Tahkefaasiline peptiidide süntees – tõhusam ultraheli töötlusega (sonikeerimisega)
Tahkefaasiline peptiidisüntees (SPPS) on peptiidide sünteesi levinud meetod. Ultraheli töötlus (sonikeerimine) on usaldusväärne vahend tahkefaasilise peptiidisünteesi intensiivistamiseks, mis annab suurema saagise, parema puhtuse, ei põhjusta ratsemiseerumist ning kiirendab oluliselt reaktsiooni kiirust. Hielscher Ultrasonics pakub mitmesuguseid ultraheli lahendusi peptiidide sünteesiks, lõhustamiseks ja lahustamiseks.
Ultraheli abil toimuv tahkefaasiline peptiidisüntees
Ultraheli töötlust kasutatakse orgaanilises sünteesis juba laialdaselt intensiivistava meetodina ning see on tuntud oma eeliste poolest, nagu drastiliselt lühenenud reaktsiooniajad, suurem saagis, vähem kõrvalsaadusi, selliste reaktsiooniteede käivitamine, mida ei oleks muul viisil võimalik saavutada, ja/või parem selektiivsus. Suurt kasu võib saada ka siis, kui sonikeerimine ühendatakse peptiidide sünteesireaktsioonidega. Uurimistulemused on näidanud, et ultraheli abil toimuv peptiidisüntees annab lühikese reaktsiooniaja jooksul peptiidide optimeeritud saagise suure puhtusega ja ilma ratsemiseerumiseta.
- Suur peptiidide saagis
- Oluliselt kiirem süntees
- Peptiidide suurem puhtus
- Ratsemiseerumist ei toimu
- Mitme erineva peptiidi paralleelne süntees
- Skaleeritav mis tahes mahule
Ultraheli kuppsonotrood mitme reaktsiooninõu ühtlaseks sonikeerimiseks parema peptiidisünteesi jaoks.
Joonis, mis kujutab Merrifieldi tahkefaasilist peptiidisünteesi. Ultraheli töötlust kasutatakse sünteesireaktsiooni soodustamiseks ja tõhustamiseks ning sünteesitud peptiidide lõhustamiseks vaigult.
Joonis: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Uuring | Uuritud peptiid(id) | Reaktsiooniaeg (klassikaline vs US-SPPS) | Toortoote puhtus (klassikaline vs US-SPPS) | Ratsemiseerumine ja körvalreaktsioonid | Peamised järeldused |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-enkefaliin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorfiin | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Cys/His puhul ei täheldatud, isegi 70°C juures | ~7–12x kiirem süntees; olulised puhtuse paranemised, eriti agregeeruda kalduvate järjestuste, näiteks TAT, puhul. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12-meer), Pep2 (9-meer), Pep3 (25-meer) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (ainult US) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Ei testitud; Pep2 puhul märgiti puhtuse kerget langust | 14x ajalühenemine Pep1 puhul; toorsaagis suurenes oluliselt. |
| Merlino et al. (2019) | Mudelpentapeptiidid, kuni 44-meersed peptiidid, „rasked järjestused“ (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (mudel) | 84% → 93% (mudel); oluliselt kõrgem kui termilise kuumutamise korral (~45°C) | Cys/His enantiomeeride olulist suurenemist ei esinenud | Väga tõhus raskete/agregeeruda kalduvate järjestuste puhul; võimaldab vähendada reagendi üleliia ning säilitada samal ajal suure puhtuse. |
Ultraheliga täiustatud tahkefaasiline peptiidisüntees
Tahkefaasiline peptiidisüntees (SPPS) on keemiline reaktsioon, mis võimaldab peptiidahela kokkupanekut aminohappe derivaatide järjestikuste reaktsioonide kaudu lahustumatul poorsel kandjal. Traditsiooniline tahkefaasiline peptiidisüntees on siiski suhteliselt ebaefektiivne ja aeglane protsess. Seetõttu peetakse peptiidide sünteesi ultraheli intensiivistamist kõrgelt hinnatud vahendiks peptiidide tõhusamaks ja kiiremaks sünteesiks.
Silva et al. (2021) võrdlesid „klassikalist“ fluorenüülmetoksükarbonüül (Fmoc) tahkefaasilist peptiidsünteesi (SPPS) ultraheli (US) abil toetatud SPPS-iga, lähtudes kolme peptiidi valmistamisest, nimelt fibroblastide kasvufaktori retseptor 3 (FGFR3) suhtes spetsiifilisest peptiidist Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) ning uudsetest peptiididest Pep2 (RQMATADEA-NH2) ja Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
US-abiga SPPS lühendas peptiidi kokkupanemise aega „klassikalise“ meetodiga võrreldes 14-kordselt (Pep1) ja 4-kordselt (Pep2). Huvitaval kombel andis ultraheli abil toetatud SPPS Pep1 kõrgema puhtusega (82%) kui „klassikaline“ SPPS (73%). Oluline ajasääst koos saavutatud toorpeptiidi kõrge puhtusega ajendas uurimisrühma rakendama US-abiga SPPS-i suure peptiidi Pep3 puhul, mis sisaldab suurt hulka hüdrofoobseid aminohappeid ja homooligomeerseid järjestusi. Märkimisväärselt saavutati selle 25-liikmelise peptiidi süntees alla 6 tunniga (347 min) mõõduka puhtusega (ca 49%).
Kiirem peptiidisüntees tahkefaasilise peptiidsünteesi teel ultraheliagitatsiooni abil.
(Uuring ja analüüs: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) viisid samuti läbi põhjaliku uuringu ultraheli mõjust Fmoc-põhisele tahkefaasilisele peptiidsünteesile, mis võimaldas sünteesida erinevaid bioloogiliselt aktiivseid peptiide (kuni 44-liikmelised), saavutades märkimisväärse materjali- ja reaktsiooniaja säästu. Nad näitasid, et ultraheli töötlus ei süvendanud peamisi kõrvalreaktsioone ning parandas „raskete järjestustega“ peptiidide sünteesi, tõstes ultrahelitoetatud tahkefaasilise peptiidsünteesi (US-SPPS) praeguste kõrge efektiivsusega peptiidide sünteesistrateegiate hulka.
Kõrge jõudlusega süsteemide olemasolu peptiidide ultraheli (sonikaatoriga) sünteesiks võimaldab oluliselt parandada sünteesikiirust ja tõsta toorproduktide puhtust. (vt Wołczański et al., 2019)
Rasemiseerumise uurimine. Oluliste 1H NMR spektrite võrdlus mudelpeptiididest, mis sünteesiti käsitsi klassikalise meetodiga toatemperatuuril vs ultraheli meetodiga kõrgendatud temperatuuril. His ja Cys α-prootonite ning Acm metüleenrühma keemilised nihked (vasakpoolsed paneelid) ning Val ɣ-metüülprootonite keemilised nihked (parempoolsed paneelid) näitavad, et ultraheli töötlus temperatuuril 70°C ei põhjusta rasemiseerumist.
(Uuring ja analüüs: Wołczański et al., 2019)
Peptiidide ultraheli abil lõhustamine
Pärast tahkefaasilist peptiidsünteesi (SPPS) tuleb sünteesitud peptiidid polümeersetelt vaikudelt lõhustada. Seda etappi tuntakse ka kaitsegruppide eemaldamisena. Kui võrrelda peptiidide vaigult lõhustamisel tavapärast loksutamist ja ultraheli töötlust, nõuab loksutamine ca 1 tundi, samas kui ultraheli abil lõhustamise saab teha 15–20 minutiga. Peptiidide ultraheli abil lõhustamist saab rakendada kaitstud aminohapete ja polüstüreenvaikudega bensüülestersidemete kaudu seotud peptiidide lõhustamiseks.
Peptiidide ultraheli abil lõhustamine polüstüreenvaigult annab kiire protseduuriga peptiidide kõrge saagise ja kõrge puhtuse ilma rasemiseerumiseta.
(uuring ja graafika: ©Anuradha ja Ravindranath, 1995)
Ultraheliga agiteeritud reaktor parema ja kiirendatud peptiidsünteesi jaoks. Pildil on ultrahelisonikaator UP200St segatavas klaasreaktoris.
Suure jõudlusega ultrahelisonikaatorid peptiidsünteesiks
Hielscher Ultrasonics pakub mitmesuguseid ultraheli lahendusi otseseks ja kaudseks ultraheli töötluseks (sonikeerimiseks). Võimsad ja täpselt reguleeritavad ultraheliprotsessorid annavad reaktsiooninõusse täpselt õige koguse ultraheli energiat. Olenemata sellest, kas kasutate sünteesinõuna süstlaid, katsuteid, mitme süvendiga plaate või klaasreaktoreid, pakub Hielscher Ultrasonics teie peptiidirakenduse jaoks sobivaimat ultrahelitöötlusseadet (sonikaatorit).
- kohandatud peptiidid
- suuremahuline peptiidide tootmine
- peptiidikogumikud
Paljud peptiidsünteesid tehakse süstaldes (nt fritiga süstalreaktorites). Hielscheri ultraheli süstlasegisti töötleb peptiidilahust ultrahelitöötlusega, juhtides ultraheli lained läbi süstla seina vedelikku. Ultraheli süstlasegisti on üks populaarsemaid ultraheli lahendusi peptiidide ultraheliga toetatud sünteesiks.
Ultraheli cuphorn on sobiv vahend kuni 5 reaktsiooninõu ultraheli töötluseks, samas kui VialTweeter mahutab kuni kümme reaktsioonitoru ning lisaks viis suuremat nõu külgekinnitatava lisatarviku abil.
Muude reaktoritüüpide, näiteks Merrifieldi või Kamysze tahkefaasireaktori ning muude polüpropüleenist või borosilikaatklaasist nõude ja reaktorite jaoks pakub Hielscher sonikaatoreid kaudseks ja otseseks ultraheli töötluseks kohandatud külgekinnitatava kinnituse või äärikuga.
Muidugi saab suuremaid segamisega klaasreaktoreid, nt lahusefaassünteesi jaoks, hõlpsasti varustada mis tahes suurusega ultraheli sondidega (ehk sonotroodide või ultraheli hornidega).
- mitmesugused sonikaatorite tüübid
- otsene ja kaudne ultraheli töötlus
- täpne intensiivsuse reguleerimine
- täpne temperatuuri reguleerimine
- pidev või pulseeriv ultraheli
- nutikad funktsioonid, programmeeritavad seadmed
- saadaval mis tahes mahu jaoks
- lineaarne skaleeritavus
Tahkefaasilise peptiidsünteesi jaoks mitme süvendiga ehk mikrotiiterplaatidel on UIP400MTP ideaalne seade. Ultraheli kavitatsioon juhitakse kaudselt ja ühtlaselt arvukatesse proovisüvenditesse, mis tagab parema massiülekande ja sünteesireaktsiooni. Vaadake allolevat videot, et näha, kuidas mikroplaadi sonikaator UIP400MTP töötab!
Võtke meiega ühendust! / Küsige meilt!
Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid segamiseks, dispergeerimiseks, emulgeerimiseks ja ekstraheerimiseks labori-, pilootmastaabis ja tööstuslikus mastaabis.
Teadmist väärt fakte ultraheli peptiidsünteesi kohta
Mis on peptiidid?
Peptiidid on ühendid, milles mitu aminohapet on omavahel seotud amiidsidemetega, nn peptiidsidemetega. Kui need on seotud keerukateks struktuurideks – tavaliselt koosnevad need 50 või enamast aminohappest –, nimetatakse neid suuri peptiidstruktuure valkudeks. Peptiidid on elu oluline ehituskivi ja täidavad organismis arvukaid funktsioone.
Kuidas peptiidsüntees toimib?
Orgaanilises keemias, molekulaarbioloogias ja bioteadustes on peptiidsüntees peptiidide tootmise protsess. Peptiide sünteesitakse keemiliselt, kondenseerides ühe aminohappe karboksüülrühma teise aminohappe aminorühmaga. Soovimatute körvalreaktsioonide vältimiseks erinevate aminohappe körvalahelatega kasutatakse tavaliselt kaitserühmade (ka kaitsvate rühmade) strateegiaid.
Keemiline (in vitro) peptiidsüntees algab kõige sagedamini nii, et sisenevä aminohappe karboksüülrühm (C-terminus) seotakse kasvava peptiidahela N-terminusega. Erinevalt sellest C-N-suunalisest sünteesist toimub pikkade peptiidide looduslik valkude biosüntees elusorganismides vastupidises suunas. See tähendab, et biosünteesis seotakse sisenevä aminohappe N-terminus valguahela C-terminusega (N-C).
Paljud peptiidsünteesi uuringu- ja arendusprotokollid põhinevad tahkefaasimeetoditel, samas kui lahusefaassünteesi meetodeid leidub peptiidide suuremahulises tööstuslikus tootmises.
Millised on peptiidsünteesi tänapäevase tehnika taseme suundumused?
SUS-SPPS (jätkusuutlik ultraheliga toetatud SPPS) on näidanud, et see vähendab protsessi vaid kahele etapile tsükli kohta (kombineeritud kuplamine/kapistamine/kaitserühmade eemaldamine + üks pesu), vähendades oluliselt lahusti tarbimist ja aega. (vrd Mottola et al., 2025)
Ultraheliga toetatud TAPS on esilekerkiv kombinatsioon, millel on tõestatud edu täissünteesides (nt lipobaktiin) ning mida CDMO-d uurivad toimeainete (API) tootmiseks.
Tutvuge ultraheliga toetatud TAGGING-peptiidisünteesi eelistega!
Pidevat töötlust uuritakse edasise täiustusena – on kirjeldatud silüülitud märgisega toetatud pidevaid ühepotisünteesi platvorme.
Valdkond liigub rohelise keemia põhimõtete suunas, kus ultraheli ja TAPS aitavad mõlemad kaasa lahusti kasutuse vähendamisele, väiksemale reagentide kogusele ja paremale jätkusuutlikkusele.
Kirjandus / viited
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid alates laboriskaalast kuni tööstusliku suuruseni.