Ultraheli valkude ekstraheerimine kudedest ja rakukultuuridest
- Valkude ekstraheerimine on proteoomikas oluline proovi ettevalmistamise etapp.
- Valke saab ekstraheerida taimsetest ja loomsetest kudedest, pärmidest ja mikroorganismidest.
- Ultraheli töötlus (sonikeerimine) on usaldusväärne ja tõhus valkude ekstraheerimise meetod, mis annab lühikese ekstraheerimisaja jooksul suure valgusaagise.
Valkude ekstraheerimine kudedest ja rakkudest
Valkude ekstraheerimine kudedest ja kultiveeritud rakkudest on oluline proovi ettevalmistamise etapp, mida tehakse paljude biokeemiliste ja analüütiliste meetodite, näiteks ELISA, PAGE, Western blot, massispektromeetria või valkude puhastamise käigus. Ultraheli abil rakkude lõhkumine (desintegreerimine), lüüs ja ekstraheerimine on täpselt juhitav mittetermiline meetod, mis tagab valkude suure saagise.
Valkude ekstraheerimine rakkudest ultraheli sondiga UP200St
- Kiire
- Suur saagis
- Väga tõhus
- Parameetrite täpne juhtimine
- Korratavad tulemused
- Lineaarne skaleeritavus
Üldjuhised ultraheli lüüsiks ja valkude ekstraheerimiseks
- Temperatuuri kontroll: Suure valgusaagise tagamiseks ilma termilise denaturatsioonita tuleb ekstraheerimise ajal temperatuuri kontrollida. Hielscheri nüüdisaegsed ultraheli homogenisaatorid – mida nimetatakse ka ultraheli desintegraatoriteks või ultrasonifikaatoriteks – on täpselt juhitavad. Need on varustatud ühendatava temperatuurianduriga. Ultraheli homogenisaatori seadistusvalikutes saab määrata maksimaalse temperatuuri. Kui see maksimaalne temperatuur on saavutatud, peatub sonikaator automaatselt, kuni proov on jahtunud.
- Puhver: Sobiva puhvri valik ja puhvri õige maht varieeruvad kudedeti ning need tuleb välja selgitada katse-eksituse meetodil.
- Isoleerimine / puhastamine: Valgulüsaadid võivad sisaldada biomolekulide, näiteks DNA või süsivesikute liigset kogust, mida saab eemaldada valkude sadestamise (deoksükolaat-trikloroäädikhape) või puhvri vahetuse teel.
Chittapalo ja Noomhorm (2009) teatasid oma uuringus, et ultraheli töötluse (sonikeerimise) abil suurenes valgusaagis ning et ultraheli kudede homogeniseerimine ja lüüsiprotsess võib olemasolevaid ekstraheerimisprotsesse oluliselt täiustada – avades uusi kaubanduslikke ekstraheerimisvõimalusi.
Ultraheli CupHorn mitme proovi samaaegseks ja väga tõhusaks ettevalmistamiseks samadel tingimustel valkude isoleerimiseks ja DNA fragmenteerimiseks.
Valkude ekstraheerimine loomsest koest
Terve suurusega koe (nt neer, süda, kopsud, lihas jne) ettevalmistamiseks tuleks kude lõigata puhaste tööriistadega väga väikesteks tükkideks, eelistatavalt jääl ja võimalikult kiiresti, et vältida proteaaside põhjustatud lagunemist (nt lüüsipuhver, näiteks RIPA või hüpotooniline lüüsipuhver, mis sisaldab proteaasi- ja fosfataasiinhibiitorite kokteili). Pärast lõikamist kastetakse proov kiirkülmutamiseks vedelasse lämmastikku. Proovi saab hoiustada temperatuuril -80°C hilisemaks kasutamiseks või hoida jääl kohe homogeniseerimiseks. Vahetult enne ultraheli ekstraheerimist lisatakse proovitorusse kiiresti jahedat (jääkülma) lüüsipuhvrit (proteaasiinhibiitoritega DTT, leupeptiin ja aprotiniin) (iga ~10 mg koe kohta soovitatakse ligikaudu ~600 μL puhvrit). Proovitoru kohta soovitatakse ligikaudu 20-60mg kudet.
Ultraheli homogeniseerimine, lüüs ja ekstraheerimine tehakse ultraheli homogenisaatoriga, näiteks UP100H või UP200Ht, mis on varustatud mikrootsakuga sonotroodiga. Ultraheli töötluse kestus on 60-90 sek. ultraheli tsüklirežiimis, kus sonikeeritakse 15 sek. ja puhatakse 10 sek. Proovi tuleks kogu aeg hoida jääl.
Pärast ultraheli homogeniseerimist / ekstraheerimist tsentrifuugitakse lüsaati kiirendusega 27 000g ligikaudu 20 min. Seejärel kogutakse supernatant, et valgukontsentratsiooni saaks määrata valgutestiga, näiteks Pierce’i BCA valgutestiga.
Valkude ekstraheerimine vereseerumist
Seerumi ja fosfaatpuhvri homogeense segu saamiseks segatakse proovi enne ultraheli rakulüüsi esmalt vortex-segistil. Ultraheli lüüsiks töödeldakse proovi ultraheli laborihomogenisaatoriga, näiteks UP100H, 8 tsüklit 20% amplituudil, iga tsükkel 5 sekundit sees ja 15 sekundit väljas. Valgu ekstraheerimine toimub tsükliliselt sonikeerides (pulsatsioonirežiim) ning asetades proovi jääle, et vältida proovi ülekuumenemist ja termilist lagunemist. Kuna seerum sisaldab suures koguses suure molekulmassiga valke (näiteks albumiin, α1-antitrüpsiin, transferriin, haptoglobuliin, immunoglobuliin G ja immunoglobuliin A), mis segavad väikese molekulmassiga valkude eraldumist IEF-i ajal, on soovitatav need seerumist eemaldada, kasutades depletsioonikolonni.
Valgu ekstraheerimine taimekoest
Värsket, pehmet taimekudet, nt sammalt jms, saab hõlpsasti lõhkuda, asetades hakitud proovimaterjali lihtsalt sonikeerimiseks lüüsipuhvrisse. Tugevad, puitunud taimekuded, näiteks seemned, kuusenõelad jms, tuleks jahvatada kuivalt. Mõned kõvad, puitunud taimematerjalid tuleb enne ultraheli abil ekstraheerimist külmutada ja vedelas lämmastikus jahvatada. Taimerakukultuuri suspensioonide puhul piisab enamasti 30–150 sekundi pikkusest ultraheli töötlusest lüüsipuhvris. Tugevam materjal, näiteks kõrvitsaseemned, nõuab intensiivsemat sonikeerimist, nagu allpool kirjeldatud.
Albumiini ultraheli abil ekstraheerimise protokoll kõrvitsaseemnetest
Albumiini ultraheli abil ekstraheerimiseks peeneks jahvatatud kõrvitsaseemnepulbrist lisatakse 250 mL klaaskolbi 10 g rasvatustatud kõrvitsaseemnepulbrit ja 100 mL deioniseeritud vett lahustina. Valgu ekstraheerimine koosneb kahest etapist: esmalt sonikeeritakse proovi sondtüüpi sonikaatoriga UP400St (400W, 24kHz), mis on varustatud sonotroodiga S24d7. Klaaskolb asetatakse ultraheli homogeniseerimise ajaks külma veevanni. UP400St sonikaatori ühendatav temperatuuriandur ja temperatuuri reguleerimise seaded tagavad, et proovi temperatuur püsib alati alla 30°C. Täpse temperatuuri reguleerimise abil sonikeerimise ajal väldatakse albumiini denatureerumist. Teiseks viidi ekstraheerimine läbi segistiga kiirusel 200 rpm ja temperatuuril 30°C. Seejärel viiakse kolb termostaatilisele loksutile. Globuliin eemaldatakse dialüüsi teel destilleeritud veega. Pärast globuliini eemaldamist võib valguekstraktist võtta proovi albumiiniprofiili määramiseks ning seejärel reguleeritakse see albumiini koagulatsiooniks 0,1 M HCl abil pI=3,0 väärtusele.
Seejärel eraldatakse tahke faas tsentrifuugimisega kiirusel 5000g temperatuuril 20°C ja lahustatakse uuesti deioniseeritud vees. Albumiini koagulatsioon viiakse läbi kaks korda, et suurendada valgu osakaalu albumiinikontsentraadis.
Ultraheli abil teostatud aluseline valgu ekstraheerimine valgukontsentraadi valmistamiseks riisikliidest näitab, et ultraheli töötlus annab suurema valgusaagise oluliselt lühema ekstraheerimisaja jooksul – võrreldes tavapäraste ekstraheerimismeetoditega.
Funktsionaalse iNOS-ensüümi proovi ettevalmistamise protokoll
Täielikult funktsionaalse iNOS ensüümi saamiseks (nt ravimiskriiningu jaoks) on soovitatav järgmine protokoll: rakususpensioon tuleks asetada jääle ja sonikeerida seadmega UP100H 10µm amplituudil tsüklirežiimis 5 sek. sonikeerimist ja 25 sek. puhkust jääl. Protseduuri tuleks korrata ligikaudu 3 korda. Sonikeerimistsüklite vaheline puhkeaeg vähendab temperatuuri tõusu ja seega ka denatureerumisohtu.
Valkude ultraheli abil lahustamine
Sonikeerimine võib kiirendada valkude lahustumisprotsessi, mis nõuab tavaliselt mitu tundi. Et proovi mitte üle kuumutada ning vältida valkude lagunemist ja modifikatsioone karbamiidi sisaldavates lahustes, ei tohiks ultraheli impulsid kesta kauem kui mõni sekund.
Sonikaator UP200Ht koos 2mm mikrootsaga S26d2 väikeste proovide sonikeerimiseks.
Ultraheliseadmed valkude ekstraheerimiseks
Hielscher Ultrasonics pakub laia valikut ultraheli homogenisaatoreid rakkude, kudede, bakterite, mikroorganismide, pärmi ja eoste desintegreerimiseks.
Hielscher laboratoorsed sonikaatorid on võimsad ja lihtsalt kasutatavad. Need on loodud pidevaks 24/7 tööks ning on konstrueeritud töökindlate ja tõhusate labori- ja lauaseadmetena. Kõigi seadmete puhul saab energiavõimsust ja amplituudi täpselt reguleerida. Lai lisatarvikute valik pakub täiendavaid seadistusvõimalusi. Digitaalsetel sonikaatoritel, näiteks VialTweeter, UP200Ht, UP200St ja UP400St, on integreeritud temperatuurikontroll ja sisseehitatud SD-kaart andmete automaatseks salvestamiseks.
Mitme proovi kaudseks, ristsaastevabaks ja samaaegseks ultraheli töötluseks (sonikeerimiseks) pakume lahendusi VialTweeter või ultraheli CupHorn.
Alljärgnev tabel annab ülevaate meie sonikaatoritest proovide ettevalmistamiseks, rakkude lõhkumiseks ja ekstraheerimiseks. Klõpsake seadme tüübil, et saada iga ultraheli homogenisaatori kohta lisateavet. Meie hästi koolitatud ja pikaajalise kogemusega tehnikatöötajad aitavad teid hea meelega, et valida teie proovide ettevalmistamiseks sobivaim sonikaator!
| Partii maht | Vooluhulk | Soovitatavad seadmed |
|---|---|---|
| kuni 10 viaali või tuubi | n.a. | VialTweeter |
| multiwell- / mikrotiiterplaadid | n.a. | UIP400MTP |
| mitu tuubi / anumat | n.a. | CupHorn |
| 1 kuni 500mL | 10 kuni 200mL/min | UP100H |
| 10 kuni 1000mL | 20 kuni 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 kuni 2000mL | 20 kuni 400mL/min | UP400St |
Sõltuvalt teie rakendusest, materjalist ja proovi mahust soovitame teile oma proovide ettevalmistamiseks sobivaimat seadistust. Võtke meiega ühendust juba täna!
Võtke meiega ühendust! / Küsige meilt!
Hielscheri digitaalsetel sonikaatoritel on brauseripõhine kaugjuhtimine ja andmete automaatne protokollimine integreeritud SD-kaardile.
VialTweeter kaudseks ultraheli töötluseks (sonikeerimiseks).
Teadmisi, mida tasub teada
Proteoomika
Proteoomika on uurimisvaldkond, mis uurib valke ja proteoomi. Valgud täidavad organismides tohutul hulgal elutähtsaid funktsioone. Proteoom on kõigi valkude kogum, mida genoom, rakk, kude või organism teatud ajahetkel ekspresseerib. Proteoom muutub ajas ning sõltuvalt erinevatest nõudmistest või stressidest, mida rakk või organism kogeb. Täpsemalt on see antud tüüpi rakus või organismis antud ajahetkel ja määratletud tingimustes ekspresseeritud valkude kogum. Termin on valkude ja genoomi segu. Proteoomika on proteoomi uurimine.
Valk
Valgud on suured biomolekulid, nn makromolekulid – mis koosnevad ühest või mitmest pikast aminohappejääkide ahelast. Valke leidub kõigis nii taimset kui ka loomset päritolu organismides ning need on olulised enamiku bioloogiliste funktsioonide jaoks. Kuna valgud sisaldavad palju bioloogilist teavet, ekstraheeritakse neid analüütilisel eesmärgil, nt proteoomikauuringuteks. Valkude täidetavate kõige olulisemate funktsioonide hulka kuuluvad ainevahetusreaktsioonide katalüüs, DNA replikatsioon, reaktsioon stiimulitele ning molekulide transport ühest kohast teise. Valgud erinevad üksteisest peamiselt aminohapete järjestuse poolest, mille määrab nende geenide nukleotiidne järjestus ja mis tavaliselt viib valgu voltumiseni kindlaks kolmemõõtmeliseks struktuuriks, mis määrab selle aktiivsuse. Valgud on – lisaks peptiididele – toidu üks põhikomponente. Seetõttu on proteoomika võimas tööriist toiduteaduses protsesside, toiduohutuse ja toiteväärtuse hindamise optimeerimiseks.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction on analüüdieelne protseduur analüütide eraldamiseks ja eelkontsentreerimiseks. Koos ultraheli töötlusega (sonikeerimisega) saab hägustumispunkti ekstraheerimist intensiivistada, muutes protsessi tõhusamaks, kiiremaks ja keskkonnasõbralikumaks. Ultraheli töötlusega (sonikeerimisega) on hägustumispunkti ekstraheerimine märkimisväärselt tõhusam analüütide ettevalmistamise meetod. Lugege lähemalt ultrahelitoetatud hägustumispunkti ekstraheerimise kohta!
Geelelektroforees
Geelelektroforees on peamine meetod makromolekulide, näiteks DNA, RNA ja valkude ning nende fragmentide eraldamiseks ja analüüsimiseks nende suuruse ja laengu alusel. Kliinilises keemias kasutatakse seda valkude eraldamiseks laengu ja/või suuruse järgi (IEF agaroos, oluliselt suurusest sõltumatu) ning biokeemias, molekulaarbioloogias ja proteoomikas DNA ja RNA fragmentide segupopulatsiooni eraldamiseks pikkuse järgi, DNA ja RNA fragmentide suuruse hindamiseks või valkude eraldamiseks laengu järgi.
Rakukultuurid
Rakukultuur on kontrollitud kasvatusprotsess, mille käigus rakke kultiveeritakse kontrollitud tingimustes. Rakukultuuri tingimused erinevad iga rakutüübi puhul. Üldiselt koosneb rakukultuuri keskkond sobivast anumast (nt Petri tass), substraadist või söötmest, mis varustab rakke oluliste toitainetega (aminohapped, süsivesikud, vitamiinid, mineraalained), kasvufaktoritega, hormoonidega ja gaasidega (CO2, O2), ning reguleerib füüsikalis-keemilist keskkonda (pH puhver, osmootne rõhk, temperatuur). Enamik rakke vajab pinda või tehissubstraati, samas kui teisi rakukultuure saab kultiveerida söötmes vabalt hõljudes (suspensioonikultuur, rakususpensioon).
Loomsete rakuliinide massikultuure kasutatakse viirusvaktsiinide ja muude biotehnoloogiliselt saadud toodete tööstuslikus tootmises. Inimese tüvirakke kultiveeritakse rakkude arvu suurendamiseks ning rakkude diferentseerimiseks erinevateks somaatilisteks rakutüüpideks siirdamise eesmärgil.
Koeproovid
Mõiste kude tähistab rakulist vahevormi, kus rakumaterjal asub organisatsioonitasandil rakkude ja terve organi vahel. Koes on koondunud sarnased rakud samast päritolust, mis koos täidavad kindlat funktsiooni. Mitme koe funktsionaalse rühmitumise tulemusena moodustuvad organite keerukad struktuurid.
Koeproove võetakse uuringuteks bioloogias, histoloogias/histopatoloogias, parasitoloogias, biokeemias, immunohistokeemias, samuti DNA kultiveerimiseks ja eraldamiseks. Eristada saab loomset (alajaotus: imetajate kude) ja taimset kudet. Loomsed koed jaotatakse nelja põhitüüpi: side-, lihas-, närvi- ja epiteelkude. Taimne kude jaguneb järgmiseks kolmeks koesüsteemiks: epidermis, põhikude ja juhtkude.
Koeproove saab valmistada loomsetest või taimsetest osadest, nt luust, lihasest, lehtedest jne.
Kehavedelikud
Veri, seerum, plasma, tserebrospinaalvedelik, sülg ja sünoviaalvedelik on kehavedelikud, mis pakuvad suurepärast diagnostiliselt oluliste andmete allikat. Seetõttu on kehavedelikuproovide keerukas ettevalmistamine analüüsiks oluline. Esimene raskus on seotud kehavedelikes sisalduvate komponentide laia dünaamilise ulatusega.
Valgu kontsentratsiooni määramine
Bradfordi test, Lowry test ja bitsinkoniinhappe (BCA) test on levinud testid valkude kontsentratsiooni määramiseks. Veise seerumi albumiin (BSA) on üks sagedamini kasutatavaid valgustandardeid.
Lüüsipuhver
Lüüsipuhver tuleb valida vastavalt rakumaterjalile või koele (koekultuur, taim, bakterid, seened jne) ning sellele, kas rakud on struktuuris, ja millisele struktuuri tüübile. Lai valik lüüsipuhvreid valkude, membraanide ja organellide ekstraheerimiseks on valmistatud ühe või mitme detergendiga. Detergent valitakse tavaliselt katse-eksituse meetodil või – kui see on olemas – olemasoleva valgu ekstraheerimise protokolli järgi. Detergent peab sobima koeallika ja valkudega. Üldiselt valitakse kõige leebem detergent, mis konkreetse koe / valgu puhul toimib, et säilitada ekstrakti maksimaalne funktsionaalsus. Lisaks hoiab membraanide ja organellide ekstraheerimisel leebe detergent membraani terviklikuna. Lüüsipuhvrites tavaliselt kasutatavad detergendid on enamasti mitteioonsed või zwitterioonsed, nt CHAPS, deoksükolaat, Triton™ X-100, NP40 ja Tween 20.
Näiteks aju-, maksa-, soole-, neeru-, põrna- jt koeid saab lihtsalt RIPA-ga puhverdada – kuid lisada tuleks proteaasi inhibiitorid ja DTT (nt geelelektroforeesi jaoks).
Lüüsipuhver skeletilihaskoele (jääkülm): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glütserool, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitool, millele on lisatud proteaasi- ja fosfataasi-inhibiitorite kokteil
Tavaliste puhvrite ja nende pH vahemike tabel. Üldiselt kasutatakse neid puhvreid tavaliselt kontsentratsioonides 20-50 mM.
| Puhver | pH vahemik |
|---|---|
| Sidrunhape – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Naatriumtsitraat – sidrunhape | 3,0 – 6,2 |
| Naatriumatsetaat – äädikhape | 3,6 – 5,6 |
| Kakodüülhappe naatriumsool – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Naatriumdivesinikfosfaat – dinaatriumvesinikfosfaat | 5,8 – 8,0 |
| Imidasool – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Trietanoolamiinvesinikkloriid – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Tritsiin – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Naatriumtetraboraat – boorhape | 7,6 – 9,2 |
| Bitsiin – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glütsiin – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Enamiku puhvrite pH sõltub temperatuurist. See kehtib eriti Tris-puhvrite kohta. pKa muutub väärtuselt 8,06 temperatuuril 25°C väärtusele 8,85 temperatuuril 0°C.
(Puhvri pH ja pKa: pH mõõdab vesilahuses vesinikioonide kontsentratsiooni. pKa (= happe dissotsiatsioonikonstant) on sellega seotud, kuid täpsem mõõt, kuna see aitab ennustada, kuidas molekul käitub kindla pH väärtuse juures.)
TRIzol
TRIzol on keemiline lahus, mida kasutatakse RNA/DNA/valgu ekstraheerimiseks guanidiintiotsüanaat-fenool-kloroform-ekstraktsiooni käigus. Ultraheli abil toetatud TRIzol-ekstraktsiooni kasutamine annab samast proovist suure DNA, RNA ja valgu saagise ning ületab seeläbi teisi ekstraktsioonimeetodeid.
Kirjandus/viited
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.