Ultraheli lüüs western blot-analüüsiks

• Western blot on analüütiline meetod konkreetsete valkude tuvastamiseks koehomogenaadi või rakuekstrakti proovis.
• Western blot’i tegemiseks või ensüümi aktiivsuse mõõtmiseks vajavad paljud analüüsid juurdepääsu rakku suletud materjalidele (nt valgud, DNA, subtsellulaarsed fragmendid).
• Sonikeerimine on usaldusväärne ja lihtsalt käsitsetav meetod rakkude kontrollitud lõhkumiseks ja lüüsiks.

Rakkude lõhkumine ultraheliga

Valkude ekstraheerimine kudedest ja kultiveeritud rakkudest on paljude bioloogiliste, biokeemiliste ja analüütiliste meetodite (PAGE, western blot, ELISA, massispektromeetria jne) või valkude puhastamise esimene samm. Suure valgusaagise saamiseks tuleb rakumaterjal ja kude tõhusalt lõhkuda/ lüüsida. Olgu tegemist taimerakkude või loomse koega, sonikeerimine on meetod, millega saab rakulüsaadi valmistada lihtsalt ja kiiresti.

Sonikeerimise eelised

• kiire ja tõhus
• lihtne kasutada
• suur valgusaagis
• reprodutseeritav/ korratav
• täpselt kontrollitav
• skaleeritav

Immunosadestamise protokoll western immunoblot’i jaoks

A. Reagendid

Lahuste valmistamiseks kasutage puhastatud vett, näiteks Milli-Q vett.

• 1X fosfaatpuhverdatud soolalahus (PBS)
• 1X rakkude lüüsipuhver: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM naatriumpürofosfaat, 1 mM β-glütserofosfaat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptiin
  Tähtis: lisage 1 mM PMSF vahetult enne kasutamist.
• 15 μl valku A + 15 μl valku G on IP jaoks piisav, kuid see võib sõltuda teie primaarsest antikehast ja proovi mahust. Võite kasutada ka eelsegatud valk A/ G agaroosi (nt valk A jänese IgG väljasadestamiseks (pull-down) ja valk G hiire IgG väljasadestamiseks (pull-down))
• 3X SDS-proovipuhver: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 temperatuuril 25°C), 6% w/v SDS, 30% glütserool, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromofenoolsinine

B. Rakulüsaatide valmistamine

• Koguge rakud. Rakkude kogumiseks mittedenatureerivates tingimustes eemaldage sööde ja loputage rakke üks kord jääkülma PBS-iga.
• Eemaldage PBS ja lisage igale plaadile (10 cm) 0,5 ml jääkülma 1X rakkude lüüsipuhvrit ning inkubeerige plaate jääl 5 minutit.
• Kraapige rakud plaatidelt maha ja kandke need mikrotsentrifuugitorudesse. Hoidke jääl.
• Sonikeerige kaks korda 10 sekundit jääkülmas immunosadestamise puhvris (IP-puhver: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 ja proteaasi inhibiitorite segu). Sonikeerimiseks VialTweeter või sondtüüpi ultrahelisonikaator, näiteks UP100H või UP200Ht sobivad kõige paremini.
• Tsentrifuugige lüsaate 15 000 g juures 10 minutit temperatuuril 4°C.
• Kandke supernatant uude tuubi. (Vajaduse korral võib lüsaati säilitada temperatuuril –80°C.)
• Lisage supernatandile primaarne antikeha. Primaarse antikehaga supernatanti inkubeeritakse 1 h temperatuuril 4°C kerge segamise all. Primaarset antikeha lisatakse tavaliselt koguses, mis on 10x kontsentreeritum kui western blot’i puhul kasutatav. (Alustada võite 1μg 100μL kohta.)
• Seejärel inkubeeritakse supernatanti edasi võrdsete koguste valk A-agaroosi (Invitrogen) ja valk G agaroosi seguga veel 1 h.
• Pesege agaroosi sademeid kolm korda IP-puhvriga. Seejärel ekstraheerige seondunud valgud SDS-PAGE laadimispuhvriga, kuumutades 5 minutit temperatuuril 95°C.

C. Immunosadestamine

• Võtke 200 μl rakulüsaati ja lisage primaarne antikeha. Inkubeerige õrnalt õõtsutades üleöö temperatuuril 4°C.
• Lisage kas valk A või G agaroosi helmeid (20 μl 50% helmesuspensiooni). Inkubeerige õrnalt õõtsutades 1–3 tundi temperatuuril 4°C.
• Tsentrifuugige mikrotsentrifuugis 30 sekundit temperatuuril 4°C. Peske sadet viis korda 500 µl 1X rakkude lüüsipuhvriga. Hoidke pesemise ajal jääl.
• Suspendeerige sade uuesti 20 μl 3X SDS-proovipuhvris. Segage vortexil, seejärel tsentrifuugige mikrotsentrifuugis 30 sekundit.
• Kuumutage proovi 2–5 minutit temperatuuril 95–100°C ja tsentrifuugige mikrotsentrifuugis 1 minut kiirusel 14 000 X g.
• Kandke proov (15–30 μl) SDS-PAGE geelile (12–15%).
• Analüüsige proovi western blot’iga.

Western blot-analüüs sonikaatoriga UP50H

Järgnevat protokolli, milles kasutati sondtüüpi sonikaatorit UP50H, rakendati Kriebisch et al. (2011) uuringus:
Kogu valk eraldati MC3T3-E1 rakkudest, mida oli töödeldud 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) või kandjaainega. Rakud lüüsiti puhvriga, mis sisaldas 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% naatriumdodetsüülsulfaat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) ja 0,5% naatriumdeoksükolaat (Merck). Rakulüsaati sonikeeriti 2 × 10 s tsüklil 1 ja amplituudil 80 seadmega UP50H ultraheliprotsessor (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Saksamaa). Seejärel tsentrifuugiti materjali 10 min kiirusel 14 000 rpm ja supernatanti kasutati western blot’iks. Kakskümmend viis μg valku keedeti proovipuhvris ja redutseerivas aines (Invitrogen) ning eraldati seejärel SDS-PAGE abil, kasutades 4–12% polüakrüülamiidgeele (Invitrogen), ja kanti nitrotselluloosmembraanile (GE health care). Membraani blokeeriti 1 h TBS-iga (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl), mis sisaldas 1% kaseiini (Sigma-Aldrich) ja 1% Tris’i (1 M). Pärast blokeerimist inkubeeriti membraani kerge segamise all üleöö temperatuuril 4°C primaarse antikehaga (jänese anti-inimese CBS 1/500, välja töötatud prof R. Banerjee laboris, Ann Arbor, MI, USA). Inkubeerimine mädarõika peroksidaasiga (HPR) konjugeeritud sekundaarse antikehaga (Dako) viidi läbi 1 h toatemperatuuril. Kõik blotid visualiseeriti tõhustatud kemoluminestsentsi abil (Perkin Elmer).

Klõpsake siin, et lugeda lähemalt ultraheliga rakkude lüüsi ja ekstraheerimise, lüsaadi ettevalmistamise parimate tavade ning protsessi täiustamise soovituste kohta!

Alljärgnev tabel annab ülevaate meie laborimõõtmeliste ultrahelisonikaatorite ligikaudsest töötlusvõimsusest:

Kirjandus / viited

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.