C. elegans’i proovide ultraheli ettevalmistus

C. elegans, ümarussi liiki nematood, on bioloogias laialdaselt kasutatav mudelorganism. Enne analüüsi nõuab proovide ettevalmistus lüüsi, valkude ja lipiidide ekstraktsiooni ning RNA fragmenteerimist, mida saab usaldusväärselt teostada sonikeerimisega. Ultraheli rakulõhkujad on töökindlad, kvaliteetsed ja kasutajasõbralikud seadmed C. elegans’i proovide kiireks ettevalmistamiseks.

C. elegans’i proovide ultraheli ettevalmistus

Caenorhabditis elegans on ümarussid, mida kasutatakse laialdaselt teaduslaboratooriumides genoomika, arengubioloogia ja haiguste uurimiseks. Paljudel C. elegans’i genoomi geenidel on inimesel funktsionaalsed vasted. Seetõttu on see nematood äärmiselt kasulik mudel inimhaiguste uurimiseks. Muud C. elegans’i laialdase kasutamise eelised on selle lihtne ja odav kasvatamine bakterikattega (nt E. coli) plaatidel, läbipaistvus, mugav käsitsemine ning võimalus ussid pikemaks ajaks sügavkülmutada ja säilitada.
Valkude ja lipiidide analüüs on laboratooriumides tavapärased protseduurid ning ultraheli proovide ettevalmistus on väljakujunenud meetod C. elegans’i nematoodide lüüsimiseks igas arengustaadiumis (st embrüod, vastsed L1–L4, täiskasvanud isendid). Kuna C. elegans’i kasutatakse ka valkude ekspressioonisüsteemina sihtvalkude üleekspresseerimiseks, on vaja töökindlat ja korratavat lüüsi- ning valkude ekstraktsioonimeetodit, mis annab suure valgusaagise. Ultraheli rakulõhkumis- ja ekstraktsioonisüsteemid on saadaval sondtüüpi homogenisaatoritena ja mitme proovi korraga töötlevate ultraheliseadmetena. Hielscher Ultrasonics pakub mugavaks proovide ettevalmistuseks ja igasuguse proovide suuruse ning arvu jaoks sobivaima ultraheli rakulõhkuja teie laboriprotseduurile.

Ultraheli protokollid C. Elegans’i lõhkumiseks ja lüüsiks

C. elegans’i ultraheli homogeniseerimist ja lüüsi ning sellele järgnevat valkude ja lipiidide ekstraktsiooni saab teostada erinevate protseduuridega, kasutades erinevaid homogeniseerimis- ja lüüsipuhvreid jne. Kõigi lüüsiprotokollide ühine joon on see, et valkude lagunemise vältimiseks tuleb proove kogu aeg hoida jääl. Allpool tutvustame teile mõningaid töökindlaid ja kiireid ultraheli lüüsi- ja ekstraktsiooniprotokolle kvaliteetsete valke või lipiide sisaldavate C. elegans’i proovide ettevalmistamiseks.

Ultraheli C. elegans’i lüüsi eelised

• töökindel
• korratav
• täpselt temperatuuri kontrollitav
• usaldusväärne protsessikontroll
• õrn meetod
• lihtne kasutada
• ohutu

Valkude ultraheli ekstraktsioon C. elegans’i proovidest

C. elegans’i usside ultraheli lüüsi ja valkude ekstraktsiooni saab teostada erinevate protokollidega. Allpool tutvustame teile mõningaid töökindlaid ja kiireid lüüsiprotokolle korratavate valkude ekstraktsiooni tulemuste saamiseks.

Tsütosoolse ekstrakti kiire ettevalmistamine C. elegans’i ussidest sonikeerimisega

Järgmise protokolliga saate C. elegans’i lüsaate ette valmistada vähem kui 30 minutiga.
C. elegans’i kogumine
Plokkige soovitud C. elegans’i ussid 1,5 ml tuubi, mis sisaldab fosfaatpuhverdatud soolalahust (PBS), või peske need plaadilt maha 1,5 ml PBS-ga. Tsentrifuugige 1 min 2000 p/min juures, et saada sade. Hoidke proove kogu aeg jääl.
Seejärel peske usse kaks korda PBS-iga.
Seejärel peske usse kaks korda ddH₂O-ga.
Suspendeerige ussid uuesti vähemalt 500 ul homogeniseerimispuhvris (HB). Usside proovid on nüüd ultraheli lüüsiks valmis.
Valguekstrakti kvaliteedi parandamiseks võite soovida vähendada bakteriaalset saastumist, pestes usse 5 min kummagi lahusega: PBS-is ja steriilses ülipuhtas vees (ddH₂O), või teostada sahharoosi flotatsiooni. Hoidke usside proove kogu aeg jääl.

Ultraheli C. elegans’i lüüsi protokoll

• Veenduge, et olete ultraheliseadme eelnevalt ette valmistanud, nii et ultraheli homogenisaator on kasutusvalmis (sond paigaldatud, sonikeerimisprogramm eelseadistatud). 

Kui teie ultrahelitöötlusseade on statiivile kinnitatud, asetage proovitorudega jäävann ultraheli sondi alla ja sisestage ultraheli sond 1,5ml tuubi.

• C. elegans’i lüüsimiseks UP200St või UP200Ht seadmega tuleks ultraheli töötlus teostada mikrotipiga (nt 2mm sond S26d2; vt pilti vasakul) 40% amplituudil 1sek jooksul, vahepealsete 30sek pausidega. C. elegans’i lüüsimiseks sobib ideaalselt 5 sonikeerimistsüklit, igaüks 1 sekund, 30sek pausidega. Kui teostate lüüsi esimest korda, saate lüüsi kulgu kontrollida proovi väikestest alikvootidest pärast iga impulssi mikroskoobi abil.
• Lüüs on edukalt lõpule viidud, kui ussid on lõhutud. Liigne sonikeerimine põhjustab tuumade purunemist ja see muutub nähtavaks, kui proov muutub viskoosseks või hakkab vahutama. Proovi lagunemise vältimiseks kasutage vajaduse korral rohkem impulsse. Ärge pikendage iga ultrahelimpulsi tsükli kestust, et saada kvaliteetseid valguekstrakte.
• Selgitage rakulüsaat, tsentrifuugides ultraheliga lüüsitud usse kiirusel 14 000rpm 10min jooksul temperatuuril 4ºC.
• Seejärel kandke supernatant värskesse tuubi ja valmistage see ette immunosadestamiseks või muudeks analüüsideks.

Märkus homogeniseerimispuhvri kohta: Valmistage ülaltoodud ultraheli lüüsiprotokolli jaoks homogeniseerimispuhver ette järgmiselt:

Suure läbilaskevõimega C. elegans’i lüüs 96-süvendilistes plaatides plaadisonikaatoriga UIP400MTP

C. elegans’i lüüs (täiskasvanud nematoodid)
UIP400MTP 80% amplituud, 20 tsüklit (iga sonikeerimistsükkel: 30 sek SEES, 30 sek VÄLJAS)
Lüüsipuhver:

• Variant 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Variant 2) koimmunosadestamiseks (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (Complete proteinaasi inhibiitori kokteil)

Suure läbilaskevõimega DNA fragmenteerimine
C. elegans (täiskasvanud nematoodid) DNA 200-300bp: UIP400MTP plaadisonikaator – seadistus 80% amplituud, 30 impulssi – iga 30sek sees, 30sek väljas

Suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistamiseks mõeldud plaadisonikaator UIP400MTP töötleb proove ühtlaselt ultraheliga mitme süvendiga mikrotiiterplaatides ja 96-süvendilistes plaatides

C. elegans’i ultraheli lüüs kvantitatiivseteks afiinsuspuhastuse analüüsideks

C. elegans’i embrüod (∼2 miljonit replikaadi kohta) koguti värskelt bioloogilises kolmekordses korduses noorte tiinete hermafrodiitide pleegitamise teel ja sonikeeriti jääl (tsükkel: 0,5 s, amplituud: 40–45%, 5 pulssi/sessioon, 5 sessiooni, sessioonide vaheline intervall: 30 s; UP200S ultraheliprotsessor mikrotipiga S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) lüüsipuhvris (kogumaht: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glütserool, proteaasi inhibiitorite segu, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Pärast sonikeerimist lisati Nonidet P-40 Substitute kuni 1%-ni ja lüsaate inkubeeriti otsast-otsani pöörlemisega temperatuuril 4°C 30 min jooksul, millele järgnes tsentrifuugimine 20 000 × g juures 20 min jooksul temperatuuril 4°C. Selgitatud lüsaat aspireeriti seejärel ülemist lipiidikihti häirimata ja jagati pooleks kas anti-GFP agaroosikuulikestele või blokeeritud kontrollkuulikestele (40–50 μl). Pärast otsast-otsani pöörlemist temperatuuril 4°C 60–90 min jooksul pesti kuulikesi üks kord lüüsipuhvriga, mis sisaldas 0,1% Nonidet P-40 Substitute, millele järgnes kahekordne pesemine kas puhvris I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) või puhvris II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) või mõlemas. GFP:MBK-2 pull-down’ide puhul tehti kaks eraldi katset, kasutades erinevaid pesutingimusi. Valgud eluteeriti orbitaalloksutamisega 50 μl-s 6 m uurea/2 M tiouurea lahuses toatemperatuuril. MBK-1::GFP pull-down katsete puhul eluteeriti valgud kahel korral loksutamisega 50μl-s 8 m guanidiinkloriidi lahuses temperatuuril 90°C, millele järgnes etanooliga sadestamine. Eluteeritud valguproovid seejärel lagundati lahuses.
(vrd Chen et al., 2016)

Ultraheli homogeniseerimine ja lüüs usside puhul

C.elegans’e lüüsi ja valgu ekstraheerimise protseduuri jaoks koguti proovi kohta 30 000 asjakohase staadiumi nematoodi ning pesti need jääkülmas S-basal’is, kontsentreeriti tsentrifuugimisega kiirusel 1500 rpm 2 min., pesti kuus korda jääkülma S-basal’iga jääkbakterite eemaldamiseks ja seejärel hoiti jääl kuni kasutamiseni. Valgu ekstraheerimiseks lasti gravidsetel täiskasvanud ussidel pärast viimast S-basal’i pesu moodustada kompaktne sade. Seejärel suspendeeriti ussisademed uuesti 1 ml-s jääkülma ekstraktsioonipuhvrit [20 mM kaaliumfosfaat, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, proteaasi inhibiitorid (Sigma P2714)] ja töödeldi viivitamatult.
∼30 000 gravidset täiskasvanud ussi (mis vastab ∼100 mg märgmassile) sonikeeriti jääl sondtüüpi ultraheli seadmega (nt UP50H mikrotipiga MS2) 40% amplituudil 10 tsüklit, kumbki 3 sek sees, 30 sek väljas, 1 ml-s jääkülmas ekstraktsioonipuhvris. (vrd Baskharan et al. 2012)

Lipiidide ultraheli ekstraheerimine C. elegans’ist

Lipidoomikas, mis on metaboloomika haru, iseloomustatakse ja analüüsitakse bioloogiliste süsteemide lipiidide kogumit. C. elegans’i kasutatakse lipidoomikas laialdaselt metaboolsete lipiidide koostoime ning nende mõju uurimiseks tervisele ja elueale.
Ultraheli lüüsi ja ekstraheerimist kasutatakse lipiidide, näiteks sfingolipiidide vabastamiseks C. elegans’i embrüotest, vastsetest ja täiskasvanud ussidest. Ultraheli töötlust kasutatakse ussihomogenaatide valmistamiseks ning seejärel lipiidide ekstraheerimiseks proovist.
Protokoll lipiidide ultraheli ekstraheerimiseks C. elegans’ist
Sulatage C. elegans’i sade jääl ja suspendeerige uuesti 0,5 ml ultraveega. Sonikeerige C. elegans’i proove 1,5 mL katsutites, hoides proove pidevalt jääl.
Sonikeerimiseks võib kasutada sondtüüpi ultraheli seadet, näiteks UP200Ht, ultraheli proovide ettevalmistusseadet VialTweeter (10 proovi samaaegne sonikeerimine) või UIP400MTP (mitme süvendiga plaatide, näiteks 96-süvendiliste plaatide sonikeerimiseks). Ultraheli lüüsiks seadmega UP200Ht kasutage mikrotippi S26d2. Seadistage ultraheli tsüklirežiim digitaalmenüüs eelnevalt. Määrake amplituudiks 10% ning sonikeerimistsükli režiimiks 2 sek impulsid 20 tsüklit, pausiga 30 sek. iga ultraheli impulsipaki vahel.
Kandke supernatandid keeratavate korkidega klaasanumatesse. Teostage Folchi ekstraktsioon, lisades igasse klaasanumasse 1 ml ultravett, seejärel lisades igasse klaasanumasse 6 ml kloroformi/metanooli segu (suhe = 2:1).
Keerutage iga klaasanumat vorteksil 30 sek 4 korda. Tsentrifuugige katsuteid kiirusel 1 258 x g 15 min (Eppendorf, 5810 R) faaside eraldumise edasiseks parandamiseks. Kandke alumine hüdrofoobne fraktsioon klaaspasteuri pipetiga puhtasse klaasanumasse. Kuivatage alumine hüdrofoobne fraktsioon lämmastikuvoolu all lämmastikuaurustis. Hoidke kuivatatud sadet külmikus temperatuuril -80 °C kuni kasutamiseni. 


Ussilüsaatide ultraheli ettevalmistamine

Ussilüsaat: L4 staadiumi ussid koguti ja pesti kolm korda M9 puhvriga (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl ja 0,87 mM MgSO₄), et eemaldada kõik bakterid. Pärast M9 puhvri maksimaalset eemaldamist suspendeeriti ussid uuesti lüüsipuhvris: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM fosfaat-β-glütserool, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM naatriumfluoriid, 1 mM naatriumortovanadaat, 5 mM naatriumpürofosfaat, 0,2 mM fenüülmetaansulfonüülfluoriid ja proteaasi inhibiitor. Ussid külmutati vedelas lämmastikus ja sulatati kolm korda temperatuuril 37°C, seejärel sonikeeriti ussid kuival jääl ultraheli seadmega VialTweeter 10 proovitoru samaaegseks ettevalmistamiseks. Sonikeerimine viidi läbi 50% amplituudil 10 tsüklina, igaüks 2 sek., ja 30 sek pausiga sonikeerimispursete vahel. Seejärel tsentrifuugiti proove kiirusel 12 000 rpm temperatuuril 4°C 15 min. Supernatant koguti ja säilitati temperatuuril -70°C. Üht alikvooti kasutati valgu kvantifitseerimiseks Bradfordi meetodil.
Kogu glutatiooni, GSH ja GSSG määramine: glutatiooni kvantifitseerimiseks valmistati lüsaadid ja tehti määramine samal päeval. Glükoosiga toidetud ja kontroll-vastsed L4 koguti ja pesti M9 puhvriga kolm korda. Pärast M9 puhvri maksimaalset eemaldamist suspendeeriti ussid uuesti jääkülmas metafosforhappes (5% w/v), seejärel sonikeeriti ussid jääs ultraheli seadmega VialTweeter 50% amplituudil kümnes sonikeerimistsüklis, igaüks 2 sek., ja 30 sek. pausiga iga tsükli vahel. Seejärel tsentrifuugiti kiirusel 12 000 rpm temperatuuril 4 ̊C 15 min.
(vrd Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans’i proovide ettevalmistus enne immunosadestamist ja Western blot’i

Lühidalt: embrüonaalsete ekstraktide jaoks kasvatati C. elegans’i L1-vastseid suuremahulistes vedela S-söötme kultuurides täiskasvanuks. Embrüod koguti standardse pleegitusmeetodiga ja suspendeeriti lüüsipuhvris (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glütserool, 0,05% NP-40, 1􏰅 proteaasi inhibiitorite kokteil ja 1􏰅 fosfataasi inhibiitorite kokteil I ja II), külmutati kiiresti vedelas lämmastikus ja lüüsiti ultraheli rakkude lõhkumisega, kasutades mikrotipiga ultraheli töötlusseadet, näiteks UP200Ht koos S26d2-ga 10 pulssi 10 s jooksul 30% amplituudil. Kui tuleb ette valmistada suurem arv proove, on soovitatav ultraheli VialTweeter või mitme proovi sonikaator UIP400MTP multikaevikuplaatide jaoks. Pärast sonikeerimist eelpuhastati ekstraktid tsentrifuugimisega 30 000g juures 20 min temperatuuril 4°C. Eelpuhastatud ekstrakti (300µg kogu valku) inkubeeriti 40µ􏰂g anti-CDC-25.1 afiinsuspuhastatud antikehaga (käesolev uuring), mis oli ristseotud valk A-agaroosiga, või kontrollina kasutati sarnast kogust valk A-agaroosiga ristseotud küüliku immunoglobuliin (Ig)G-d kogumahus 200µl lüüsipuhvrit, mis sisaldas 1% NP-40, mille lisamine vähendas valkude mittespetsiifilist seondumist maatriksiga. Proove pöörati 1 h temperatuuril 4°C, graanuleid pesti kolm korda lüüsipuhvriga ja eluteeriti 30µl glütsiin/HCl ja 200 mM NaCl, pH 2,2. Pärast immunosadestamist lahjendati eluaadid 30µ􏰂l SDS-proovipuhvris, kuumutati 4 min 95°C juures ning SDS-PAGE-le kanti tavaliselt 3% kogumahust sisendina ja 30% eluaatidest, millele järgnes Western blot anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubikvitiini (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) või anti-􏰁β-aktiini (1:2000) antikehadega. Kui ekstrakte ei allutatud immunosadestamisele, suspendeeriti nendest ekstraktidest saadud sama kogus kogu valku SDS-proovipuhvris, kuumutati 95°C juures ja kanti seejärel otse SDS-PAGE-le ning analüüsiti Western blot’iga. (vrd Segref et al. 2020)

Ultraheli lüüs täpse temperatuurikontrolli all

Täpne ja usaldusväärne temperatuuri reguleerimine on bioloogiliste proovide käsitsemisel ülioluline. Kõrged temperatuurid käivitavad proovides termiliselt tingitud valkude lagunemise.
Nagu kõik mehaanilised proovide ettevalmistamise meetodid, tekitab ka ultraheli töötlus (sonikeerimine) soojust. Seadet VialTweeter kasutades saab proovide temperatuuri siiski hästi reguleerida. Tutvustame teile mitmeid võimalusi oma proovide temperatuuri jälgimiseks ja reguleerimiseks, kui valmistate neid analüüsiks ette seadmetega VialTweeter ja VialPress.

1. Proovi temperatuuri jälgimine: Ultraheliprotsessor UP200St, mis juhib seadet VialTweeter, on varustatud intelligentse tarkvara ja ühendatava temperatuurianduriga. Ühendage temperatuuriandur seadmega UP200St ja sisestage temperatuurianduri ots ühte proovitorudest. Digitaalse värvilise puuteekraani kaudu saate seadme UP200St menüüs määrata oma proovi ultraheli töötluse jaoks kindla temperatuurivahemiku. Sonikaator peatub automaatselt, kui maksimaalne temperatuur on saavutatud, ja jääb pausile, kuni proovi temperatuur langeb seatud temperatuurivahemiku ∆ alumise väärtuseni. Seejärel algab sonikeerimine automaatselt uuesti. See nutikas funktsioon hoiab ära kuumusest tingitud lagunemise.
2. Seadme VialTweeter plokki saab eelnevalt jahutada. Seadme VialTweeter ploki (ainult sonotrood ilma muundurita!) panemine külmikusse või sügavkülma titaanploki eelnevaks jahutamiseks aitab proovi temperatuuri tõusu edasi lükata. Võimaluse korral saab ka proovi ennast eelnevalt jahutada.
3. Kasutage sonikeerimise ajal jahutamiseks kuivjääd. Kasutage kuivjääga täidetud madalat alust ja asetage VialTweeter kuivjääle, et soojus saaks kiiresti hajuda.

Leidke oma lüüsirakenduse jaoks optimaalne ultraheli rakulõhkuja

Hielscher Ultrasonics on pikaajalise kogemusega kõrgjõudlusega ultraheli rakulõhkujate ja homogenisaatorite tootja laboratoorsetele, lauaseadme- ja tööstusliku mastaabiga süsteemidele. Teie bakterirakukultuuri suurus, teie uurimis- või tootmiseesmärk ja tunnis või päevas töödeldavate rakkude maht on olulised tegurid, et leida oma rakenduse jaoks sobiv ultraheli rakulõhkuja.
Hielscher Ultrasonics pakub mitmesuguseid lahendusi mitme proovi (kuni 10 viaali) samaaegseks sonikeerimiseks ning massproovide (st mikrotiiterplaadid / 96-süvendilised plaadid) töötlemiseks: alates klassikalistest sondtüüpi laboratoorsetest sonikaatoritest, mille võimsustasemed on 50 kuni 400 vatti, kuni täiesti tööstuslike ultraheliprotsessoriteni, mille võimsus on kuni 16 000 vatti seadme kohta, kommertsliku rakkude lõhkumise (desintegreerimise) ja valkude ekstraheerimise jaoks suuretootmises. Kõik Hielscheri sonikaatorid on ehitatud 24/7/365 tööks täiskoormusel. Töökindlus ja usaldusväärsus on meie ultraheliseadmete põhiomadused.
Kõik digitaalsed ultraheli homogenisaatorid on varustatud nutika tarkvara, värvilise puuteekraani ja automaatse andmete salvestusega, mis muudavad ultraheliseadme mugavaks töövahendiks laboris ja tootmisrajatistes.
Teatage meile, milliseid rakke, millist mahtu, millise sagedusega ja millise eesmärgiga te oma bioloogilisi proove töötlema peate. Soovitame teile oma protsessi nõuetele kõige sobivamat ultraheli rakulõhkujat.

Allolev tabel annab ülevaate meie ultrahelisüsteemide ligikaudsest töötlemisvõimsusest, alates kompaktsetest käeshoitavatest homogenisaatoritest ja MultiSample-sonikaatoritest kuni tööstuslike ultraheliprotsessoriteni kommertsrakenduste jaoks: