootmise või kasvu ning potentsiaalselt ka rakukomponentide suurema vabanemise kaudu.“ (Naveena et al. 2015)
Loe lähemalt ultraheli abil toetatud kääritamise kohta!

Naveena et al. (2015) leidsid, et ultraheli abil intensiivistamine pakub biotöötluse ajal mitmeid eeliseid, sealhulgas madalad tegevuskulud võrreldes teiste täiustavate töötlusvõimalustega, kasutuslihtsus ja tagasihoidlikud võimsusnõuded.

Suure jõudlusega ultraheli fermentatsioonireaktorid

Fermentatsiooniprotsessid hõlmavad elusaid mikroorganisme, näiteks baktereid või pärmseeni, mis toimivad rakutehastena. Kuigi ultraheli töötlust (sonikeerimist) rakendatakse massiülekande soodustamiseks ning mikroorganismide kasvu- ja konversioonikiiruse suurendamiseks, on ülioluline juhtida ultraheli intensiivsust täpselt, et vältida rakutehaste hävimist.
Hielscher Ultrasonics on spetsialiseerunud suure jõudlusega sonikaatorite projekteerimisele, tootmisele ja turustamisele; neid saab täpselt juhtida ja jälgida, et tagada suurepärane fermentatsioonisaagis.

Protsessi juhtimine on oluline mitte ainult suure saagise ja ülima kvaliteedi jaoks, vaid võimaldab tulemusi ka korrata ja reprodutseerida. Eriti rakutehaste stimuleerimisel on suure saagise saavutamiseks ja rakkude lagunemise vältimiseks hädavajalik ultraheli töötluse (sonikeerimise) parameetrite rakuspetsiifiline kohandamine. Seetõttu on kõik Hielscheri sonikaatorite digitaalsed mudelid varustatud intelligentse tarkvaraga, mis võimaldab teil ultraheli töötluse parameetreid kohandada, jälgida ja üle vaadata. Ultraheli protsessiparameetrid, nagu amplituud, temperatuur, rõhk, ultraheli töötluse kestus, töötsüklid ja energiasisend, on HMO tootmise soodustamiseks fermentatsiooni teel olulised.
Hielscheri sonikaatorite nutikas tarkvara salvestab automaatselt kõik olulised protsessiparameetrid integreeritud SD-kaardile. Ultraheli töötluse automaatne andmete salvestamine on aluseks protsessi standardiseerimisele ning reprodutseeritavusele / korratavusele, mida nõuavad head tootmistavad (GMP).

Ultraheli rektorid fermentatsiooniks

Hielscher pakub erineva suuruse, pikkuse ja geomeetriaga ultraheli sonde, mida saab kasutada nii perioodiliseks kui ka pidevaks läbivoolutöötluseks. Ultraheli reaktorid, tuntud ka kui sono-bioreaktorid, on saadaval mis tahes mahule, hõlmates ultraheli biotöötlust väikestest laborinäidistest kuni pilootmastaabi ja täielikult kommertstootmise tasemeni.
On hästi teada, et ultraheli sonotroodi asukoht reaktsioonianumas mõjutab kavitatsiooni ja mikrovoolu jaotust keskkonnas. Sonotrood ja ultraheli reaktor tuleks valida vastavalt rakusöötme töödeldavale mahule. Kuigi ultraheli töötlust (sonikeerimist) saab teostada nii perioodiliselt kui ka pidevrežiimis, soovitatakse suurte tootmismahtude puhul kasutada pideva läbivooluga paigaldust. Ultraheli läbivoolukambrit läbides saab kogu rakusöötme täpselt sama ultraheli töötluse mõju, mis tagab kõige tõhusama töötluse. Hielscher Ultrasonicsi lai ultraheli sondide ja läbivoolukambri reaktorite valik võimaldab koostada ideaalse ultraheli biotöötluse seadistuse.

Hielscher Ultrasonics – laborist piloottootmise kaudu tootmiseni

Hielscher Ultrasonics katab ultraheliseadmete kogu spektri, pakkudes kompaktseid käeshoitavaid ultraheli homogenisaatoreid proovide ettevalmistamiseks, laboriseadmeid ja pilootsüsteeme ning võimsaid tööstuslikke ultraheliseadmeid, mis töötlevad hõlpsasti veokitäisi tunnis. Tänu paindlikele ja mitmekülgsetele paigaldus- ja kinnitusvõimalustele saab Hielscheri sonikaatoreid hõlpsasti integreerida igat liiki perioodilistesse reaktoritesse, saadetud-perioodilistesse (fed-batch) või pidevatesse läbivoolusüsteemidesse.
Erinevad lisatarvikud ja eritellimusel valmistatud osad võimaldavad kohandada teie ultraheli seadistuse ideaalselt teie protsessi nõuetele.
Hielscheri ultraheliprotsessorid on ehitatud 24/7 tööks täiskoormusel ja rasketes tingimustes ning on töökindlad ja vajavad vaid vähest hooldust.
Alljärgnev tabel annab ülevaate meie sonikaatorite ligikaudsest töötlemisvõimsusest: