Ultraheli lüüs Western Blottingi jaoks

• Western blot on analüütiline protseduur spetsiifiliste valkude tuvastamiseks koehomogenaadi või rakuekstrakti proovis.
• Western blot'i käivitamiseks või ensüümi aktiivsuse mõõtmiseks vajavad paljud analüüsid juurdepääsu rakkudesse takerdunud materjalidele (nt valgud, DNA, subtsellulaarsed fragmendid).
• Sonikatsioon on usaldusväärne ja kergesti käsitsetav meetod rakkude kontrollitud katkestamiseks ja lüüsimiseks.

Ultraheli rakkude katkestamine

Valkude ekstraheerimine kudedest ja kultiveeritud rakkudest on esimene samm paljude bioloogiliste, biokeemiliste ja analüütiliste meetodite (PAGE, western blotting, ELISA, massispektromeetria jne) või valgu puhastamise jaoks. Kõrge valgusisalduse saavutamiseks tuleb rakumaterjal ja kude tõhusalt katkestada/ lüüsida. Kas taimerakk või loomne kude, ultrahelitöötlus on meetod raku lüsaadi valmistamiseks lihtne ja kiire.

Ultrahelitöötluse eelised

• Kiire & Tõhus
• Lihtne kasutada
• kõrge valgusisaldus
• reprodutseeritav/ korratav
• täpselt kontrollitud
• Skaalautuvia

Immunoprecipitation protokoll Western Immunoblottingu jaoks

A. Reaktiivid

Lahuste valmistamiseks kasutage puhastatud vett, näiteks Milli-Q.

• 1x fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahus (PBS)
• 1X rakulüüsi puhver: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM naatriumpürofosfaat, 1 mM β-glütserofosfaat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptiin
  Tähtis: lisage vahetult enne kasutamist 1 mM PMSF.
• 15 μl Valgu A + 15 μl Valgu G jaoks piisab IP-st, kuid see võib sõltuda teie esmasest antikehast ja proovi mahust. Võite kasutada ka eelnevalt segatud valku A/ G agaroosi (nt valk A küüliku IgG tõmbamiseks ja proteiin G hiire jaoks IgG allatõmbamiseks)
• 3X SDS proovipuhver: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 25 °C juures), 6% w/v SDS, 30% glütserool, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromofenoolsinine

B. Rakulüsaatide valmistamine

• Koristage rakud. Rakkude kogumiseks denatureerimata tingimustes eemaldage sööde ja loputage rakke üks kord jääkülma fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega.
• Eemaldatakse fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahus, lisatakse igale plaadile (10 cm) 0,5 ml jääkülma 1X-rakulist lüüsipuhvrit ja inkubeeritakse plaate jääl 5 minutit.
• Kraapige rakud plaatidelt maha ja viige mikrotsentrifuugiküvettidesse. Hoidke jääl.
• Sonikeerige kaks korda 10 sekundi jooksul jääkülmas immunoprecipitatsioonipuhvris (IP-puhver: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 ja proteaasi inhibiitorite segu). Ultrahelitöötluse jaoks on VialTweeter või sondi ultrasonikaator, näiteks UP100H või UP200Ht on kõige sobivamad.
• Lüsaate tsentrifuugitakse 15 000 g juures 10 minutit 4 °C juures.
• Supernatant viiakse üle uude katseklaasi. (Vajadusel võib lüsaati säilitada –80 °C juures.)
• Esmane antikeha lisatakse supernatandile. Primaarse antikehaga supernatanti inkubeeritakse kerges agitatsioonis 1 tund 4 °C juures. Primaarset antikeha lisatakse tavaliselt koguses, mis on 10x kontsentreeritum, kui seda kasutatakse western-blot-analüüsiks. (Võite alustada 1 μg-ga 100 μl kohta.)
• Seejärel inkubeeritakse supernatanti veel 1 tund võrdsetes kogustes proteiin A-agaroosi (Invitrogen) ja proteiin G agaroosi seguga.
• Agaroosigraanuleid pestakse kolm korda IP-puhvriga. Seejärel ekstraheerige seotud valgud SDS-PAGE laadimispuhvriga, kuumutades 95 °C juures 5 minutit.

C. Immunoprecipitation

• Võtke 200 μl rakulüsaati ja lisage primaarne antikeha. Inkubeeritakse õrnalt loksutades üleöö 4 °C juures.
• Lisage kas valk A või G agarooshelmed (20 μl 50% helmeste läga). Inkubeeritakse õrna loksutamisega 1–3 tundi temperatuuril 4 °C.
• Mikrotsentrifuugitakse 30 sekundit 4 °C juures. Pelletit pestakse viis korda 500 μl 1X rakulüüsipuhvriga. Pesemise ajal hoida jääl.
• Pellet suspendeeritakse uuesti 20 μl 3X SDS proovipuhvriga. Vortex, seejärel mikrotsentrifuug 30 sekundit.
• Kuumutada proovi 2–5 minutit temperatuurini 95–100 °C ja mikrotsentrifuugida 1 minut 14 000 x g juures.
• Proov (15–30 μl) asetatakse SDS-PAGE geelile (12–15%).
• Analüüsige proovi western-blot-meetodil.

Western Blot analüüs Sonicator UP50H-ga

Kriebisch jt (2011) uurimisel kasutati sondi tüüpi sonikaatorit UP50H kasutavat protokolli:
Üldvalk eraldati MC3T3-E1 rakkudest, mida töödeldi 1,25(OH) -ga₂D₃ (10⁻⁸ M) või sõiduk. Rakke lüüsiti puhvriga, mis sisaldas 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% naatriumdodetsüülsulfaat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) ja 0,5% naatriumdeoksükolaat (Merck). Raku lüsaati töödeldi 2 × 10 s tsüklis 1 ja amplituudiga 80 koos UP50H ultraheli protsessor (Hielscher, ultraheli tehnoloogia, Teltow, Saksamaa). Seejärel tsentrifuugiti materjali 10 minutit kiirusel 14 000 pööret minutis ja supernatanti kasutati western-blot-meetodil. Kakskümmend viis μg valku keedeti proovipuhvris ja redutseerijas (Invitrogen) ning eraldati seejärel SDS-PAGE'iga, kasutades 4–12% polüakrüülamiidi geele (Invitrogen) ja kanti nitrotselluloosmembraani (GE tervishoid). Membraan blokeeriti 1 tunniks TBS-iga (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl), mis sisaldas 1% kaseiini (Sigma-Aldrich) ja 1% Tris (1 M). Pärast blokeerimist inkubeeriti membraani kerge segamisega üleöö 4 °C juures primaarse antikehaga (küüliku inimesevastane CBS 1/500, välja töötatud prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA laboris). Inkubeerimine mädarõika peroksidaasi (HPR) konjugeeritud sekundaarse antikehaga (Dako) viidi läbi 1 tund toatemperatuuril. Kõik blotid töötati välja täiustatud kemoluminestsentsi (Perkin Elmer) abil.
 

Klõpsake siin, et lugeda lisateavet ultraheli rakkude lüüsi ja ekstraheerimise parimate tavade kohta, lüsaadi ettevalmistamine ja soovitused protsessi täiustamiseks!
 
Allolev tabel annab teile ülevaate meie laborisuuruse ultrasonikaatorite ligikaudsest töötlemisvõimsusest:

Kirjandus? Viited