C. elegans, nematode uss, on laialdaselt kasutatav mudel organismi bioloogia. Proovi ettevalmistamine enne analüüsi nõuab lüüsi, valgu ja lipiidide ekstraheerimist, samuti RNA killustumist, mida saab usaldusväärselt ultrahelitöötluse abil teha. Ultraheli rakkude katkendid on usaldusväärsed, keerukad ja kergesti kasutatavad seadmed C. elegansi proovide kiireks ettevalmistamiseks.

C. Elegansi proovide ultraheli ettevalmistamine

C. elegans on ümarussid, mida kasutatakse laialdaselt teaduslaborites genoomika, arengubioloogia ja haiguste uurimiseks. Paljudel geenidel C. elegans genoomis on inimestel funktsionaalsed vasted. Seeläbi nematoodi uss on väga kasulik mudel inimeste haiguste. C. elegans'i laialdase kasutamise muud eelised on selle lihtne ja odav kasvatamine baktereid (nt E. coli) sisaldavatel plaatidel, selle läbipaistvus, mugav käitlemine ning võimalus usse pikemaa ja pikema aja jooksul külmutada ja ladustada.
Valgu- ja lipiidideanalüüs on laborites regulaarsed protseduurid ja ultraheli proovi ettevalmistamine on kehtestatud meetod C. elegans nematoodide lüssimiseks igas arenguetapis (st embrüod, vastsed L1-L4, täiskasvanud). Kuna C. elegans kasutatakse ka valgu ekspressiooni süsteemi üle-express suunatud valgud, usaldusväärne, reprodutseeritav lüüsi ja valgu ekstraheerimise meetod, mis annab kõrge valgusisaldusega, on vaja. Ultraheli rakkude katkemist ja ekstraheerimise süsteeme on saadaval sondi-tüüpi homogenisaatoritena ja mitmeprooviliste ultrasonicatoritena. Toitlustamine mugava proovi ettevalmistamisele ja igasugustele proovi suurustele numbritele, Hielscher Ultrasonics on ideaalne ultraheli rakkude katkendlik teie laboriprotseduuri jaoks.

Ultraheli protokollid C. Elegans häireid ja lüüsi

C. elegans'i ultraheli homogeniseerimist ja lüüsi ning sellele järgnevat valgu ja lipiidide ekstraheerimist saab teha erinevate protseduuridega, kasutades erinevaid homogeniseerimise ja lüüsipuhvriid jne. Kõik lüüsiprotokollid on ühised, et proove tuleb valgu degradeerumise vältimiseks pidevalt jääs hoida. Allpool tutvustame teile usaldusväärseid ja kiireid ultraheli lüüsi- ja ekstraheerimisprotokolle kvaliteetse valgu- või lipiidisisaldavate Proovide ettevalmistamiseks.

Ultraheli C. elegans lüüsi eelised

• usaldusväärne
• Taasesitatav
• täpselt reguleeritava temperatuuriga
• usaldusväärne protsessi kontroll
• õrn meetod
• lihtne kohaldada
• ohutu

Ultraheli valgu ekstraheerimine C. elegansi proovidest

C. elegansusside ultraheli lüüsi ja valgu ekstraheerimist saab teha erinevate protokollidega. Allpool tutvustame teile mõningaid usaldusväärseid ja kiireid lüüsiprotokolle reprodutseeritavate valguekstraheerimise tulemuste jaoks.

Tsütosoliiekstrakti kiire preparatatsioon C. elegans Ussidest ultrahelitöötluse abil

Järgmise protokolliga saate c. elegans lüsaadid ette valmistada vähem kui 30 minutiga.
C. elegans'i kogu
Valige soovitud C. elegansussid 1,5 ml fosfaatpuhverdatud soolalahusesse (PBS) või peske neid plaadilt 1,5 ml Fosfaatpuhvrilisandiga. Tsentrifuugitakse 1min juures 2000 rpm kuni graanuliteni. Hoidke proovid kogu aeg jääl.
Seejärel peske usse kaks korda PBS-iga.
Pärast seda peske usse kaks korda ddH₂O.
Usse resuspendeeritakse vähemalt 500 ul homogenisatsioonipuhvris (HB). Ussproovid on nüüd ultraheli lüüsiks valmis.
Kõrgema valguekstrakti kvaliteedi tagamiseks võite vähendada bakteriaalset saastumist, pestes ussse 5 minutit pbs-is ja steriilses, ülipuhtas vees (ddH₂O) või teha sahharoosi hõljumist. Hoidke ussproovid pidevalt jääl.

Ultraheli C. elegans lüüsi protokoll

• Veenduge, et valmistate ultraheliaatori ette nii, et ultraheli homogenisaator on kasutamiseks valmis (sondi paigaldatud, ultrahelitöötlusprogrammi eelseadistatud).

Kui teie ultrasonicator on stand-paigaldatud, asetage jäävann oma proovi torudega ultraheli sondi alla ja sisestage ultraheli sond 1.5ml torusse.

• C. elegans'i lüüsi ks UP200St või UP200Ht-ga tuleks ultraheliteha mikrootsaga (nt 2mm sond S26d2; vt pilt vasakul) 40% amplituudiga 1sek-i jaoks 30sec pausidega vahepeal. 5 ultrahelitöötlus tsüklit iga 1 sekundi 30sec pausid on ideaalne C. elegans lüüsi. Kui teete lüüsi esimest korda, saate kontrollida lüüsi progresseerumist proovi väikestes alikvootides pärast iga pulsi mikroskoobi abil.
• Kui ussid on häiritud, lõpetatakse lüüs edukalt. Üleultrahelitöötlus põhjustab tuumade purunemist ja muutub nähtavaks, kui proov muutub viskoosseteks või vahtudeks. Proovi lagunemise vältimiseks kasutage vajaduse korral rohkem impulsse. Ärge suurendage iga ultraheli impulsitsükli aega, et saada kvaliteetseid valguekstrakte.
• Puhastage raku lüsaat, tsentrifuugides ultraheliga lüpstetud ussid 14 000 rpm 10minuti eest 4ºC juures.
• Seejärel viige supernatant värskesse torusse ja valmistuge immunosadestamiseks või muudeks testideks.

Märkus homogenisatsioonipuhvri kohta: Valmistada homogenisatsioonipuhver ultraheli lüüsi protokolli jaoks ette järgmiselt:

C. elegans'i suure läbilaskevõimega lüüs 96-süvendi plaatidel, kasutades UIP400MTP plaadi sonikaatorit

C. elegans Lysis (täiskasvanud nematoodid)
UIP400MTP 80% amplituud, 20 tsüklit (iga ultrahelitöötlustsükkel: 30 sek ON, 30 sek OFF)
Lüüsi puhver:

• 1. võimalus) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• 2. võimalus) ko-immunoprecipitatsiooni (co-IP) jaoks: 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5% NP-40 (täielik proteinaasi inhibiitorikokteil)

Suure läbilaskevõimega DNA killustumine
C. elegans (täiskasvanud nematoodid) DNA 200-300bp: UIP400MTP plaadi sonikaator – seadistage 80% amplituud, 30pulses – iga 30sek sisse, 30sek välja

UIP400MTP Plate Sonicator suure läbilaskevõimega proovi ettevalmistamiseks sonikeerib proovid ühtlaselt mitme süvendi, mikrotiiterplaatidel ja 96-augulistel plaatidel

C. elegans'i ultraheli lüüs kvantitatiivse afiinsuse puhastamise testide jaoks

C. elegans embrüod (€2 miljonit replicate) olid värskelt koristatud bioloogilise kolmerattaliselt pleegitamine noorte gravid hermafrodiidide ja sonicated jääl (tsükkel: 0,5 s, amplituud: 40-45%, 5 lööki / istungil, 5 istungid, intervall istungid: 30 s; UP200S ultraheli protsessor mikrootsaga S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) lüüsipuhvris (kogumaht: 600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7.4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glütserool, proteaasi inhibiitori segu, 0,1% Nonidet P-40 asendaja). Pärast ultrahelitöötlust lisati Nonidet P-40 asendajakuni 1% ja lüsaate inkubeeriti peaga saba pöörlemise kohal 4 °C juures 30 minutit, millele järgnes tsentrifuugimine 20 000 × g juures 20 minutit 4 °C juures. Puhastatud lüsaat aspireeritud, häirimata seejuures lipiidi ülaosa kihti, ja gaas pooleks kas anti-GFP agaroosi helmedeks või blokeeritud kontrollhelmedeks (40–50 μl). Pärast pea pöörlemist 4°C juures 60–90 min, helmed pesti üks kord lüüsipuhvriga, mis sisaldas 0,1% Nonidet P-40 asendajat, millele järgnes kaks korda pesemist kummaski Puhvris I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) või ii puhvriga (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) või mõlemaga. GFP:MBK-2 allatõmbed, kaks eraldi katset viidi läbi erinevate pesemistingimustega. Valke elueeriti orbitaalse loksutamise teel toatemperatuuril 50 μl 6 m uureat/2 M tiourea kohta. MBK-1:GFP allatõmbekatsete puhul elueeriti valke kaks korda, loksutades 50 μl 8 m guanidiinkloriidi temperatuuril 90 °C, millele järgnes etanooli sadestamine. Elueeritud proteiiniproovid seedisid seedimist lahuses.
(vt Chen et al., 2016)

Ultraheli usside homogeniseerimine ja lüüsimine

C.elegans'i lüüsi ja valgu ekstraheerimise protseduuri puhul koguti 30 000 vastava etapi nemotodest proovi kohta ja pestakse jääkülmas S-basaal, kontsentreeritud tsentrifuugimise teel 1500 pööret minutis 2 minutit, pestakse kuus korda jääkülma S-basaaliga, et eemaldada jääkbaktereid, ja seejärel hoiti jääs kuni kasutusvalmis. Valgu ekstraheerimiseks lubati gravidiga täiskasvanud ussidel moodustuda kompaktne graanulid pärast viimast S-basaalpesu. Seejärel suspendeeriti ussgraanulid uuesti 1 ml jääkülma ekstraheerimispuhvrisse [20 mM kaaliumfosfaat, pH 7.4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, proteaasi inhibiitorid (Sigma P2714)] ja töödeldi kohe.
30 000 gravidiga täiskasvanud ussid (mis vastavad 100 mg märjale kaalule) sonikeeritijääl, kasutades sonditüüpi ultrasonicator (nt UP50H mikrotip MS2) juures 40% amplituudi 10 tsüklit 3 sek, 30 sek välja, 1 ml jääkülma ekstraheerimispuhvris. (vt Baskharan et al. 2012)

Ultraheli lipiidide ekstraheerimine C. elegans'ist

Lipidomikas, metaboloomika oks, iseloomustab ja analüüsitakse bioloogiliste süsteemide lipiidide täiendust. C. elegans kasutatakse laialdaselt lipidomics uurida koostoimemetaboolsete lipiidide ja nende mõju tervisele ja eluiga.
Ultraheli lüüsi ja ekstraheerimist kasutatakse lipiidide, näiteks C. elegans'i embrüote, vastsete ja täiskasvanud usside sfinkside vabastamiseks. Ultraheli kasutatakse uss homogenatide ettevalmistamiseks ja seejärel lipiidide proovist eraldamiseks.
Protokoll ultraheli lipiidide ekstraheerimiseks C. elegans'ist
Sulatage C. elegans'i pellet jääl ja suspendeeritakse uuesti 0,5 ml ultraveega. 
C. elegans'i proovid sonikeeritakse 1,5 ml katseklaasides, hoides proovid pidevalt jääl.
Sonikatsiooni saab teha sond-ultrasonicstoriga, nagu Uf200 ः t, ultraheli proovi ettevalmistamise seade VialTweeter (10 proovi samaaegne ultrahelitöötlus) või Led, mida sa ei pea booking.com-i külastajaid vastu (mitme auguga plaatide ultrahelitöötluseks, näiteks 96-auguga plaadid). Ultraheli lüüsiks UP200Ht-ga kasutage mikro-otsa S26d2. Eelseadistage ultraheli tsükli režiim digitaalmenüüs. Määrake amplituud i 10% ja ultrahelitöötlustsükli režiim 2 sekundit 20 tsüklite impulsside vahel, mille paus on 30 sek. iga ultraheli pulsatsioonipursi vahel.
Viige supernatandid kruvikorgiga klaastorudesse. 
Folchi ekstraheerimine tehakse, lisades igale klaastorule 1 ml ultravett, lisades sellele 6 ml kloroformi/metanooli segu (suhe = 2:1).
Vortex iga klaastoru 30 sek 4 korda. 
Katseklaase tsentrifuugitakse 1,258 x g juures 15 minutit (Eppendorf, 5810 R), et veelgi suurendada faaside eraldamist. 
Alumine hüdrofoobne fraktsioon viiakse puhtasse klaastorusse pastörimisi pipetiga. 
Alumine hüdrofoobne fraktsioon kuivatatakse lämmastikuvoolu all lämmastikuaurustis. 
Kuivatatud graanulit hoida kuni kasutamiseni sügavkülmas -80 °C.

Usside lüsate ultraheli ettevalmistamine

Usslüsaad: L4-astmeusse kosse koguti ja pestakse kolm korda M9 puhvriga (42,26 mM Na₂HPO₄, 22.04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl ja 0,87 mM MgSO₄), et eemaldada kõik bakterid. Pärast M9 puhvri eemaldamist nii palju kui võimalik ussid suspendeeriti lüüsipuhvris: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM fosfaat β-glütserool, 0,1% (v/v) Triton X- 100, 50 mM naatriumfluoriid, 1 mM naatriumortovanaat, 5 mM naatriumpürosfaadi, 0,2 mM fenüülsulfonüülfluoriidi ja proteaasi inhibiitori. Ussid külmutati vedelas lämmastikus ja sulatati 37 °C juures kolm korda, siis ussid sonikeeriti kuivajääga ultraheliVialTweeter üksusega 10 proovitorude samaaegseks ettevalmistamiseks. Sonikatsioon viidi läbi 50% amplituudiga 10 tsüklis 2 sek. Seejärel tsentrifuugiti proovid 12000 pööret minutis 4°C juures 15 minutit. Supernatant koguti ja säilitati temperatuuril -70 °C. Bradfordi analüüsis kasutati valgu kvantifitseerimiseks alikvooti.
Glutatiooni üldsisalduse, GSH ja GSSG määramine: glutatiooni sisalduse määramiseks määrati lüsaadid ja määramine samal päeval. Glükoostoidetud ja kontrollL4 vastsed olid koristatud ja pestud M9 puhver kolm korda. Pärast M9 puhvri eemaldamist resuspendeeriti ussid jääkülmas metafosforhappes (5% w / v), siis ussid sonicated jääs ultraheliga VialTweeter 50% amplituudiga 10 ultrahelitöötlustsüklites 2 sek. Seejärel tsentrifuugitakse 12000 pööret minutis temperatuuril 4 °C 15 min.
(vt Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans Proovi Prep enne Immunosadestamine ja Lääne Blotting

Lühidalt öeldes kasvatati C. elegans L1 vastseid embrüonaalsete ekstraktide puhul suuremahulistes vedelates S-keskmisetes kultuurides täiskasvanueaks. Embrüod koguti standardse valgendimeetodiga ja suspendeeriti lüüsipuhvris (50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glütserool, 0.05% NP-40, 1􏰅 Proteaasi inhibiitori kokteil ja 1􏰅 fosfataasi inhibiitori kokteil I ja II), kiiresti külmutatud vedelas lämmastikus ja lüseeritud ultraheli rakkude katkemise teel, kasutades anaatorit mikrotipiga, nagu näiteks fosfataasi inhibiitori kokteil, Uf200 ः t s26d2 10 impulssi üle 10 s juures 30% amplituudiga. Kui tuleb valmistada suurem arv proove, tuleb ultraheli VialTweeter või MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP hästi plaadid on soovitatav. Pärast ultrahelitöötlust puhastati ekstraktid eelnevalt tsentrifuugimise teel 30 000 g juures 20 minutit 4 °C juures. Eelnevalt puhastatud ekstrakti (300 μg üldvalku) inkubeeriti 40􏰂 μg ANTI-CDC-25.1 afiinsusega puhastatud antikehaga (käesolev uuring), mis on ristseotud valguA-agaroosiga, või kontrollrühmana kasutati sarnast hulka küüliku immunoglobuliini (Ig)G, mis oli ristseotud proteiin A- agaroosiga, 200 μl lüüsipuhvrit, mis sisaldas 1% NP- 40, mille lisamine vähendas valkude mittespetsiifilist seondumist maatriksiga. Proove vahetati 1 tunni jooksul 4 °C juures, helmed pesti kolm korda lüüsipuhvriga ja elueeriti 30 μl glütsiini/HCl ja 200 mM NaCl, pH 2.2. Pärast immunosadestamist lahjendati eluaadid 30 μ􏰂l SDS proovipuhvris, kuumutati 4 minutit temperatuurini 95°C, ja tavaliselt 3% kogu sisend ja 30% eluaate rakendati SDS-PAGE järgneb Lääne blotting anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) või anti-􏰁β-aktiin (1:2000) antikehad. Kui ekstrakte ei ole immunosadestatud, suspendeeriti sama kogus nendest ekstraktidest saadud koguvalku SDS-proovi puhvris, kuumutati temperatuurini 95 °C ning seejärel kanti otse SDS-PAGE'ile ja analüüsiti western blotting. (vrd Segref et al. 2020)

Ultraheli lüüs prescise temperatuuri kontrolli all

Täpne ja usaldusväärne temperatuurikontroll on bioloogiliste proovide käitlemisel otsustava tähtsusega. Kõrgetemperatuur neis algatatakse proovides termiliselt indutseeritud valgu lagunemine.
Nagu kõik mehaanilised proovi ettevalmistamise tehnikad, ultrahelitöötlus loob soojust. Siiski, temperatuur proovid saab hästi kontrollida, kui kasutate VialTweeter. Tutvustame teile erinevaid võimalusi jälgida ja kontrollida temperatuuri oma proovid valmistades neid VialTweeter ja VialPress analüüsimiseks.

1. Proovi temperatuuri jälgimine: Ultraheli protsessor UP200St, mis juhib VialTweeterit, on varustatud intelligentse tarkvara ja ühendatava temperatuurianduriga. Ühendage temperatuuriandur UP200St-ga ja sisestage temperatuurianduri ots ühte näidistorudest. Digitaalse värvilise puuteekraani abil saate up200St menüüs määrata oma proovi ultrahelitöötluse jaoks kindla temperatuurivahemiku. Ultraheliseade peatub automaatselt, kui maksimaalne temperatuur on saavutatud, ja peatub, kuni proovi temperatuur on määratud temperatuuri alumise väärtuseni ∆. Seejärel algab ultrahelitöötlus automaatselt uuesti. See nutikas funktsioon takistab kuumusest tingitud lagunemist.
2. VialTweeteri bloki võib eelnevalt jahutada. Pane VialTweeter plokk (ainult sonotrode ilma anduri!) külmkappi või sügavkülma eelnevalt jahtuda titaaniplokk aitab edasi lükata temperatuuri tõusu proovis. Võimaluse korral võib proovi ise ka eeljahutada.
3. Ultrahelitöötluse ajal jahtumiseks kasutage kuiva jääd. Kasutage kuiva jääga täidetud madalat alust ja asetage VialTweeter kuivajääle, et kuumus saaks kiiresti hajutada.

Leidke optimaalne ultraheli rakkude katkend oma lüüsi rakenduse jaoks

Hielscher Ultrasonics on kauaaegne kogenud suure jõudlusega ultraheli rakkude häirijate ja homogenisaatorite tootja laboritele, pink-top ja tööstusliku ulatusega süsteemidele. Teie bakteriaalne rakukultuuri suurus, teie uurimis- või tootmiseesmärk ja raku maht tunnis või päevas on olulised tegurid, et leida õige ultraheli rakuhävitus.
Hielscher Ultrasonics pakub erinevaid lahendusi multi-proovide (kuni 10 viaali) ja massproovide (st mikrotiiterplaadid / 96-hästi plaadid), klassikaline sondi-tüüpi labori ultrasonicator erineva võimsusega 50-400 vatti kuni täielikult tööstusliku ultraheli protsessorid kuni 16,000watt ühiku kohta kaubandusliku rakuhäireid ja valgu ekstraheerimist suures tootmises. Kõik Hielscheri ultrasonicators on ehitatud 24 / 7 / 365 operatsiooni täiskoormuse all. Töökindlus ja usaldusväärsus on meie ultraheli seadmete põhiomadused.
Kõik digitaalsed ultraheli homogenisaatorid on varustatud nutika tarkvara, värvilise puuteekraani ja automaatse teismeprotokolliga, mis muudavad ultraheli seadme mugavaks töövahendiks laboris ja tootmisrajatistes.
Andke meile teada, milliseid rakke, millist mahtu, millise sagedusega ja millise sihtmärgiga peate oma bioloogilisi proove töötlema. Soovitame teile oma protsessi nõuete jaoks kõige sobivamat ultraheli rakukatkest.

Alljärgnev tabel näitab meie ultraheli süsteemide ligikaudset töötlemisvõimet kompaktsetest käeshoitavatest homogenisaatoritest ja mitmevalimilistest ultrasonicators'ist kuni tööstuslike ultraheli protsessoriteni kaubanduslikel eesmärkidel: