Proteoomika töövood suure läbilaskevõimega valkude lagundamisega

Proteoomika on bioloogiliste protsesside ja süsteemide mõistmiseks oluline valdkond, milles valkude lagundamine on töövoogude kriitiline etapp. Traditsiooniliselt viiakse valkude lagundamine läbi lahuses proteolüütiliste ensüümidega, näiteks trüpsiiniga, mis hüdrolüüsib peptiidsidemeid spetsiifiliselt lüsiini ja arginiini jääkide juures. Selle protsessi käigus tekivad peptiidid, mis sobivad hästi ioniseerimiseks ja fragmenteerimiseks massispektromeetria (MS) rakendustes. Tavapärased lagundamismeetodid vajavad aga lõpuleviimiseks 12–24 tundi, mis tekitab proteoomika töövoogudes olulisi kitsaskohti.
Ultraheli töötlus pakub võimsa alternatiivi, lühendades lagundamisaega dramaatiliselt tundidelt vaid mõne minutini. Kombineerituna täiustatud mitme proovi korraga töötlevate sonikaatoritega, nagu Hielscher CupHorn, VialTweeter ja 96-süvendiline plaadisonikaator UIP400MTP, võimaldab ultraheli töötlus kiirendatud ja suure läbilaskevõimega proteoomikat. Need tehnoloogiad muudavad töövood sujuvamaks, lühendades proovide ettevalmistamise aega ja suurendades efektiivsust, ohverdamata seejuures korratavust ega andmete kvaliteeti.

Ultraheli energia roll valkude lagundamisel

Ultraheli töötlus kasutab fokuseeritud ultraheli laineid kavitatsiooni tekitamiseks – lokaliseeritud mikromullide, mis kokku kukkudes tekitavad intensiivseid nihkejõude. See nähtus parandab massiülekannet, soodustab ensüümide segunemist substraatidega ning avab valkude struktuure, tehes lõikekohad proteolüütilistele ensüümidele, näiteks trüpsiinile, kättesaadavaks.
Tulemus? Lagundamisaja oluline lühenemine, ohverdamata efektiivsust või korratavust.

Ultrahelil põhinev proteolüütiline lagundamine: metoodika ja tulemused

Kiirendatud lagundamisprotokoll

Ultraheli abil toimuv lagundamine ühendab proteolüütilised ensüümid ja ultraheli energia, et töövooge kiirendada. Näiteks seadme Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) kasutamisel kulgeb lagundamise töövoog järgmiselt:

1. Redutseerimine: valguproove (0,5 mg/mL, 20 µL) töödeldakse DTT-ga (2 µL, 110 mM) ammooniumvesinikkarbonaatpuhvris (12,5 mM). Ultraheli töötlust rakendatakse 50% amplituudil 5 minutit.
2. Alküülimine: pärast IAA lisamist (2 µL, 400 mM) korratakse ultraheli töötlust samadel tingimustel.
3. Lagundamine: proovid lahjendatakse ja inkubeeritakse immobiliseeritud trüpsiini sisaldavate nanoosakestega. Lagundamise lõpetab viimane ultraheli töötluse tsükkel (5 minutit). Peptiidid eraldatakse, kuivatatakse ja säilitatakse massispektromeetria (MS) analüüsi jaoks.

See ultraheli meetod lühendab kogu ettevalmistusaega 12 tunnilt alla 30 minuti. Kiirendatud protsessist hoolimata jäävad peptiidide saagis ja kvaliteet samaks kui traditsiooniliste üleöömeetodite puhul.

Ultraheli abil toimuva valkude lagundamise efektiivsus

E. coli proteoome kasutanud võrdlevates uuringutes:

• Valkude identifitseerimine: Ultraheliga lagundatud proovides identifitseeriti 777 valku 5 minutiga, võrreldes 817 valguga 12 tunniga. Ühiselt identifitseeritud valkude osakaal ületas 70%.
• Korratavus: Korduvanalüüsid näitasid korrelatsioonikoefitsiente üle 98% kummagi meetodi sees, mis tõendab töökindlust.
• Selektiivsus: Teatud valke lagundas kumbki meetod eelistatult: ultraheli abil toimuv lagundamine eelistas 65 valku ja üleöölagundamine 54 valku. Sellised nüansirikkad erinevused rõhutavad ultraheli töötluse ainulaadset potentsiaali konkreetsete rakenduste jaoks.

Märgisevaba valkude kvantifitseerimise tulemused seitsme valgu kohta, mis lisati E. coli
proovi. Järgmised valgud lisati kahel erineval tasemel, nagu on märgitud veerus
nimega „Theo Ratio“. Theo Ratio on selles katses kasutatud kahe taseme vaheline teoreetiline
suhe. Veise seerumalbumiin (ALBU), β-laktoglobuliin (LACB), α-S1-kaseiin (CASA1),
α-S2-kaseiin (CASA2), tsütokroom c (CYC), ovalbumiin (OVAL) ja karboanhüdraas 2
(CAH2). Suhted arvutati LFQ valgu intensiivsuste põhjal, mis saadi MaxQuanti
analüüsist. Studenti t-testi rakendati iga meetodiga saadud väärtuste võrdlemiseks (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Uuring ja graafika: © Martins et al., 2019)

Nanoosakestele immobiliseeritud trüpsiin

Immobiliseeritud trüpsiini sisaldavate nanoosakeste (nt T-FMNP-de) integreerimine ultraheli töötlusega parandab proteoomikatöövoogusid veelgi. Need nanoosakesed pakuvad ensüümi ja substraadi vastasmõjudeks suurt pindala, mis suurendab efektiivsust. Kompleksete proteoomide, näiteks E. coli proteoomi puhul saavutab kombineeritud meetod järgmist:

• Kiirus: Täielik lagundamine 5 minuti jooksul.
• Täpsus: Traditsiooniliste meetoditega võrreldav valkude kvantifitseerimine (p > 0,01, n=3).
• Skaleeritavus: Kohandamine mitme kuoluga plaatidele, nagu UIP400MTP, võimaldab suure läbilaskevõimega töötlust.

Klõpsake siin üksikasjaliku samm-sammulise protokolli nägemiseks!
(vrd Martins et al., 2019)

Proteolüütiline lagundamine suure kiiruse ja suure läbilaskevõimega Hielscheri sonikaatoritega

Parimad sonikaatorimudelid proteoomikaks

Hielscher Ultrasonics pakub erinevaid sonikaatorimudeleid mitme proovi samaaegseks ettevalmistuseks, mis hõlbustab suure läbilaskevõimega töövooge. Olenemata sellest, kas töötate viaalide, katsutite, mitme kuoluga plaatide (nt 6-, 24-, 96-kuolulised plaadid) või Petri tassidega – pakume teie katsetele sobivaimaid sonikaatoreid.

UIP400MTP mitme kuoluga plaatide sonikaator

Maksimaalse läbilaskevõime tagamiseks võimaldab UIP400MTP töödelda 96-kuolulisi plaate ultraheli abil. UIP400MTP sobib kõigile standardsetele mikroplaatidele, ei vaja kalleid patenteeritud ühekordseid tarvikuid ning annab teile vabaduse valida oma uuringuteks parim mitme kuoluga plaat. Edastades energiat plaadil ühtlaselt, võimaldab see kuni 200 kompleksse proteoomi kiiret redutseerimist, alküülimist ja lagundamist vaid 1 tunniga. Selline automatiseerituse ja efektiivsuse tase on suure läbilaskevõimega proteoomika ja kliiniliste rakenduste jaoks ülioluline. Lisateave mitme kuoluga plaatide sonikaatori kohta!

VialTweeter

VialTweeter on mõeldud laboritele, kus on vaja korraga sonikeerida kuni 10 viaali või katsutit. Selle mittesissetungiv lähenemine kõrvaldab ristsaastumise riskid, tagades samal ajal korduvalt reprodutseeritava valkude lagundamise. See seade sobib ideaalselt teadlastele, kes töötavad piiratud proovimahtude või mitmesuguste proovitüüpidega.
Lisateave mitme tuubi sonikaatori VialTweeter kohta!

Hielscher UP200St-CupHorn

Sonikaator CupHorn on võimas seade, mis on mõeldud mitme proovi samaaegseks töötlemiseks suletud mahutites. See tagab ühtlase ultraheli energia jaotuse ja täpse temperatuuri reguleerimise. Võime töödelda samaaegselt kuni viit proovi ning ühilduvus redutseerimist, alküülimist ja lagundamist hõlmavate töövoogudega muudavad sonikaatori CupHorn usaldusväärseks vahendiks massispektromeetrial (MS) põhinevas proteoomikas.
Lisateave CupHorn SonoReactori kohta!

Samm-sammuline protokoll ultraheli abil toimuvaks proteolüütiliseks lagundamiseks nanoosakestega immobiliseeritud trüpsiiniga

See Martinsi et al. (2019) protokoll on optimeeritud kiireks valkude lagundamiseks ultraheli energia ja nanoosakestega immobiliseeritud trüpsiini (T-FMNP-d) abil. Kirjeldatud sammud tagavad tõhusa redutseerimise, alküülimise ja proteolüüsi, mis sobivad massispektromeetria (MS) rakendustele.
Protokolli sammud

1. Disulfiidsidemete redutseerimine
   • Lisage 2 µL DTT lahust (110 mM) 20 µL valguproovile (0,5 mg/mL) AmBic puhvris.
   • Asetage proovitoru sonoreaktorisse UP200St-CupHorn.
   • Sonikeerige proovi 2,5 minutit 50% amplituudil (200 W, 26 kHz).
   • Tehke lühike paus jahtumiseks ja sonikeerige seejärel samadel tingimustel veel 2,5 minutit.
2. Redutseeritud tsüsteiinijääkide alküülimine
   • Lisage redutseeritud valguproovile 2 µL IAA lahust (400 mM).
   • Alküülimise soodustamiseks sonikeerige 2,5 minutit 50% amplituudil.
   • Tehke paus jahtumiseks ja sonikeerige seejärel veel 2,5 minutit.

   Märkus: IAA lagunemise vältimiseks minimeerige alküülitud proovi kokkupuudet valgusega.

3. Proovi lahjendamine
   • Lahjendage alküülitud valguproov lõppmahuni 100 µL, kasutades 25 mM AmBic puhvrit, mis sisaldab 4% atsetonitriili (v/v).
   • Segage põhjalikult õrna pipeteerimisega.
4. Proteolüütiline lagundamine nanoosakestega immobiliseeritud trüpsiiniga
   • Lisage lahjendatud valguproovile 20 µL T-FMNP lahust (3 mg/mL).
   • Sonikeerige segu sonoreaktoris 2,5 minutit 50% amplituudil.
   • Tehke jahutamiseks paus ja sonikeerige seejärel veel 2,5 minutit samadel tingimustel.
5. Trüpsiini nanoosakeste eraldamine
   • Kasutage magnetit, et eraldada T-FMNP-d seedunud peptiide sisaldavast supernatandist.
   • Kandke supernatant uude mikrotsentrifuugitorusse.
6. Peptiidide ettevalmistamine massispektromeetria (MS) analüüsiks
   • Kuivatage peptiide sisaldav supernatant vaakumtsentrifuugis.
   • Hoidke kuivatatud peptiide temperatuuril -20°C kuni edasise massispektromeetrilise analüüsini.