Ultraheli Lüüs Western blotting

• Western blot on analüütiline meetod spetsiifiliste valkude avastamiseks koehomogenaadi või rakuekstrakti proovis.
• Western blot'i käitamiseks või ensüümi aktiivsuse mõõtmiseks on paljudel testidel vaja juurdepääsu rakkudega ümbritsetud materjalidele (nt valgud, DNA, rakusisemad fragmendid).
• Sonikatsioon on usaldusväärne ja kergesti käsitsetav meetod kontrollitud rakkude häirete ja lüüsi jaoks.

Ultraheli raku häired

Kudede ja kultiveeritud rakkude proteiini ekstraheerimine on esimene samm paljude bioloogiliste, biokeemiliste ja analüütiliste meetodite (PAGE, Western blot, ELISA, mass-spektromeetria jne) või valkude puhastamiseks. Kõrge valgusisalduse saamiseks tuleb rakumaterjal ja -kud tõhusalt häirida / lüüsida. Kas taime- või loomset kude, ultrahelitöötlus on meetod rakulüsaadi valmistamiseks lihtne ja kiire.

Sonika eelised

• Kiire & efektiivne
• lihtne operatsioon
• kõrge valgusisaldus
• korratav / korratav
• täpselt kontrollitud
• skaleeritav

Immunosastumisprotokoll lääne immunoblottimise jaoks

A. Reaktiivid

Lahuste valmistamiseks kasutage puhastatud vett nagu Milli-Q.

• 1X fosfaatpuhverdatud soolalahus (PBS)
• 1X rakkude lüüsi puhver: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM naatriumpürofosfaat, 1 mM P-glütserofosfaat, 1 mM Na3VO4, 1 ug / ml leupeptiini
  Tähtis: lisage 1 mM PMSF vahetult enne kasutamist.
• 15 μl proteiin A + 15 μl IP-i jaoks piisab proteiin G, kuid see võib sõltuda teie primaarse antikeha ja proovi mahust. Võite kasutada ka eelnevalt segatud valgu A / G-agaroosi (nt küüliku IgG-d kärpida valku A ja hiire IgG-d valku G)
• 3x SDS proovipuhver: 187,5 mM Tris-HCI (pH 6,8 25 ° C juures), 6% (mass / maht) SDS, 30% glütserool, 150 mM DTT, 0,03% (mass / maht) bromofenooli sinine

B. Rakulüsaatide valmistamine

• Koguge rakud. Laadimata rakke mittenatuudistustingimustes, eemaldage söötmed ja loputage rakke üks kord jääkülma PBS-ga.
• Eemaldage PBS ja lisage igale plaadile (10 cm) 0,5 ml jääkülma 1X raku lüüsi puhverlahust ja inkubeerige plaate jääl 5 minutit.
• Tõmmake rakud plaatidele välja ja suunake mikrotsentrifuugi tuubidesse. Hoia jää.
• Segage kaks korda 10 sekundit jääkülma immunosadestamise puhvris (IP puhver: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 ja proteaasi inhibiitori segu). Ultraheli puhul kasutage VialTweeter või sondi ultrasonikaator nagu UP100H või Uf200 ः t on kõige sobivamad.
• Tsentrifuugige lüsaate 15 000 g juures 10 minutit temperatuuril 4 ° C.
• Supernatant viiakse uude torusse. (Vajadusel võib lüsaati säilitada -80 ° C juures.)
• Lisage supernatandile primaarne antikeha. Primaarse antikeha supernatanti inkubeeritakse kerge segamisega 1 tund temperatuuril 4 ° C. Primaarset antikeha lisatakse tüüpiliselt koguses, mis on 10 korda kontsentreeritum, kui seda kasutatakse western blot analüüsiks. (Võite alustada 1 ug 100 ui kohta.)
• Supernatanti inkubeeritakse seejärel veel ühe tunni jooksul võrdse koguse proteiin A-agaroosi (Invitrogen) ja proteiini G agaroosi seguga.
• Agaroosi pelleid pesta kolm korda IP-puhvriga. Seejärel ekstraheerige seotud valgud SDS-PAGE laadimispuhvriga, kuumutades seda 95 ° C juures 5 minutit.

C. Immunopretsipitatsioon

• Võtke 200 μl rakulüsaati ja lisage primaarne antikeha. Inkubeerige õrnalt raputades öö jooksul 4 ° C juures.
• Lisage kas proteiini A või G agarooshelmed (20 ui 50% helmeste suspensiooni). Inkubeerige õrnalt kiiget 1-3 tundi temperatuuril 4 ° C.
• Mikrotsentrifuug 30 sekundit 4 ° C juures. Bakterit pesta 5 korda 500 μl 1x rakkude lüüsi puhvriga. Peske pesemisel jääl.
• Resuspendeerige pellet 20 μl 3x SDS proovipuhvriga. Vortex, seejärel mikrotsentrifuugi 30 sekundit.
• Kuumutage proovi temperatuuril 95-100 ° C 2-5 minutit ja mikrotsentrifuugi 1 minut 14 000 X g juures.
• Proov (15-30 ui) pannakse SDS-PAGE geelile (12-15%).
• Analüüsige proovi Western blotting abil.

Western blot analüüs ultraheligaatoriga UP50H

Kriebischi jt uurimisel kasutati järgnevat protokolli. (2011):
Kogu valk eraldati MC3T3-E1 rakkudest, mida töödeldi 1,25 (OH)₂D₃ (10^-8 M) või sõiduk. Rakud lüüsiti puhvriga, mis sisaldas 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% naatriumdodetsüülsulfaat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) ja 0,5% naatriumdeoksükolaat (Merck). Rakulüsaati töödeldi ultraheliga 2 x 10 s tsükli 1 ja amplituudiga 80 koos UP50H ultraheli protsessor (Hielscher, ultraheli tehnoloogia, Teltow, Saksamaa). Seejärel tsentrifuugiti materjali 10 min kiirusel 14 000 pööret minutis ja supernatanti kasutati western blottimise jaoks. 25 mikrogrammi valku keedeti proovipuhvris ja redutseerivas (Invitrogen) ja seejärel lahutati SDS-PAGE abil, kasutades 4-12% polüakrüülamiidgeeli (Invitrogen) ja viidi nitrotselluloosmembraanile (GE tervishoiuteenus). Membraan blokeeriti 1 tund TBS-iga (10 mM Tris-HCI, pH 7,6; 150 mM NaCl), mis sisaldas 1% kaseiini (Sigma-Aldrich) ja 1% Tris (1 M). Pärast blokeerimist inkubeeriti membraani vähese segamisega 4 ° C juures esmase antikehaga (küülik inimesevastane CBS 1/500, mis töötati välja prof. R. Banerjee laboris, Ann Arbor, MI, USA). Inkubeerimine mädarõika peroksüdaasi (HPR) konjugeeritud sekundaarse antikehaga (Dako) viidi läbi 1 tund toatemperatuuril. Kõik blottid töötati välja täiustatud kemiluminestsentsiga (Perkin Elmer).

Kirjandus/viited