Hielscheri ultraheli tehnoloogia

Ultraheli proteiinide ekstraheerimine koe- ja rakukultuuridest

  • Valguekstraktsioon on oluline proteoomika proovide ettevalmistamise etapp.
  • Valke saab ekstraheerida taimsetest ja loomakudest, pärmidest ja mikroorganismidest.
  • Sonikatsioon on usaldusväärne ja efektiivne valkude ekstraheerimise meetod, mis annab lühikese ekstraheerimise ajal kõrge valgusisalduse.

 

Kudede ja rakkude valkude ekstraheerimine

Kudede ja kultiveeritud rakkude valkude ekstraheerimine on oluline proovi ettevalmistamise etapp, mis viiakse läbi paljude biokeemiliste ja analüütiliste meetodite, nagu ELISA, PAGE, Western blotting, massispektromeetria või valgu puhastamine. Ultraheli raku häired, lüüsi ja ekstraheerimine on täpselt kontrollitav tehnika, mis tagab valkude suure saagise.

Loomsetest kudest pärit proteiini ekstraheerimine

Kogu suurusega koe (nt neer, süda, kops, lihased jne) valmistamiseks tuleks koed jaotada väga väikestesse tükkidesse puhaste tööriistadega, jäädavalt jääl ja võimalikult kiiresti, et vältida degradeerumist proteaasidega (nt lüüsi puhver, nagu RIPA või hüpotooniline lüüsi puhver, mis sisaldab proteaasi ja fosfataasi inhibiitorikokteili). Pärast loksutamist pannakse proov prooviks külmutamiseks vedelasse lämmastikku. Proovi võib hiljem säilitada -80 ° C juures või hoida kohe homogeenimisel jääl. Vahetult enne ultraheli ekstraheerimist lisatakse proovi tuubule kiiresti külma lüüsi puhver (proteaasi inhibiitoritega DTT, leupeptiin ja aprotiniin) (soovitatavalt ~ 10 mg koe kohta on umbes 600 ui puhvrit). Ligikaudu Proovikorpuse kohta soovitatakse 20-60 mg kudet.
Ultraheli homogeniseerimine, lüüsimine ja ekstraheerimine viiakse läbi ultraheli homogenisaatoriga nagu Uf200 ः t või UP200St, mis on varustatud mikro-otsa sonotrodega. Sonikatsiooni kestus on 60-90 sekundit. ultraheli tsükli režiimis 15 sekundit. ultrahelitöötlus ja 10 sekundit puhkeaeg. Proovi tuleks pidevalt jääda.
Pärast ultraheli homogeenimist / ekstraheerimist tsentrifuugitakse lüsaati umbes 27 000 g juures. 20 min Seejärel kogutakse supernatant, nii et valgu kontsentratsiooni saab määrata valguanalüüsiga, nagu Pierce'i valgu analüüs BCA.

Valgu ultrahelitöötlus on oluline meetod proovide ettevalmistamiseks

Ultraheli valgu ekstraheerimine rakkudest UP200St

Infonõue




Pange tähele, et meie Privaatsuspoliitika.


Proteiini ekstraheerimine vere seerumist

Seerumi ja fosfaatpuhvri homogeense segu puhul viiakse proov enne ultraheli rakkude lüüsimist esmalt läbi. Ultraheli lüüsi puhul sonikeeritakse proov ultraheli labori homogenisaatoriga, näiteks UP100H 8 tsüklit 20% amplituudiga iga 5 sekundi vältel ja 15 sekundi vältel. Sonokatsioon viiakse läbi ultraheliuuringutega tsüklites ja asetatakse proov jääle nii, et proovi ülekuumenemist ja termilist lagunemist välditakse. Kuna seerum sisaldab suures koguses suure molekulmassiga valke (nagu albumiin, α1-antitrüpsiin, transferriin, haptoglobuliin, immunoglobuliin G ja immunoglobuliin A), mis takistavad madala molekulmassiga valkude eraldamist IEF-i ajal, on soovitatav neid lagundada seerumit kasutades ammendumisveerandit.

Valkude ekstraheerimine taimkudest

Värsket, pehmet taimekaudu, nt sambla jne, saab kergesti katkestada, lihtsalt pannes tükeldatud proovimaterjali lüüsipuhvris ultrahelitöötluseks. Karmid, viljakad taimekuded, nagu seemned, kuuskindlad vms, peaksid olema jahvatatud. Mõned kõvad puitunud taimsed materjalid tuleb enne ultraheliga töötlemist külmutada ja jahvatada vedelas lämmastikus. Taimede rakukultuuri suspensioonide puhul on piisav piisav ultraheliravim lüüsipuhvris 30 kuni 150 sekundit. Pingematerjal, näiteks kõrvitsaseemned, vajab intensiivsemat ultrahelitöötlust, nagu allpool kirjeldatud.

Kõrvitsaseemnete albumiini ultraheli ekstraheerimise protokoll

Ultraheli koe homogenisaator UP400St ja S24d40 - taimsete ja loomsete kudede valkude ekstraheerimiseks (Klõpsa suurendamiseks!)Ultrahelivalgust ekstraheerides albumiini peenestatud kõrvitsaseemne pulbrist 250 ml klaasist keeduklaasi lisatakse 10 g rasvata kõrvitsaseemne pulbrit ja 100 ml deioniseeritud vett lahustis. Valguekstraktsioon koosneb kahest etapist: esiteks valitakse proov sondi tüüpi ultraheligaatoriga UP400St (400W, 24 kHz) paigaldatud sonotrode S24d7. Klaasist keeduklaas pannakse ultraheli homogeniseerimise ajal külma veevanni. Ultrasonikaatori seadistamine UP400St kusjuures sisselülitatud temperatuuriandur tagab, et proovi temperatuur hoitakse alati temperatuuril alla 30 ° C. Täpse temperatuuri kontrollimisel ultrahelitöötluse ajal välditakse albumiini denaturatsiooni. Teiseks, ekstraheerimine viidi läbi segistiga kiirusega 200 pööret minutis ja 30 ° C juures. Seejärel viiakse keeduklaasi termostaadilisaatorisse. Globuliin eemaldatakse dialüüsiga destilleeritud veega. Pärast globuliini eemaldamist saab albumiini profiili määramiseks valguekstrakti proovi võtta ja seejärel kohandada selle väärtuseni pI = 3,0, kasutades albumiini koagulatsioonil 0,1 M HCl-i. Tahke faas eraldatakse tsentrifuugimise teel temperatuuril 5000 g, 20 ° C ja lahustatakse uuesti deioniseeritud vees. Albumiini koagulatsioon viiakse läbi kaks korda, et suurendada valgu suhet albumiini kontsentraadis.

Ultraheli leeliselise valgu ekstraheerimine riisikliidest valgu kontsentraadi valmistamiseks näitab, et ultraheliravi tagab suurema valgusisalduse märgatavalt lühema ekstraktsiooniaja jooksul – võrreldes tavaliste ekstraheerimismeetoditega.

Ultraheli seade VialTweeter valkude ekstraheerimiseks koeproovist (Klõpsa suurendamiseks!)

VialTweeter kaudne ultrahelitöötlus.

Eelised

  • kiire
  • suuremad saagised
  • väga tõhus
  • Parameetrite täpne kontroll
  • reprodutseeritavad tulemused
  • lineaarne mastaapsus

Proovide võtmise protokoll funktsionaalse iNOS ensüümi jaoks

Täisfunktsionaalse iNOS-ensüümi (nt ravimi sõeluuringu) saamiseks on soovitatav järgida järgmist protokolli: Rakusisusioon tuleb panna jääle ja sonikeerida koos UP100H 10 um amplituudil tsükli režiimis 5 sekundit. ultrahelitöötlus ja 25 sekundit jää jääl. Protseduuri tuleks korrata u. 3 korda. Taastumisaeg sonike tsüklite vahel vähendab temperatuuri tõusu ja vähendab seega denatureerimisriski.

Ultraheli proteiini lahustumine

Sonikatsioon võib kiirendada valgu lahustumist, mis tavaliselt nõuab mitu tundi. Proovi ülekuumenemise vältimiseks ja valgu lagunemise vältimiseks ja uurea sisaldavate lahuste modifitseerimisel ei tohiks ultraheli purunemised kesta kauem kui paar sekundit.

Üldised juhised

Temperatuuri kontroll: Et tagada kõrge valgusisalduse ilma termilise denatureerimiseta, tuleb ekstraheerimise ajal kontrollida temperatuuri. Hielscheri uusimad ultraheli homogenisaatorid – nimetatakse ka ultraheli desintegratoriks või sonificatoriks – on täpselt kontrollitavad. Nad on varustatud ühendatava temperatuurianduriga. Ultraheli homogenisaatori seadevalikus saab määrata maksimaalse temperatuuri. Kui see temperatuur max saavutab, lõpeb ultrasonikaator automaatselt, kuni proov on maha jahtunud.
Puhver: Sobiva puhvri ja õige puhvri mahu valik sõltub koest kudedesse ning seda tuleb uurida katsetuste ja vigade testimise teel.
Isolatsioon / puhastamine: Proteiini lüsaadid võivad sisaldada selliseid biomolekule nagu DNA või süsivesikud, mida võib eemaldada valgu sademetega (deoksükolaat-trikloroäädikhape) või puhverlahusega.

Chittapalo ja Noomhorm (2009) teatasid, et valgusisalduse suurenemine ultrahelitöötluse abil suureneb ning et ultraheli koe homogeniseerimine ja lüüsi protsess võib oluliselt parandada olemasolevaid ekstraheerimisprotsesse – uute kaubanduslike kaevandamisvõimaluste võimaldamine.

Helipakk Hielscheri heli korpus SPB-L ja ultraheli seade UP200St. (Klõpsa suurendamiseks!)

Ultraheli koe homogenisaator UP200St efektiivse valgu ekstraheerimise jaoks

Ultraheliravi täpne juhtimine (suurendamiseks klõpsake!)

Brauseri kontroll täpseks tööks ja ultrahelitöötluse protsessi jälgimiseks

Ultraheli seadmed valgu ekstraheerimiseks

Hielscher Ultrasonics pakub laias valikus ultraheli homogenisaatorid rakkude, kudede, bakterite, mikroorganismide, pärmi ja eoste lagunemist.
Hielscher lab ultrasonikaatorid on võimsad ja hõlpsasti kasutatavad. Ehitatud 24/7 tööks, on need konstrueeritud tugeva ja tõhusa labori ja pingilauadena. Kõigi seadmete puhul saab energiat ja amplituudi täpselt kontrollida. Lai valik lisandid avab täiendavaid seadistamisvalikuid. Digitaalsed seadmed nagu VialTweeter, Uf200 ः t, UP200St, ja UP400St integreeritud temperatuuri juhtimine ja sisseehitatud SD-kaart automaatseks andmete salvestamiseks.
Pakume kaudse ristsaastumisega mitteseotud proovide üheaegset ultrahelitöötlust VialTweeter või Ultraheli kastanahk.
Sõltuvalt teie taotlusest, materjalist ja proovi mahust soovitame prooviproovide jaoks kõige sobivamat seadistust. Võtke meiega ühendust täna!

Võta meiega ühendust! / Küsi meiega!

Palun kasutage allpool olevat vormi, kui soovite taotleda täiendavat teavet ultraheli homogeniseerimine. Meil on hea meel pakkuda teile ultraheli süsteemi istungil oma nõudeid.









Palun pange tähele, et meie Privaatsuspoliitika.


Kirjandus / viited

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): valgutundlikest riisikliidest valkude ja valgu kontsentraatide omaduste ultraheli abil leelisega ekstraheerimine. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simões, André ES :; Pereira, Diane M .; Amaral, Joana D .; Nunes, Ana F .; Gomes, Sofia E .; Rodrigues, Pedro M .; Noh, Adrian C .; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J .; Thibodeau, Stephen N .; Borralho, Pedro M .; Rodrigues, Cecília MP (2013): valkude efektiivne taastumine mitmest allikast võetud proovidest pärast trizooli või trisooli LS RNA ekstraheerimist ja pikaajalist säilitamist. BMC Genomics 2013, 14: 181.


Faktid Tasub teada

Proteoomika

Proteoomika on uurimisvaldkond, mis uurib valke ja proteomeeri. Valgud täidavad hulgaliselt elutähtsaid funktsioone organismides. Proteoom on kogu komplekt valke, mida teatud aja jooksul genoomi, rakke, kudesid või organisme väljendavad. Proteoom varieerub aja ja erinevate nõuetega või rõhutab, et rakk või organism läbib. Konkreetsemalt on antud teatud tüüpi rakus või organismis teatud aja jooksul määratletud tingimustel ekspresseeritud valkude kogum. Terminiks on valkude ja genoomi segu. Proteoomika on proteoomide uurimine.

Valk

Valgud on suured biomolekulid, nn makromolekulid – mis koosnevad ühest või enamast aminohappejääkide pikkast ahelast. Valgud esinevad kõigis taimsetes ja loomset päritolu organismides ning need on olulised enamiku bioloogiliste funktsioonide jaoks. Kuna valgud sisaldavad palju bioloogilist teavet, ekstraheeritakse need analüütiliseks otstarbeks, nt proteoomikate uurimiseks. Valkude kõige olulisem funktsioon hõlmab metaboolsete reaktsioonide katalüüsi, DNA replikatsiooni, reaktsiooni ärritajale ja molekulide transporti ühest kohast teise. Valgud erinevad üksteisest peamiselt nende aminohapete järjestuses, mis on dikteeritud nende geenide nukleotiidijärjestusega ja mis tavaliselt toob kaasa valkude kokkuvõtmise konkreetsele kolmemõõtmelisele struktuurile, mis määrab selle aktiivsuse. Valgud on – lisaks peptiididele – üks toidu põhikomponente. Seetõttu on proteoomika toidusteaduses võimas vahend protsesside optimeerimiseks, toiduohutuse ja toitumise hindamiseks.

Geeli elektroforees

Geeli elektroforees on makromolekulide nagu DNA, RNA ja valkude ning nende fragmentide eraldamise ja analüüsi peamine meetod nende suuruse ja laengu põhjal. Seda kasutatakse kliinilises keemias, et eraldada valgud maksas ja / või suuruses (IEF agaroos, sisuliselt sõltumatu suurusega) ning biokeemias, molekulaarbioloogias ja proteoomikas, et eraldada DNA ja RNA fragmentide segatud populatsioon pikkusega, et hinnata DNA suurust ja RNA fragmendid või eraldada valgud laenguga.

Rakukultuurid

Rakukultuur on kontrollitud kasvuprotsess, mille kaudu rakke kasvatatakse kontrollitud tingimustes. Rakukultuuri tingimused on iga rakutüübi jaoks erinevad. Üldiselt koosneb rakukultuuri keskkond sobivast anumast (nt Petri tassist) substraadist või söötmest, mis varustab olulisi toitaineid (aminohapped, süsivesikud, vitamiinid, mineraalid), kasvufaktorid, hormoonid ja gaasid (CO2, O.2) ja reguleerib füsikokeemilist keskkonda (pH puhver, osmootne rõhk, temperatuur). Enamikel rakkudel on vaja pinda või kunstlikku substraati, samal ajal kui muud rakukultuure saab kasvatada kultiveerimissöötmes, mis ujub vabalt (suspensioonikultuur, rakususpensioon).
Loomade rakuliinide massilisi kultuure kasutatakse viiruslike vaktsiinide ja muude biotehnoloogiliselt saadud toodete tööstuslikuks tootmiseks. Inimese tüvirakke kasvatatakse rakkude arvu suurendamiseks ja rakkude diferentseerimiseks erinevate somaatiliste rakutüüpide jaoks siirdamise eesmärgil.

Koeproovid

Termin koes kirjeldab rakulist vaheühendit, kus rakumaterjal on organisatsiooni tasandil rakkude ja täieliku elundi vahel. Kudesid koondatakse sarnased rakud, mis pärinevad samast päritolust ja mis täidavad spetsiifilist funktsiooni. Mitme koe funktsionaalse rühmituse järgi moodustuvad elundite kompleksstruktuurid.
Kude valitakse uuringuteks bioloogias, histoloogias / histopatoloogias, parasitoloogias, biokeemias, immunohistokeemias ning DNA kultiveerimisel ja eraldamisel. Seda saab eristada loomade (alarajoon: imetajate koe) ja taime kude vahel. Loomkuded on rühmitatud nelja lihase, lihase, närvisüsteemi ja epiteeli kude põhiliiki. Taimekoed jaotatakse kolmeks järgmisteks koesüsteemideks: epiderm, maapinna koe ja vaskulaarne koe.
Kudede proove saab valmistada loomsetest või taimeosadest, nt luust, lihastest, lehtedest jne

Kehavedelikud

Veri, seerum, plasma, tserebrospinaalvedelik, sülg ja sünoviaalvedelik on kehavedelikud, mis pakuvad suurepärast diagnostiliselt olulist teavet. Seetõttu on oluline analüüsida keha vedelate proovide ettevalmistamine analüüsimiseks. Esimene raskus on seotud keha vedelike komponentide laia dünaamilise vahemikuga.

Valgu kontsentratsiooni määramine

Bradfordi analüüs, Lowry test ja bitsinhoniinhappe (BCA) test on tavalised testid valkude kontsentratsiooni määramiseks. Veise seerumi albumiin (BSA) on üks kõige sagedamini kasutatavast valgu standardist.

Lüüsipuhver

Lüüsi puhver tuleb valida vastavalt rakumaterjalile või koele (koekultuur, taim, bakter, seened jne) ja kas rakud on struktuuris ja struktuuri tüübis. Valkude, membraanide ja organellide ekstraheerimiseks valitakse laia valikut lüüsipuhvreid ühe või mitme detergendiga. Detergent valitakse tavaliselt katseliselt ja vea testidena või – kui see on olemas – vastavalt olemasolevale valgu ekstraheerimise protokollile. Detergent peab ühilduma koeallikaga ja valkudega. Ekstrakti maksimaalse funktsionaalsuse säilitamiseks valitakse üldiselt kergem puhastusvahend, mis töötab spetsiifilise koe / valgu jaoks. Peale selle, membraanide ja organellide ekstraheerimise korral hoiab kerge pesuaine membraani puutumatuna. Tavaliselt kasutatavad pesuvahendid lüüsi puhvrites on enamasti mitteioonsed või tsvitterioonilised, näiteks CHAPS, deoksükolaat, Triton ™ X-100, NP40 ja Tween 20.
Näiteks võib kudesid, nagu aju, maksa, soolestikku, neerud, põrn jne, lihtsalt puhverdada RIPA-ga – tuleb siiski lisada proteaasi inhibiitorid ja DTT (nt geelelektroforeesi).
Lüüsi puhver skeletilihaste kudedes (jääkülm): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (mass / maht) glütserool, 1 mM EDTA , 1 mM ditiotreitooli, millele oli lisatud proteaasi ja fosfataasi inhibiitori kokteile
Tabel ühiste puhvrite ja nende pH-väärtuste kohta. Üldiselt kasutatakse neid puhvreid tavaliselt kontsentratsioonides 20-50 mM.

Puhver pH vahemik
Sidrunhape – NaOH 2.2 – 6.5
Naatriumtsitraat – Sidrunhape 3.0 – 6.2
Naatriumatsetaati – äädikhape 3.6 – 5.6
Cacodylic acid naatriumsool – HCl 5.0 – 7.4
MES – NaOH 5.6 – 6.8
Naatriumdivesinikfosfaat – dinaatriumvesinikfosfaat 5.8 – 8.0
Imidasool – HCl 6.2 – 7.8
MOPS – KOH 6.6 – 7.8
Trietanoolamiinvesinikkloriid – NaOH 6.8 – 8.8
Tris – HCl 7,0 – 9,0
HEPES – NaOH 7.2 – 8.2
Tricine – NaOH 7.6 – 8.6
Naatriumtetraboraat – boorhape 7.6 – 9.2
Bicine – NaOH 7.7 – 8.9
Glütsiin – NaOH 8.6 – 10.6

Enamik puhvreid näitavad pH sõltuvust temperatuurist. See kehtib eriti Tris puhvrite kohta. PKa muutub temperatuuril 0 ° C 8,06 juures temperatuuril 25 ° C kuni 8,85 ° C.
(puhverlahuse pH ja pKa: pH mõõdab vesinikuioonide kontsentratsiooni vesilahuses, pKa (= happe dissotsiatsiooni konstant) on seotud, kuid täpsem mõõde, kuna see aitab ennustada, kuidas molekul toimib spetsiifilises pH väärtus.)

TRIzol

TRIzol on keemiline lahus, mida kasutatakse RNA / DNA / valgu ekstraheerimiseks guanidiiniumtiotsüanaadi-fenool-kloroformi ekstraheerimise ajal. Ultrasoniseeritava TRIzoli ekstraheerimise kasutamine tagab sama proovi kõrge DNA, RNA ja valgu saagise ning muudab ekstra ekstrakti meetodid.