Ultraheli valgu ekstraheerimine koe- ja rakukultuuridest
- Valgu ekstraheerimine on proteoomikas oluline proovi ettevalmistamise etapp.
- Valke saab ekstraheerida taimsetest ja loomsetest kudedest, pärmidest ja mikroorganismidest.
- Sonikatsioon on usaldusväärne ja tõhus valgu ekstraheerimise meetod, mis annab lühikese ekstraheerimisaja jooksul kõrge valgusisalduse.
Valgu ekstraheerimine kudedest ja rakkudest
Valkude ekstraheerimine kudedest ja kultiveeritud rakkudest on oluline proovi ettevalmistamise etapp, mis viiakse läbi paljude biokeemiliste ja analüütiliste meetodite käigus, nagu ELISA, PAGE, Western blotting, massispektromeetria või valgu puhastamine. Ultraheli rakkude katkestamine, lüüsimine ja ekstraheerimine on täpselt kontrollitav, mittetermiline tehnika, et tagada valkude kõrge saagis.
Valgu ekstraheerimine rakkudest ultraheli sond UP200St
- Kiire
- kõrge saagikus
- Väga tõhus
- Parameetrite täpne kontroll
- Korratavad tulemused
- lineaarne mastaapsus
Ultraheli lüüsi ja valgu ekstraheerimise üldjuhised
- Temperatuuri reguleerimine: To ensure a high protein yield without thermal denaturation, temperature during extraction must be controlled. Hielscher’s state-of-art ultrasonic homogenizers – nimetatakse ka ultraheli desintegraatoriks või ultraheli – on täpselt kontrollitavad. Neil on ühendatav temperatuuriandur. Ultraheli homogenisaatori seadistusvalikutes saab seadistada maksimaalse temperatuuri. Kui see temperatuur max on saavutatud, peatub ultrasonikaator automaatselt, kuni proov on jahtunud.
- Puhver: Sobiva puhvri ja õige puhvri mahu valik on koeti erinev ning see tuleb välja selgitada katse-eksituse meetodil.
- Isolatsioon? puhastamine: Valgulüsaadid võivad sisaldada liigselt biomolekule, nagu DNA või süsivesikud, mida saab eemaldada valgu sadestamise (deoksükolaat-trikloroäädikhape) või puhvervahetuse teel.
Chittapalo ja Noomhorm (2009) teatasid oma uuringus, et valgu saagis suurenes ultrahelitöötluse abil ning et ultraheli koe homogeniseerimine ja lüüsiprotsess võivad oluliselt suurendada olemasolevaid ekstraheerimisprotsesse – uute kaubanduslike kaevandamisvõimaluste võimaldamine.
Ultraheli CupHorn mitme proovi samaaegseks ja väga tõhusaks proovi ettevalmistamiseks samadel tingimustel valgu eraldamiseks ja DNA killustamiseks.
Valgu ekstraheerimine loomsetest kudedest
Terve suurusega koe (nt neerud, süda, kops, lihased jne) valmistamiseks tuleks kude lõigata väga väikesteks tükkideks puhaste tööriistadega, eelistatavalt jääl ja võimalikult kiiresti, et vältida lagunemist proteaasidega (nt lüüsipuhver nagu RIPA või hüpotooniline lüüsipuhver, mis sisaldab proteaasi ja fosfataasi inhibiitorikokteili). Pärast tükeldamist kastetakse proov külmutamiseks vedelasse lämmastikku. Proovi võib hilisemaks kasutamiseks säilitada temperatuuril -80 °C või hoida jääl koheseks homogeniseerimiseks. Vahetult enne ultraheli ekstraheerimist lisatakse katseklaasi kiiresti jääkülma lüüsi puhver (proteaasi inhibiitoritega DTT, leupeptiin ja aprotiniin) (soovitatav on ~ 10 mg koe kohta umbes ~ 600 μL puhvrit). Ühe katseklaasi kohta soovitatakse umbes 20-60 mg kudet.
Ultraheli homogeniseerimine, lüüsimine ja ekstraheerimine viiakse läbi ultraheli homogenisaatoriga nagu UP100H või UP200Ht, mis on varustatud mikro-otsa sonotrode'iga. Sonikatsiooni kestus on 60-90 sek. ultraheli tsükli režiimis 15 sek. ultrahelitöötlus ja 10 sek. Proovi tuleks hoida kogu aeg jääs.
Pärast ultraheli homogeniseerimist? ekstraheerimist tsentrifuugitakse lüsaati 27 000 g juures umbes 20 minutit. Seejärel kogutakse supernatent, nii et valgu kontsentratsiooni saab määrata valguanalüüsiga, näiteks Pierce'i valguanalüüsiga BCA.
Valgu ekstraheerimine vereseerumist
Seerumi ja fosfaatpuhvri homogeense segu puhul pööritatakse proov kõigepealt enne ultraheli rakkude lüüsi. Ultraheli lüüsi jaoks töödeldakse proovi ultraheliga ultraheli labori homogenisaatoriga, näiteks UP100H 8 tsükliga 20% amplituudiga, iga 5 sekundi tsüklite jaoks sisse ja 15 sekundit välja. Valgu ekstraheerimine toimub ultraheliga töötlemisega tsüklites (pulsatsioonirežiim) ja asetades proovi jääle nii, et välditakse proovi ülekuumenemist ja termilist lagunemist. Kuna seerum sisaldab suures koguses suure molekulmassiga valke (nagu albumiin, α1-antitrüpsiin, transferriin, haptoglobuliin, immunoglobuliin G ja immunoglobuliin A), mis häirivad madala molekulmassiga valkude eraldamist IEF-i ajal, on soovitatav neid seerumist kahandada, kasutades ammendumiskolonni.
Valgu ekstraheerimine taimekoest
Värsket, pehmet taimekudet, nt sammal jne, saab kergesti häirida, asetades tükeldatud proovimaterjali ultrahelitöötluseks lihtsalt lüüsipuhvrisse. Sitked, liigniisked taimekoed, nagu seemned, kuuseokkad jne, tuleks jahvatada kuivaks. Mõned kõvad, puitunud taimsed materjalid tuleb enne ultrahelitöötlusega ekstraheerimist külmutada ja jahvatada vedelas lämmastikus. Taimerakukultuuri suspensioonide puhul piisab enamasti ultraheli töötlemisest 30 kuni 150 sekundi jooksul lüüsipuhvris. Karmim materjal, näiteks kõrvitsaseemned, vajab intensiivsemat ultrahelitöötlust, nagu allpool kirjeldatud.
Kõrvitsaseemnetest albumiini ultraheli ekstraheerimise protokoll
Albumiini ultrahelivalgu ekstraheerimiseks peeneks jahvatatud kõrvitsaseemne pulbrist lisatakse 250 ml klaasist keeduklaasi 10 g rasvatustatud kõrvitsaseemne pulbrit ja 100 ml deioniseeritud vett lahustina. Valgu ekstraheerimine koosneb kahest etapist: Esiteks töödeldakse proovi ultraheliga sondi tüüpi ultrasonikaator UP400St (400W, 24kHz), mis on varustatud sonotrode S24d7-ga. Klaasist keeduklaas asetatakse ultraheli homogeniseerimise ajal külma veevanni. Ühendatav temperatuuriandur ja ultrasonikaatori UP400St temperatuuri reguleerimise seaded tagavad, et proovi temperatuuri hoitakse alati alla 30 ° C. Täpse temperatuuri reguleerimisega ultrahelitöötluse ajal välditakse albumiini denatureerimist. Teiseks viidi ekstraheerimine läbi segistiga kiirusel 200 p? min ja temperatuuril 30 ° C. Seejärel viiakse keeduklaas termostaatilisse loksutisse. Globuliin eemaldatakse dialüüsi teel destilleeritud veega. Pärast globuliini eemaldamist võib albumiiniprofiili määramiseks võtta valguekstraktist proove ja seejärel reguleerida selle väärtusele pI = 3,0, kasutades albumiini koagulatsiooniks 0,1 M HCl. Tahke faas eraldatakse tsentrifuugimise teel temperatuuril 5000 g ja 20 °C ning lahustatakse uuesti deioniseeritud vees. Albumiini koagulatsioon viiakse läbi kaks korda, et suurendada valgu suhet albumiini kontsentraadis.
Ultraheli leeliselise valgu ekstraheerimine riisikliidest valgukontsentraadi valmistamiseks näitab, et ultraheli töötlemine toob kaasa suurema valgu saagise oluliselt lühema ekstraheerimisajaga – võrreldes tavapäraste ekstraheerimismeetoditega.
Funktsionaalse iNOS-ensüümi proovi ettevalmistamise protokoll
Täielikult toimiva iNOS-ensüümi saamiseks (nt ravimite sõeluuringuks) on soovitatav kasutada järgmist protokolli: rakususpensioon tuleb asetada jääle ja seda töödeldakse ultraheliga UP100H-ga 10 μm amplituudiga tsüklirežiimis 5 sekundit. Protseduuri tuleks korrata ca 3 korda. Puhkeaeg ultrahelitöötlustsüklite vahel vähendab temperatuuri tõusu ja vähendab seega denaturatsiooni ohtu.
ultraheli valgu lahustumine
Sonikatsioon võib kiirendada valgu lahustumisprotsessi, mis tavaliselt nõuab mitu tundi. Et mitte proovi üle kuumeneda ja vältida valgu lagunemist ja muudatusi karbamiidi sisaldavates lahustes, ei tohiks ultraheli purunemised kesta kauem kui paar sekundit.
Ultrasonikaator UP200Ht 2 mm mikrotiibiga S26d2 väikeste proovide ultraheliga töötlemiseks.
Ultraheli seadmed valgu ekstraheerimiseks
Hielscher Ultrasonics pakub laia valikut ultraheli homogenisaatoreid rakkude, kudede, bakterite, mikroorganismide, pärmi ja eoste lagunemiseks.
Hielscheri labori ultrasonikaatorid on võimsad ja kergesti kasutatavad. Need on loodud 24/7 tööks, need on konstrueeritud tugevate ja tõhusate labori- ja pink-top seadmetena. Kõigi seadmete puhul saab energiaväljundit ja amplituudi täpselt kontrollida. Tarvikute lai valik avab täiendavaid seadistusvõimalusi. Digitaalsetel ultrasonikaatoritel nagu VialTweeter, UP200Ht, UP200St ja UP400St on integreeritud temperatuuri reguleerimine ja sisseehitatud SD-kaart automaatseks andmete salvestamiseks.
Mitme proovi kaudse, ristsaastumiseta ja samaaegse ultrahelitöötluse jaoks pakume VialTweeter või ultraheli CupHorn.
Allolev tabel annab teile ülevaate meie ultrasonikaatoritest proovide ettevalmistamiseks, rakkude katkestamiseks ja ekstraheerimiseks. Klõpsake seadme tüübil, et saada lisateavet iga ultraheli homogenisaatori kohta. Meie hästi koolitatud ja pikaajaliste kogemustega tehniline personal aitab teil hea meelega valida proovi ettevalmistamiseks kõige sobivama ultrasonikaatori!
| Partii maht | Voolukiirus | Soovitatavad seadmed |
|---|---|---|
| kuni 10 viaali või tuubi | mujal liigitamata | VialTweeter |
| mitmekihilised? mikrotiiterplaadid | mujal liigitamata | UIP400MTP |
| mitu toru? anumat | mujal liigitamata | kupael |
| 1 kuni 500 ml | 10 kuni 200 ml? min | UP100H |
| 10 kuni 1000 ml | 20 kuni 200 ml? min | UP200Ht, UP200St |
| 10 kuni 2000 ml | 20 kuni 400 ml? min | UP400St |
Sõltuvalt teie rakendusest, materjalist ja proovimahust soovitame teil proovi ettevalmistamiseks kõige sobivamat seadistust. Võtke meiega ühendust juba täna!
Võta meiega ühendust!? Küsi meilt!
Hielscheri digitaalsetel ultrasonikaatoritel on brauseri kaugjuhtimispult ja automaatne andmete protokollimine integreeritud SD-kaardil.
VialTweeter kaudse ultrahelitöötluse jaoks.
Faktid, mida tasub teada
proteoomika
Proteoomika on uurimisvaldkond, mis uurib valke ja proteoomi. Valgud täidavad organismides suure hulga elutähtsaid funktsioone. Proteoom on kogu valkude kogum, mida teatud aja jooksul väljendab genoom, rakk, kude või organism. Proteoom varieerub vastavalt ajale ja erinevatele nõuetele või rõhutab, et rakk või organism läbib. Täpsemalt öeldes on see ekspresseeritud valkude kogum teatud tüüpi rakkudes või organismides teatud ajahetkel kindlaksmääratud tingimustel. Termin on valkude ja genoomi segu. Proteoomika on proteoomi uurimine.
proteiin
Valgud on suured biomolekulid, nn makromolekulid – mis koosnevad ühest või mitmest pikast aminohappejääkide ahelast. Valgud esinevad kõigis nii taimset kui ka loomset päritolu organismides ja need on enamiku bioloogiliste funktsioonide jaoks üliolulised. Kuna valgud sisaldavad palju bioloogilist teavet, ekstraheeritakse neid analüütilisel eesmärgil, nt proteoomilisteks uuringuteks. Valkude kõige olulisem funktsioon hõlmab metaboolsete reaktsioonide katalüüsi, DNA replikatsiooni, reageerimist stiimulitele ja molekulide transportimist ühest kohast teise. Valgud erinevad üksteisest peamiselt aminohapete järjestuses, mis on tingitud nende geenide nukleotiidjärjestusest ja mille tulemuseks on tavaliselt valgu kokkuklapitamine spetsiifiliseks kolmemõõtmeliseks struktuuriks, mis määrab selle aktiivsuse. Valgud on – peale peptiidide – Üks toidu põhikomponente. Seetõttu on proteoomika toiduteaduses võimas vahend protsesside, toiduohutuse ja toiteväärtuse hindamise optimeerimiseks.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction on eelanalüütiline protseduur analüütide eraldamiseks ja eelkonspekteerimiseks. Koos ultraheliga saab pilvepunkti ekstraheerimist intensiivistada, muutes protsessi tõhusamaks, kiiremaks ja keskkonnasõbralikumaks. Ultraheliga on pilvepunkti ekstraheerimine oluliselt tõhusam meetod analüüdi ettevalmistamiseks. Loe lähemalt ultraheli abil pilvepunkti ekstraheerimise kohta!Geelelektroforees
Geelelektroforees on peamine meetod makromolekulide, nagu DNA, RNA ja valgud, samuti nende fragmentide eraldamiseks ja analüüsimiseks, lähtudes nende suurusest ja laengust. Seda kasutatakse kliinilises keemias valkude eraldamiseks laengu ja/või suuruse järgi (IEF agaroos, sisuliselt suurusest sõltumatu) ning biokeemias, molekulaarbioloogias ja proteoomikas, et eraldada DNA ja RNA fragmentide segapopulatsioon pikkuse järgi, hinnata DNA ja RNA fragmentide suurust või eraldada valke laengu järgi.
rakukultuurid
Rakukultuur on kontrollitud kasvuprotsess, mille käigus rakke kasvatatakse kontrollitud tingimustes. Rakukultuuri tingimused on iga rakutüübi puhul erinevad. Üldiselt koosneb rakukultuuri keskkond sobivast anumast (nt Petri tassist) koos substraadi või söötmega, mis varustab olulisi toitaineid (aminohapped, süsivesikud, vitamiinid, mineraalid), kasvufaktoreid, hormoone ja gaase (CO2, O2) ning reguleerib füüsikalis-keemilist keskkonda (pH puhver, osmootne rõhk, temperatuur). Enamik rakke vajab pinda või kunstlikku substraati, samas kui teisi rakukultuure saab kasvatada vabalt hõljuvat söötmes (suspensioonikultuur, rakususpensioon).
Loomsete rakuliinide massikultuure kasutatakse viirusvaktsiinide ja muude biotehnoloogiliselt saadud toodete tööstuslikuks tootmiseks. Inimese tüvirakke kultiveeritakse, et laiendada rakkude arvu ja diferentseerida rakud siirdamise eesmärgil erinevateks somaatilisteks rakutüüpideks.
Koeproovid
Termin "kude" kirjeldab rakulist vaheühendit, kus rakumaterjal on organisatoorsel tasandil rakkude ja tervikliku organi vahel. Kudedes on kokku pandud sarnased rakud, mis on pärit samast päritolust, mis koos täidavad spetsiifilist funktsiooni. Mitme koe funktsionaalse rühmitamisega moodustuvad elundite keerulised struktuurid.
Koeproove võetakse bioloogia, histoloogia/histopatoloogia, parasitoloogia, biokeemia, immunohistokeemia uurimiseks ning DNA kasvatamiseks ja eraldamiseks. Seda saab eristada loomade (alajaotus: imetajate kude) ja taime koe vahel. Loomsed koed on rühmitatud side-, lihas-, närvi- ja epiteelkoe neljaks põhitüübiks. Taimekuded jagunevad järgmisteks kolmeks koesüsteemiks: epidermis, jahvatatud kude ja vaskulaarne kude.
Koeproove võib valmistada loomsetest või taimsetest osadest, nt luudest, lihastest, lehtedest jne.
Kehavedelikud
Veri, seerum, plasma, tserebrospinaalvedelik, sülg ja sünoviaalvedelik on kehavedelikud, mis pakuvad suurepärast diagnostiliselt olulise teabe allikat. Seetõttu on oluline kehavedeliku proovide keerukas ettevalmistamine analüüsiks. Esimene raskus on seotud kehavedelikes sisalduvate komponentide laia dünaamilise valikuga.
Valgu kontsentratsiooni määramine
Bradfordi test, Lowry test ja bicinchoninic acid (BCA) test on tavalised analüüsid valkude kontsentratsiooni määramiseks. Veise seerumi albumiin (BSA) on üks kõige sagedamini kasutatavaid valgustandardeid.
lüüsi puhver
Lüüsipuhver tuleb valida vastavalt rakumaterjalile või -koele (koekultuur, taim, bakterid, seened jne) ning sellele, kas rakud on struktuuris ja struktuuri tüübile. Lai valik lüüsipuhvreid valkude, membraanide ja organellide ekstraheerimiseks valmistatakse ühe või mitme detergendiga. Pesuaine valitakse tavaliselt katse-eksituse katsete või – kui on olemas – vastavalt olemasolevale valgu ekstraheerimise protokollile. Pesuaine peab sobima koeallika ja valkudega. Üldiselt valitakse ekstrakti maksimaalse funktsionaalsuse säilitamiseks kõige leebem pesuvahend, mis töötab konkreetse koe? valgu jaoks. Lisaks hoiab membraanide ja organellide ekstraheerimise korral pehme pesuvahend membraani tervena. Tavaliselt kasutatavad pesuvahendid lüüsipuhvrites on enamasti mitteioonsed või zwitterionilised, nt CHAPS, deoksükolaat, Triton™ X-100, NP40 ja Tween 20.
Näiteks selliseid kudesid nagu aju, maks, soolestik, neerud, põrn jne saab lihtsalt puhverdada RIPA-ga – siiski tuleks lisada proteaasi inhibiitorid ja DTT (nt geelelektroforeesi korral).
Lüüsipuhver skeletilihaskoe jaoks (jääkülm): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glütserool, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitool, millele on lisatud proteaasi ja fosfataasi inhibiitorikokteili
Tabel tavaliste puhvrite ja nende pH vahemiku kohta. Üldiselt kasutatakse neid puhvreid tavaliselt kontsentratsioonides 20-50 mM.
| puhver | pH vahemik |
|---|---|
| Sidrunhappe – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Naatriumtsitraat – Sidrunhappe | 3.0 – 6.2 |
| Naatriumatsetaat – Äädikhape | 3.6 – 5.6 |
| Kakodüülhappe naatriumsool – Hcl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Naatriumdivesinikfosfaat – dinaatriumvesinikfosfaat | 5.8 – 8.0 |
| imidasool – Hcl | 6.2 – 7.8 |
| MOPID – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Trietanoolamiinvesinikkloriid – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – Hcl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Naatriumtetraboraat – boorhape | 7.6 – 9.2 |
| Bitsiin – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| Glütsiin – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Enamik puhvreid näitab pH-sõltuvust temperatuurist. See kehtib eriti Tris puhvrite kohta. PKa muutub 8,06-lt 25°C juures 8,85-le 0°C juures.
(Puhvri pH ja pKa: pH mõõdab vesinikioonide kontsentratsiooni vesilahuses. pKa (= happe dissotsiatsioonikonstant) on seotud, kuid spetsiifilisem mõõt, kuna see aitab ennustada, kuidas molekul toimib konkreetse pH väärtuse juures.)
TRIzol
TRIzol on keemiline lahus, mida kasutatakse RNA/DNA/valgu ekstraheerimiseks guanidiiniumtiotsüanaadi-fenool-kloroformi ekstraheerimisel. Ultraheli abil TRIzoli ekstraheerimise kasutamine toob kaasa sama proovi kõrge DNA, RNA ja valgu saagise ning ületab seeläbi teisi ekstraheerimismeetodeid.
Kirjandus? viited
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.