Ultraheli proteiinide ekstraheerimine koe- ja rakukultuuridest
- Valguekstraktsioon on oluline proteoomika proovide ettevalmistamise etapp.
- Valke saab ekstraheerida taimsetest ja loomakudest, pärmidest ja mikroorganismidest.
- Sonikatsioon on usaldusväärne ja efektiivne valkude ekstraheerimise meetod, mis annab lühikese ekstraheerimise ajal kõrge valgusisalduse.
Kudede ja rakkude valkude ekstraheerimine
Valkude ekstraheerimine kudedest ja kultiveeritud rakkudest on oluline proovi ettevalmistamise etapp, mis viiakse läbi paljude biokeemiliste ja analüütiliste meetodite käigus, nagu ELISA, PAGE, Western blotting, massispektromeetria või valgu puhastamine. Ultraheli rakkude katkestamine, lüüs ja ekstraheerimine on täpselt kontrollitav, mittetermiline tehnika, et tagada valkude kõrge saagis.
Valgu ekstraheerimine rakkudest koos ultraheli sond UP200St
- kiire
- suuremad saagised
- väga tõhus
- Parameetrite täpne kontroll
- reprodutseeritavad tulemused
- lineaarne mastaapsus
Ultraheli lüüsi ja valgu ekstraheerimise üldised juhised
- Temperatuuri kontroll: Et tagada kõrge valgusisalduse ilma termilise denatureerimiseta, tuleb ekstraheerimise ajal kontrollida temperatuuri. Hielscheri uusimad ultraheli homogenisaatorid – nimetatakse ka ultraheli desintegraatoriks või ultraheli – on täpselt kontrollitavad. Nad on varustatud ühendatava temperatuurianduriga. Ultraheli homogenisaatori seadevalikus saab määrata maksimaalse temperatuuri. Kui see temperatuur max saavutab, lõpeb ultrasonikaator automaatselt, kuni proov on maha jahtunud.
- Puhver: Sobiva puhvri ja õige puhvri mahu valik sõltub koest kudedesse ning seda tuleb uurida katsetuste ja vigade testimise teel.
- Isolatsioon / puhastamine: Proteiini lüsaadid võivad sisaldada selliseid biomolekule nagu DNA või süsivesikud, mida võib eemaldada valgu sademetega (deoksükolaat-trikloroäädikhape) või puhverlahusega.
Chittapalo ja Noomhorm (2009) teatasid oma uuringus, et valgu saagis suurenes ultrahelitöötluse abil ning et ultraheli koe homogeniseerimis- ja lüüsiprotsess võib oluliselt parandada olemasolevaid ekstraheerimisprotsesse – uute kaubanduslike kaevandamisvõimaluste võimaldamine.
Ultraheli kastanahk mitme proovi samaaegseks ja väga tõhusaks proovi ettevalmistamiseks samadel tingimustel valgu eraldamiseks ja DNA killustamiseks.
Loomsetest kudest pärit proteiini ekstraheerimine
Kogu suurusega koe (nt neer, süda, kops, lihased jne) valmistamiseks tuleks koed jaotada väga väikestesse tükkidesse puhaste tööriistadega, jäädavalt jääl ja võimalikult kiiresti, et vältida degradeerumist proteaasidega (nt lüüsi puhver, nagu RIPA või hüpotooniline lüüsi puhver, mis sisaldab proteaasi ja fosfataasi inhibiitorikokteili). Pärast loksutamist pannakse proov prooviks külmutamiseks vedelasse lämmastikku. Proovi võib hiljem säilitada -80 ° C juures või hoida kohe homogeenimisel jääl. Vahetult enne ultraheli ekstraheerimist lisatakse proovi tuubule kiiresti külma lüüsi puhver (proteaasi inhibiitoritega DTT, leupeptiin ja aprotiniin) (soovitatavalt ~ 10 mg koe kohta on umbes 600 ui puhvrit). Ligikaudu Proovikorpuse kohta soovitatakse 20-60 mg kudet.
Ultraheli homogeniseerimine, lüüs ja ekstraheerimine viiakse läbi ultraheli homogenisaatoriga, näiteks UP100H või UP200Ht, mis on varustatud mikro-otsa sonotrode'iga. Sonikatsiooni kestus on 60-90 sek. ultraheli tsükli režiimis 15 sek. ultrahelitöötlus ja 10 sek. puhkeaeg. Proovi tuleks hoida kogu aeg jääs.
Pärast ultraheli homogeenimist / ekstraheerimist tsentrifuugitakse lüsaati umbes 27 000 g juures. 20 min Seejärel kogutakse supernatant, nii et valgu kontsentratsiooni saab määrata valguanalüüsiga, nagu Pierce'i valgu analüüs BCA.
Proteiini ekstraheerimine vere seerumist
Seerumi ja fosfaatpuhvri homogeense segu puhul pööritatakse proov kõigepealt enne ultraheli rakkude lüüsi. Ultraheli lüüsi jaoks töödeldakse proovi ultraheliga ultraheli labori homogenisaatoriga, näiteks UP100H 8 tsükliga 20% amplituudiga, iga 5-sekundilise sisse- ja 15-sekundilise tsükli jaoks. Valgu ekstraheerimine toimub ultraheliga töötlemisega tsüklites (pulsatsioonirežiim) ja asetades proovi jääle nii, et välditakse proovi ülekuumenemist ja termilist lagunemist. Kuna seerum sisaldab suures koguses suure molekulmassiga valke (nagu albumiin, α1-antitrüpsiin, transferriin, haptoglobuliin, immunoglobuliin G ja immunoglobuliin A), mis häirivad madala molekulmassiga valkude eraldamist IEF-i ajal, on soovitatav neid seerumist kahandada, kasutades ammendumiskolonni.
Valkude ekstraheerimine taimkudest
Värsket, pehmet taimekaudu, nt sambla jne, saab kergesti katkestada, lihtsalt pannes tükeldatud proovimaterjali lüüsipuhvris ultrahelitöötluseks. Karmid, viljakad taimekuded, nagu seemned, kuuskindlad vms, peaksid olema jahvatatud. Mõned kõvad puitunud taimsed materjalid tuleb enne ultraheliga töötlemist külmutada ja jahvatada vedelas lämmastikus. Taimede rakukultuuri suspensioonide puhul on piisav piisav ultraheliravim lüüsipuhvris 30 kuni 150 sekundit. Pingematerjal, näiteks kõrvitsaseemned, vajab intensiivsemat ultrahelitöötlust, nagu allpool kirjeldatud.
Kõrvitsaseemnete albumiini ultraheli ekstraheerimise protokoll
Albumiini ultrahelivalgu ekstraheerimiseks peeneks jahvatatud kõrvitsaseemne pulbrist lisatakse 250 ml klaasist keeduklaasi 10 g rasvatustatud kõrvitsaseemne pulbrit ja 100 ml deioniseeritud vett lahustina. Valgu ekstraheerimine koosneb kahest etapist: Esiteks töödeldakse proovi ultraheliga sondi tüüpi ultrasonikaator UP400St (400W, 24kHz), mis on varustatud sonotrode S24d7-ga. Klaasist keeduklaas asetatakse ultraheli homogeniseerimise ajal külma veevanni. Ühendatav temperatuuriandur ja ultrasonikaatori UP400St temperatuuri reguleerimise seaded tagavad, et proovi temperatuuri hoitakse alati alla 30 ° C. Täpse temperatuuri reguleerimisega ultrahelitöötluse ajal välditakse albumiini denatureerimist. Teiseks viidi ekstraheerimine läbi segistiga kiirusel 200 p / min ja temperatuuril 30 ° C. Seejärel viiakse keeduklaas termostaatilisse loksutisse. Globuliin eemaldatakse dialüüsi teel destilleeritud veega. Pärast globuliini eemaldamist võib albumiiniprofiili määramiseks võtta valguekstraktist proovi ja seejärel reguleerida selle väärtusele pI = 3,0, kasutades albumiini koagulatsiooniks 0,1 M HCl. Tahke faas eraldatakse tsentrifuugimise teel temperatuuril 5000 g ja 20 °C ning lahustatakse uuesti deioniseeritud vees. Albumiini koagulatsioon viiakse läbi kaks korda, et suurendada valgu suhet albumiini kontsentraadis.
Ultraheli leeliselise valgu ekstraheerimine riisikliidest valgu kontsentraadi valmistamiseks näitab, et ultraheliravi tagab suurema valgusisalduse märgatavalt lühema ekstraktsiooniaja jooksul – võrreldes tavaliste ekstraheerimismeetoditega.
Proovide võtmise protokoll funktsionaalse iNOS ensüümi jaoks
Täielikult toimiva iNOS-ensüümi saamiseks (nt ravimite sõeluuringuteks) on soovitatav kasutada järgmist protokolli: Rakususpensioon tuleb asetada jääle ja seda töödeldakse ultraheliga UP100H-ga 10 μm amplituudiga tsükli režiimis 5 sekundit. Protseduuri tuleks korrata ca 3 korda. Puhkeaeg ultrahelitöötlustsüklite vahel vähendab temperatuuri tõusu ja vähendab seega denaturatsiooni ohtu.
Ultraheli proteiini lahustumine
Sonikatsioon võib kiirendada valgu lahustumist, mis tavaliselt nõuab mitu tundi. Proovi ülekuumenemise vältimiseks ja valgu lagunemise vältimiseks ja uurea sisaldavate lahuste modifitseerimisel ei tohiks ultraheli purunemised kesta kauem kui paar sekundit.
Ultrasonikaator UP200Ht 2mm mikrotipuga S26d2 väikeste proovide ultrahelitöötluseks.
Ultraheli seadmed valgu ekstraheerimiseks
Hielscher Ultrasonics pakub laias valikus ultraheli homogenisaatorid rakkude, kudede, bakterite, mikroorganismide, pärmi ja eoste lagunemist.
Hielscheri labori ultrasonikaatorid on võimsad ja kergesti kasutatavad. Need on ehitatud 24/7 tööks, need on konstrueeritud tugevate ja tõhusate labori- ja pink-top seadmetena. Kõigi seadmete puhul saab energiaväljundit ja amplituudi täpselt kontrollida. Tarvikute lai valik avab täiendavaid seadistusvõimalusi. Digitaalsetel ultrasonikaatoritel nagu VialTweeter, UP200Ht, UP200St ja UP400St on integreeritud temperatuuri reguleerimine ja sisseehitatud SD-kaart automaatseks andmete salvestamiseks.
Mitme proovi kaudseks, ristsaastumisvabaks ja samaaegseks ultrahelitöötluseks pakume VialTweeterit või ultraheli CupHorni.
Allolev tabel annab teile ülevaate meie ultrasonikaatoritest proovide ettevalmistamiseks, rakkude katkestamiseks ja ekstraheerimiseks. Klõpsake seadme tüübil, et saada lisateavet iga ultraheli homogenisaatori kohta. Meie hästi koolitatud ja pikaajalised kogemused tehnilised töötajad aitavad teil hea meelega valida oma proovi ettevalmistamiseks kõige sobivama ultrasonikaatori!
| partii Köide | flow Rate | Soovitatavad seadmed |
|---|---|---|
| kuni 10 viaali või tuubi | e.k. | VialTweeter |
| multiwell / microtiter plaadid | e.k. | Led, mida sa ei pea booking.com-i külastajaid vastu |
| mitu toru / anumat | e.k. | CupHorn |
| 1 kuni 500 ml | 10 kuni 200 ml / min | UP100H |
| 10 kuni 1000 ml | 20 kuni 200 ml/min | Uf200 ः t, UP200St |
| 10 kuni 2000 ml | 20 kuni 400 ml / min | UP400St |
Sõltuvalt teie taotlusest, materjalist ja proovi mahust soovitame prooviproovide jaoks kõige sobivamat seadistust. Võtke meiega ühendust täna!
Võta meiega ühendust! / Küsi meiega!
Hielscheri digitaalsetel ultrasonikaatoritel on brauseri kaugjuhtimispult ja automaatne andmete protokollimine integreeritud SD-kaardil.
VialTweeter kaudne ultrahelitöötlus.
Faktid Tasub teada
Proteoomika
Proteoomika on uurimisvaldkond, mis uurib valke ja proteomeeri. Valgud täidavad hulgaliselt elutähtsaid funktsioone organismides. Proteoom on kogu komplekt valke, mida teatud aja jooksul genoomi, rakke, kudesid või organisme väljendavad. Proteoom varieerub aja ja erinevate nõuetega või rõhutab, et rakk või organism läbib. Konkreetsemalt on antud teatud tüüpi rakus või organismis teatud aja jooksul määratletud tingimustel ekspresseeritud valkude kogum. Terminiks on valkude ja genoomi segu. Proteoomika on proteoomide uurimine.
Valk
Valgud on suured biomolekulid, nn makromolekulid – mis koosnevad ühest või enamast aminohappejääkide pikkast ahelast. Valgud esinevad kõigis taimsetes ja loomset päritolu organismides ning need on olulised enamiku bioloogiliste funktsioonide jaoks. Kuna valgud sisaldavad palju bioloogilist teavet, ekstraheeritakse need analüütiliseks otstarbeks, nt proteoomikate uurimiseks. Valkude kõige olulisem funktsioon hõlmab metaboolsete reaktsioonide katalüüsi, DNA replikatsiooni, reaktsiooni ärritajale ja molekulide transporti ühest kohast teise. Valgud erinevad üksteisest peamiselt nende aminohapete järjestuses, mis on dikteeritud nende geenide nukleotiidijärjestusega ja mis tavaliselt toob kaasa valkude kokkuvõtmise konkreetsele kolmemõõtmelisele struktuurile, mis määrab selle aktiivsuse. Valgud on – lisaks peptiididele – üks toidu põhikomponente. Seetõttu on proteoomika toidusteaduses võimas vahend protsesside optimeerimiseks, toiduohutuse ja toitumise hindamiseks.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction on eelanalüütiline protseduur analüütide eraldamiseks ja eelkontsentreerimiseks. Koos ultraheliga saab pilvepunkti ekstraheerimist intensiivistada, muutes protsessi tõhusamaks, kiiremaks ja keskkonnasõbralikumaks. Ultraheliga on pilvepunkti ekstraheerimine oluliselt tõhusam analüütide valmistamise meetod. Loe lähemalt ultraheli abil pilvepunkti ekstraheerimise kohta!Geeli elektroforees
Geeli elektroforees on makromolekulide nagu DNA, RNA ja valkude ning nende fragmentide eraldamise ja analüüsi peamine meetod nende suuruse ja laengu põhjal. Seda kasutatakse kliinilises keemias, et eraldada valgud maksas ja / või suuruses (IEF agaroos, sisuliselt sõltumatu suurusega) ning biokeemias, molekulaarbioloogias ja proteoomikas, et eraldada DNA ja RNA fragmentide segatud populatsioon pikkusega, et hinnata DNA suurust ja RNA fragmendid või eraldada valgud laenguga.
Rakukultuurid
Rakukultuur on kontrollitud kasvuprotsess, mille kaudu rakke kasvatatakse kontrollitud tingimustes. Rakukultuuri tingimused on iga rakutüübi jaoks erinevad. Üldiselt koosneb rakukultuuri keskkond sobivast anumast (nt Petri tassist) substraadist või söötmest, mis varustab olulisi toitaineid (aminohapped, süsivesikud, vitamiinid, mineraalid), kasvufaktorid, hormoonid ja gaasid (CO2, O.2) ja reguleerib füsikokeemilist keskkonda (pH puhver, osmootne rõhk, temperatuur). Enamikel rakkudel on vaja pinda või kunstlikku substraati, samal ajal kui muud rakukultuure saab kasvatada kultiveerimissöötmes, mis ujub vabalt (suspensioonikultuur, rakususpensioon).
Loomade rakuliinide massilisi kultuure kasutatakse viiruslike vaktsiinide ja muude biotehnoloogiliselt saadud toodete tööstuslikuks tootmiseks. Inimese tüvirakke kasvatatakse rakkude arvu suurendamiseks ja rakkude diferentseerimiseks erinevate somaatiliste rakutüüpide jaoks siirdamise eesmärgil.
Koeproovid
Termin koes kirjeldab rakulist vaheühendit, kus rakumaterjal on organisatsiooni tasandil rakkude ja täieliku elundi vahel. Kudesid koondatakse sarnased rakud, mis pärinevad samast päritolust ja mis täidavad spetsiifilist funktsiooni. Mitme koe funktsionaalse rühmituse järgi moodustuvad elundite kompleksstruktuurid.
Kude valitakse uuringuteks bioloogias, histoloogias / histopatoloogias, parasitoloogias, biokeemias, immunohistokeemias ning DNA kultiveerimisel ja eraldamisel. Seda saab eristada loomade (alarajoon: imetajate koe) ja taime kude vahel. Loomkuded on rühmitatud nelja lihase, lihase, närvisüsteemi ja epiteeli kude põhiliiki. Taimekoed jaotatakse kolmeks järgmisteks koesüsteemideks: epiderm, maapinna koe ja vaskulaarne koe.
Kudede proove saab valmistada loomsetest või taimeosadest, nt luust, lihastest, lehtedest jne
Kehavedelikud
Veri, seerum, plasma, tserebrospinaalvedelik, sülg ja sünoviaalvedelik on kehavedelikud, mis pakuvad suurepärast diagnostiliselt olulist teavet. Seetõttu on oluline analüüsida keha vedelate proovide ettevalmistamine analüüsimiseks. Esimene raskus on seotud keha vedelike komponentide laia dünaamilise vahemikuga.
Valgu kontsentratsiooni määramine
Bradfordi analüüs, Lowry test ja bitsinhoniinhappe (BCA) test on tavalised testid valkude kontsentratsiooni määramiseks. Veise seerumi albumiin (BSA) on üks kõige sagedamini kasutatavast valgu standardist.
Lüüsipuhver
Lüüsi puhver tuleb valida vastavalt rakumaterjalile või koele (koekultuur, taim, bakter, seened jne) ja kas rakud on struktuuris ja struktuuri tüübis. Valkude, membraanide ja organellide ekstraheerimiseks valitakse laia valikut lüüsipuhvreid ühe või mitme detergendiga. Detergent valitakse tavaliselt katseliselt ja vea testidena või – kui see on olemas – vastavalt olemasolevale valgu ekstraheerimise protokollile. Detergent peab ühilduma koeallikaga ja valkudega. Ekstrakti maksimaalse funktsionaalsuse säilitamiseks valitakse üldiselt kergem puhastusvahend, mis töötab spetsiifilise koe / valgu jaoks. Peale selle, membraanide ja organellide ekstraheerimise korral hoiab kerge pesuaine membraani puutumatuna. Tavaliselt kasutatavad pesuvahendid lüüsi puhvrites on enamasti mitteioonsed või tsvitterioonilised, näiteks CHAPS, deoksükolaat, Triton ™ X-100, NP40 ja Tween 20.
Näiteks võib kudesid, nagu aju, maksa, soolestikku, neerud, põrn jne, lihtsalt puhverdada RIPA-ga – tuleb siiski lisada proteaasi inhibiitorid ja DTT (nt geelelektroforeesi).
Lüüsi puhver skeletilihaste kudedes (jääkülm): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (mass / maht) glütserool, 1 mM EDTA , 1 mM ditiotreitooli, millele oli lisatud proteaasi ja fosfataasi inhibiitori kokteile
Tabel ühiste puhvrite ja nende pH-väärtuste kohta. Üldiselt kasutatakse neid puhvreid tavaliselt kontsentratsioonides 20-50 mM.
| Puhver | pH vahemik |
|---|---|
| Sidrunhape – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Naatriumtsitraat – Sidrunhape | 3.0 – 6.2 |
| Naatriumatsetaati – äädikhape | 3.6 – 5.6 |
| Cacodylic acid naatriumsool – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Naatriumdivesinikfosfaat – dinaatriumvesinikfosfaat | 5.8 – 8.0 |
| Imidasool – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Trietanoolamiinvesinikkloriid – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Naatriumtetraboraat – boorhape | 7.6 – 9.2 |
| Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| Glütsiin – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Enamik puhvreid näitavad pH sõltuvust temperatuurist. See kehtib eriti Tris puhvrite kohta. PKa muutub temperatuuril 0 ° C 8,06 juures temperatuuril 25 ° C kuni 8,85 ° C.
(puhverlahuse pH ja pKa: pH mõõdab vesinikuioonide kontsentratsiooni vesilahuses, pKa (= happe dissotsiatsiooni konstant) on seotud, kuid täpsem mõõde, kuna see aitab ennustada, kuidas molekul toimib spetsiifilises pH väärtus.)
TRIzol
TRIzol on keemiline lahus, mida kasutatakse RNA / DNA / valgu ekstraheerimiseks guanidiiniumtiotsüanaadi-fenool-kloroformi ekstraheerimise ajal. Ultrasoniseeritava TRIzoli ekstraheerimise kasutamine tagab sama proovi kõrge DNA, RNA ja valgu saagise ning muudab ekstra ekstrakti meetodid.
Kirjandus / viited
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.