C. Elegans'i proovide ultraheli ettevalmistamine

C. elegans, nematoodi uss, on bioloogias laialdaselt kasutatav mudelorganism. Proovi ettevalmistamine enne analüüsi nõuab lüüsi, valgu ja lipiidide ekstraheerimist ning RNA killustumist, mida saab ultrahelitöötluse abil usaldusväärselt läbi viia. Ultraheli rakkude katkestajad on usaldusväärsed, keerukad ja kergesti kasutatavad seadmed C. elegans'i proovide kiireks ettevalmistamiseks.

C. Elegans'i proovide ultraheli ettevalmistamine

C. elegans on ümarussid, mida kasutatakse laialdaselt uurimislaborites genoomika, arengubioloogia ja haiguste uurimiseks. Paljudel C. elegans'i genoomi geenidel on inimestel funktsionaalsed vasted. Seega on nematoodi uss äärmiselt kasulik mudel inimeste haiguste jaoks. C. elegans'i laialdase kasutamise muud eelised on selle lihtne ja odav kasvatamine baktereid sisaldavatel plaatidel (nt E. coli), selle läbipaistvus, mugav käsitsemine, samuti võimalus usse külmutada ja säilitada kauem.
Valkude ja lipiidide analüüs on regulaarsed protseduurid laborites ja ultraheli proovide ettevalmistamine on kehtestatud meetod C. elegans'i nematoodide lüüsimiseks igas arenguetapis (st embrüod, vastsed L1-L4, täiskasvanud). Kuna C. elegans'i kasutatakse ka valgu ekspressioonisüsteemina sihitud valkude üleekspresseerimiseks, on vaja usaldusväärset, reprodutseeritavat lüüsi ja valgu ekstraheerimise meetodit, mis annab kõrge valgusaagise. Ultraheli rakkude katkestamise ja ekstraheerimise süsteemid on saadaval sondi tüüpi homogenisaatoritena ja mitme proovi ultrasonikaatoritena. Toitlustamine mugava proovi ettevalmistamisega ja igasuguste proovide suuruste numbritega, Hielscher Ultrasonicsil on teie laboriprotseduuri jaoks ideaalne ultraheli rakkude katkestaja.

Ultraheli protokollid C. Elegansi häirete ja lüüsi jaoks

C. elegans'i ultraheli homogeniseerimist ja lüüsi ning sellele järgnevat valgu ja lipiidide ekstraheerimist saab läbi viia erinevate protseduuride abil, kasutades erinevaid homogeniseerimis- ja lüüsipuhvreid jne. Kõigil lüüsiprotokollidel on ühine see, et proove tuleb pidevalt jääl hoida, et vältida valkude lagunemist. Allpool tutvustame teile mõningaid usaldusväärseid ja kiireid ultraheli lüüsi- ja ekstraheerimisprotokolle kvaliteetsete valgu- või lipiidide sisaldavate C. elegans'i proovide valmistamiseks.

Ultraheli C. elegans Lysis eelised

• Usaldusväärne
• reprodutseeritav
• täpselttemperatuuriga kontrollitud
• usaldusväärne protsessi juhtimine
• õrn meetod
• lihtne peale kanda
• Ohutu

Ultraheli valgu ekstraheerimine C. elegansi proovidest

C. elegans'i usside ultraheli lüüsi ja valgu ekstraheerimist saab teostada erinevate protokollide abil. Allpool tutvustame teile mõningaid usaldusväärseid ja kiireid lüüsiprotokolle reprodutseeritavate valkude ekstraheerimise tulemuste jaoks.

C. elegans Worms'i tsütosoolse ekstrakti kiire ettevalmistamine ultrahelitöötluse teel

Järgmise protokolli abil saate C. elegans'i lüsaadid valmistada vähem kui 30 minutiga.
C. elegans'i kollektsioon
Vali soovitud C. elegans ussid 1,5ml tuubifosfaadi puhvri lisandiga keedusoolalahusesse (PBS) või pese neid plaadilt 1,5ml fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega. Tsentrifuugitakse 1min kiirusel 2000 pööret minutis pelletiks. Proove hoitakse kogu aeg jääl.
Seejärel peske ussid kaks korda PBS-iga.
Seejärel peske ussid kaks korda ddH-ga₂O.
Ussid peatatakse uuesti vähemalt 500ul homogeniseerimispuhvris (HB). Ussiproovid on nüüd ultraheli lüüsiks valmis.
Kõrgema valguekstrakti kvaliteedi saavutamiseks võiksite vähendada bakteriaalset saastumist, pestes usse 5 minutit igaüks fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses ja steriilses, ülipuhtas vees (ddH₂O) või tehke sahharoosi ujumist. Hoidke ussiproove pidevalt jääl.

Ultraheli C. elegans lüüsi protokoll

• Veenduge, et valmistate ultrasonikaatori ette nii, et ultraheli homogenisaator oleks kasutusvalmis (sond paigaldatud, ultrahelitöötlusprogramm eelseadistatud).

Kui teie ultrasonikaator on statsionaarne, asetage jäävann koos proovitorudega ultraheli sondi alla ja sisestage ultraheli sond 1,5 ml torusse.

• C. elegans'i lüüsi puhul UP200St või UP200Ht-ga tuleb ultraheliuuring läbi viia mikrotipi abil (nt 2 mm sond S26d2; vt pilti vasakul) 40% amplituudiga 1sec jaoks, 30sec pausid vahepeal. 5 ultrahelitöötlustsüklit iga 1 sekundi kohta 30sec pausidega on ideaalsed C. elegans'i lüüsi jaoks. Kui teete lüüsi esimest korda, saate mikroskoobi abil kontrollida lüüsi progresseerumist proovi väikestes alikvootides pärast iga impulssi.
• Lüüs on edukalt lõpule viidud, kui ussid on häiritud. Liigne ultrahelitöötlus põhjustab tuumade purunemist ja muutub nähtavaks, kui proov muutub viskoosseks või vahuks. Proovi lagunemise vältimiseks kasutage vajadusel rohkem impulsse. Ärge suurendage iga ultraheli impulsitsükli aega, et saada kvaliteetseid valguekstrakte.
• Puhastage rakulüsaat, tsentrifuugides ultraheliga lüüsitud usse kiirusel 14 000 p / min 10 minutit 4 ° C juures.
• Seejärel viiakse supernatant värskesse katseklaasi ja valmistatakse ette immunopretsipitatsiooniks või muudeks analüüsideks.

Märkus homogeniseerimispuhvri kohta: Valmistage ülaltoodud ultraheli lüüsiprotokolli homogeniseerimispuhver järgmiselt:

• 15 mM Hepes pH 7,6 – 15 ml 0,5 M
• 10 mM KCl – 2,5 ml 2 M
• 1,5 mM MgCl2 – 0.75 ml 1 M
• 0.1 mM EDTA – 100 ul 0,5 M
• 0.5 mM EGTA – 2,5 ml 0,1 M
• 44 mM sahharoosi – 14,7 ml 50 %
• Lisa vahetult enne kasutamist: 1mM DTT – 1000x 1M
• lisaks proteaasi inhibiitor

C. elegans'i suure läbilaskevõimega lüüs 96-süvendi plaatidel, kasutades UIP400MTP plaadi sonikaatorit

C. elegans Lysis (täiskasvanud nematoodid)
UIP400MTP 80% amplituud, 20 tsüklit (iga ultrahelitöötlustsükkel: 30 sek ON, 30 sek OFF)
Lüüsi puhver:

• 1. võimalus) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• 2. võimalus) ko-immunoprecipitatsiooni (co-IP) jaoks: 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5% NP-40 (täielik proteinaasi inhibiitorikokteil)

Suure läbilaskevõimega DNA killustumine
C. elegans (täiskasvanud nematoodid) DNA 200-300bp: UIP400MTP plaadi sonikaator – seadistage 80% amplituud, 30pulses – iga 30sek sisse, 30sek välja

UIP400MTP Plate Sonicator suure läbilaskevõimega proovi ettevalmistamiseks sonikeerib proovid ühtlaselt mitme süvendi, mikrotiiterplaatidel ja 96-augulistel plaatidel

C. elegans'i ultraheli lüüs kvantitatiivsete afiinsuse puhastamise testide jaoks

C. elegans'i embrüod (∼ 2 miljonit replikaadi kohta) koguti värskelt bioloogilises kolmes eksemplaris, pleegitades noori gravid hermafrodiite ja töödeldes jääl (tsükkel: 0,5 s, amplituud: 40–45%, 5 lööki / seanss, 5 seanssi, seansside vaheline intervall: 30 s; UP200S ultraheli protsessor mikro-otsaga S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) lüüsipuhvris (üldmaht: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glütserool, proteaasi inhibiitori segu, 0,1% Nonidet P-40 asendaja). Pärast ultrahelitöötlust lisati Nonidet P-40 asendajat kuni 1% ja lüsaate inkubeeriti peaga saba pöörlemisel 4 ° C juures 30 minutit, millele järgnes tsentrifuugimine 20 000 × g juures 20 minutit 4 ° C juures. Seejärel aspireeriti puhastatud lüsaat ülemist lipiidikihti häirimata ja jagati pooleks kas anti-GFP agarooshelmesteks või blokeeritud kontrollhelmesteks (40–50 μl). Pärast pea kohal saba pöörlemist 4 °C juures 60–90 minutit pesti helmeid üks kord lüüsipuhvriga, mis sisaldas 0,1% Nonidet P-40 asendajat, millele järgnes kaks korda pesemine kas puhvris I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) või puhver II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) või mõlemad. GFP:MBK-2 allatõmbamiste puhul viidi läbi kaks eraldi katset, kasutades erinevaid pesemistingimusi. Valgud elueeriti orbitaalloksutamisel toatemperatuuril 50 μl 6 m karbamiidi/2 M tioureas. MBK-1::GFP allatõmbamise katsete puhul elueeriti valke kaks korda, loksutades 50 μl 8 m guanidiiniumkloriidis 90 °C juures, millele järgnes etanooli sadestamine. Seejärel lagundati elueeritud valgu proovid lahuses.
(vrd Chen et al., 2016)

Ultraheli uss homogeniseerimine ja lüüs

C.elegans'i lüüsi ja valgu ekstraheerimise protseduuri jaoks koguti iga proovi kohta 30 000 vastava etapi nemotoodi ja pesti jääkülmas S-basaalis, kontsentreeriti tsentrifuugimise teel kiirusel 1500 pööret minutis 2 minutit, pesti kuus korda jääkülma S-basaaliga jääkbakterite eemaldamiseks ja seejärel hoiti jääl, kuni see oli kasutusvalmis. Valgu ekstraheerimiseks lubati täiskasvanud ussidel pärast viimast S-basaalpesu moodustada kompaktne pellet. Seejärel resuspendeeriti ussigraanulid 1 ml jääkülmas ekstraheerimispuhvris [20 mM kaaliumfosfaat, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, proteaasi inhibiitorid (Sigma P2714)] ja töödeldi kohe.
∼ 30 000 gravidi-täiskasvanud ussi (mis vastab ∼ 100 mg märgkaalule) töödeldi jääl, kasutades sondi tüüpi ultrasonikaatorit (nt UP50H koos mikrotiibiga MS2) 40% amplituudiga 10 tsüklit 3 sekundit sisse, 30 sek välja, 1 ml jääkülma ekstraheerimise puhvris. (vrd Baskharan et al. 2012)

Ultraheli lipiidide ekstraheerimine C. elegans'ist

Lipiidoomikas, mis on metaboloomika haru, iseloomustatakse ja analüüsitakse bioloogiliste süsteemide lipiidide komplementi. C. elegansi kasutatakse lipiidoomikas laialdaselt, et uurida metaboolsete lipiidide koostoimet ja nende mõju tervisele ja elueale.
Ultraheli lüüsi ja ekstraheerimist kasutatakse lipiidide, näiteks sfingolipiidide vabastamiseks C. elegans'i embrüotest, vastsetest ja täiskasvanud ussidest. Ultraheli kasutatakse uss homogenaatide valmistamiseks ja seejärel lipiidide ekstraheerimiseks proovist.
Protokoll ultraheli lipiidide ekstraheerimiseks C. elegans'ist
C.elegans'i graanul sulatatakse jääl ja suspendeeritakse uuesti 0,5 ml ultraveega. 
C.elegans'i proovid sonikeeritakse 1,5 ml katseklaasides, hoides proove pidevalt jääl.
Sonikatsiooni saab läbi viia sondi-ultraheli abil, näiteks UP200Ht, ultraheli proovi ettevalmistamise üksus VialTweeter (10 proovi samaaegne ultrahelitöötlus) või UIP400MTP (mitme süvendiga plaatide, näiteks 96-süvendi plaatide ultraheliga töötlemiseks). Ultraheli lüüsi jaoks UP200Ht-ga kasutage mikro-otsa S26d2. Eelseadistage ultraheli tsükli režiim digitaalses menüüs. Seadke amplituud 10% -ni ja ultrahelitöötlustsükli režiim 2-sekundiliste impulsside 20 tsükliga, pausiga 30 sekundit.
Supernatandid kantakse keeratava korgiga klaastorudesse. 
Folchi ekstraheerimiseks lisatakse igasse klaastorusse 1 ml ultravett, seejärel lisatakse igasse klaastorusse 6 ml kloroformi/metanooli segu (suhe = 2:1).
Pööritage iga klaastoru 30 sekundit 4 korda. 
Katseklaase tsentrifuugitakse 1,258 x g juures 15 minutit (Eppendorf, 5810 R), et veelgi suurendada faaside eraldumist. 
Alumine hüdrofoobne fraktsioon kantakse Pasteuri klaaspipeti abil puhtasse klaastorusse. 
Alumine hüdrofoobne fraktsioon kuivatatakse lämmastiku voolu all lämmastikuaurutis. 
Kuivatatud bakterpelletit hoitakse kuni kasutamiseni -80 °C sügavkülmas.

usslüsaatide ultraheli ettevalmistamine

Usslüsaat: L4 astme ussid koguti ja pesti kolm korda M9 puhvriga (42,26 mM Na₂HPO₄, 22.04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl ja 0,87 mM MgSO₄) et eemaldada kõik bakterid. Pärast M9 puhvri võimalikult palju eemaldamist resuspendeeriti ussid lüüsipuhvris: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM fosfaat β-glütserool, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM naatriumfluoriid, 1 mM naatriumortovanadaat, 5 mM naatriumpürofosfaat, 0,2 mM fenüülmetaansulfonüülfluoriid ja proteaasi inhibiitor. Ussid külmutati vedelas lämmastikus ja sulatati kolm korda temperatuuril 37 ° C, seejärel töödeldi ussid ultraheliga kuival jääl ultraheli VialTweeter seadmega 10 prooviklaasi samaaegseks valmistamiseks. Sonikatsioon viidi läbi 50% amplituudiga 10 tsüklis 2 sekundit. 30-sekundilise pausiga ultrahelitöötluse purunemiste vahel. Seejärel tsentrifuugiti proove kiirusel 12000 pööret minutis 4 °C juures 15 minutit. Supernatant koguti kokku ja säilitati -70 °C juures. Bradfordi analüüsis kasutati valgu kvantifitseerimiseks alikvooti.
Glutatiooni, GSH ja GSSG üldsisalduse määramine: glutatiooni kvantifitseerimiseks tehti lüsaadid ja määramine samal päeval. Glükoosiga toidetud ja kontroll-L4 vastsed koguti kokku ja pesti kolm korda M9 puhvriga. Pärast M9 puhvri võimalikult palju eemaldamist resuspendeeriti ussid jääkülmas metafosforhappes (5% w / v), seejärel töödeldi ussid ultraheliga VialTweeteriga jääl 50% amplituudiga kümnes ultrahelitöötlustsüklis 2 sekundit. Seejärel tsentrifuugitakse 12000 pööret minutis 4 ̊C juures 15 minutit.
(vrd Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans Proovi ettevalmistus enne immunoprecipitatsiooni ja Western Blotting

Lühidalt öeldes kasvatati embrüonaalsete ekstraktide puhul C. elegans L1 vastseid suuremahulistes vedelates S-keskmise kultuurides täiskasvanueas. Embrüod koguti standardse pleegitusmeetodi abil ja suspendeeriti lüüsipuhvris (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glütserool, 0,05% NP-40, 1ürgne proteaasi inhibiitorikokteil ja 1laugeldatud fosfataasi inhibiitorikokteil I ja II), külmutati kiiresti vedelas lämmastikus ja lüüsiti ultraheli rakkude katkestamisega, kasutades ultraheli mikrotiimiga ultraheli, näiteks UP200Ht S26d2-ga 10 impulsi jaoks üle 10 sekundi 30% amplituudiga. Kui tuleb valmistada suurem arv proove, siis ultraheli VialTweeter või soovitatav on MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP hästi plaatide jaoks. Pärast ultrahelitöötlust puhastati ekstraktid tsentrifuugimisega 30 000 g juures 20 minutit 4 °C juures. Eelnevalt puhastatud ekstrakti (300 μg kogu valku) inkubeeriti 40μ---------------- Proove pöörati 1 tund temperatuuril 4 °C, helmeid pesti kolm korda lüüsipuhvriga ning elueeriti 30 μl glütsiini/HCl ja 200 mM NaCl-ga, pH 2,2. Pärast immunoprecipitatsiooni lahjendati eluaadid 30 μ plõõgses SDS-proovipuhvris, kuumutati 4 minutit temperatuurini 95 °C ning SDS-PAGE-le kanti tavaliselt 3% kogu sisendist ja 30% eluaatidest, millele järgnes western blotting anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubikvitiini (1:1000), anti-GSK3<]>��� (1:500) või anti-immuunsüsteemi β-aktiini (1:2000) antikehadega. Kui ekstraktidele ei tehtud immunoprecipitatsiooni, resuspendeeriti sama kogus nendest ekstraktidest saadud üldvalku SDS-proovipuhvris, kuumutati temperatuurini 95 °C, seejärel kanti see otse SDS-PAGE-le ja analüüsiti western-blot-meetodil. (vrd Segref et al. 2020)

Ultraheli lüüs prescise temperatuuri kontrolli all

Täpne ja usaldusväärne temperatuuri reguleerimine on bioloogiliste proovide käitlemisel ülioluline. Kõrged temperatuurid käivitavad proovides termiliselt indutseeritud valkude lagunemise.
Nagu kõik mehaanilised proovide ettevalmistamise tehnikad, tekitab ultrahelitöötlus soojust. Kuid, proovide temperatuuri saab VialTweeteri kasutamisel hästi kontrollida. Tutvustame teile erinevaid võimalusi proovide temperatuuri jälgimiseks ja kontrollimiseks, valmistades neid analüüsimiseks ette VialTweeteri ja VialPressiga.

1. Proovi temperatuuri jälgimine: VialTweeterit juhtiv ultraheli protsessor UP200St on varustatud intelligentse tarkvara ja ühendatava temperatuurianduriga. Ühendage temperatuuriandur UP200St-ga ja sisestage temperatuurianduri ots ühte katseklaasi. Digitaalse värvilise puutetundliku ekraani abil saate UP200St menüüs seadistada oma proovi ultrahelitöötluse jaoks konkreetse temperatuurivahemiku. Ultrasonikaator peatub automaatselt, kui maksimaalne temperatuur on saavutatud, ja peatub, kuni proovi temperatuur on seatud temperatuuri ∆ madalama väärtuseni. Seejärel algab ultrahelitöötlus automaatselt uuesti. See nutikas funktsioon hoiab ära kuumusest põhjustatud lagunemise.
2. VialTweeteri plokki saab eeljahutada. Pange VialTweeteri plokk (ainult sonotrode ilma andurita!) külmkappi või sügavkülma, et titaanplokk eeljahutada, aitab proovi temperatuuri tõusu edasi lükata. Võimaluse korral saab proovi ka ise eeljahutada.
3. Kasutage ultrahelitöötluse ajal jahutamiseks kuiva jääd. Kasutage kuiva jääga täidetud madalat salve ja asetage VialTweeter kuivale jääle, et kuumus saaks kiiresti hajuda.

Leidke oma lüüsirakenduse jaoks optimaalne ultraheli rakkude katkestaja

Hielscher Ultrasonics on pikaajaline kogenud suure jõudlusega ultraheli rakkude häirijate ja homogenisaatorite tootja laboritele, pink-top ja tööstuslikele süsteemidele. Teie bakterirakukultuuri suurus, teie uurimis- või tootmiseesmärk ja töödeldava raku maht tunnis või päevas on olulised tegurid, et leida oma rakenduse jaoks õige ultraheli rakkude katkestaja.
Hielscher Ultrasonics pakub erinevaid lahendusi mitme proovi (kuni 10 viaali) ja massiproovide (st mikrotiiterplaatide / 96-süvendi plaatide) samaaegseks ultrahelitöötluseks, klassikaline sondi tüüpi labori ultrasonikaator, millel on erinevad võimsustasemed vahemikus 50 kuni 400 vatti täielikult tööstuslikele ultraheli protsessoritele kuni 16 000 vatti ühiku kohta kaubanduslike rakkude katkestamiseks ja valgu ekstraheerimiseks suurtes tootmistes. Kõik Hielscheri ultrasonikaatorid on ehitatud 24/7/365 operatsiooni jaoks täiskoormuse all. Töökindlus ja usaldusväärsus on meie ultraheli seadmete põhijooned.
Kõik digitaalsed ultraheli homogenisaatorid on varustatud nutika tarkvara, värvilise puutetundliku ekraani ja automaatse andmete protokollimisega, mis muudavad ultraheli seadme mugavaks töövahendiks laboris ja tootmisrajatistes.
Andke meile teada, milliseid rakke, millise mahuga, millise sagedusega ja millise sihtmärgiga peate oma bioloogilisi proove töötlema. Soovitame teile kõige sobivamat ultraheli rakkude katkestajat teie protsessinõuete jaoks.

Allolev tabel annab teile ülevaate meie ultraheli süsteemide ligikaudsest töötlemisvõimsusest kompaktsetest käeshoitavatest homogenisaatoritest ja MultiSample Ultrasonicators tööstuslikest ultraheli protsessoritest kaubanduslike rakenduste jaoks: