Proteoomilised töövood suure läbilaskevõimega valgu seedimisega

Proteoomika on oluline valdkond bioloogiliste protsesside ja süsteemide mõistmiseks, kusjuures valkude seedimine moodustab selle töövoogudes kriitilise sammu. Traditsiooniliselt viiakse valgu lagundamine läbi lahuses, kasutades proteolüütilisi ensüüme nagu trüpsiin, mis hüdrolüüsib peptiidsidemeid lüsiini ja arginiini jääkides. See protsess tekitab peptiide, mis sobivad hästi ionisatsiooniks ja killustumiseks massispektromeetria (MS) rakendustes. Kuid tavapärased seedimismeetodid nõuavad lõpuleviimiseks 12–24 tundi, tekitades proteoomilistes töövoogudes olulisi kitsaskohti.
Ultraheli pakub võimsat alternatiivi, lühendades dramaatiliselt seedimisaega tundidest vaid mõne minutini. Kombineerituna täiustatud mitme prooviga sonikaatoritega, nagu Hielscher CupHorn, VialTweeter ja 96-süvendi plaadi sonikaatori UIP400MTP, võimaldab ultraheliuuring kiirendatud, suure läbilaskevõimega proteoomikat. Need tehnoloogiad muudavad töövood sujuvamaks, vähendades proovide ettevalmistamise aega ja suurendades tõhusust, ilma et see kahjustaks reprodutseeritavust või andmete kvaliteeti.

Ultraheli energia roll valgu seedimisel

Ultraheli kasutab kavitatsiooni loomiseks fokuseeritud ultraheli laineid - lokaliseeritud mikromulle, mis varisevad kokku, et tekitada intensiivseid nihkejõude. See nähtus suurendab massiülekannet, soodustab ensüümide segunemist substraatidega ja avab valgu struktuure, paljastades lõhustumiskohad proteolüütilistele ensüümidele nagu trüpsiin.
Tulemus? Seedeaja märkimisväärne lühendamine, ilma et see kahjustaks tõhusust või reprodutseeritavust.

Ultraheliga täiustatud proteolüütiline seedimine: metoodika ja tulemused

Kiirendatud seedimise protokoll

Ultraheli abil seedimine ühendab proteolüütilised ensüümid ja ultraheli energia, et kiirendada töövooge. Näiteks, kasutades Hielscher UP200St-CupHorni (200 W, 26 kHz), toimub seedimise töövoog järgmiselt:

1. Redutseerimine: valguproove (0,5 mg/ml, 20 μL) töödeldakse DTT-ga (2 μL, 110 mM) ammooniumvesinikkarbonaadi puhvris (12,5 mM). Sonikatsiooni rakendatakse 50% amplituudiga 5 minutit.
2. Alküülimine: Pärast IAA lisamist (2 μL, 400 mM) korratakse ultrahelitöötlust samadel tingimustel.
3. Seedimine: Proovid lahjendatakse ja inkubeeritakse immobiliseeritud trüpsiini nanoosakestega. Ultrahelitöötluse viimane voor (5 minutit) lõpetab seedimise. Peptiidid eraldatakse, kuivatatakse ja säilitatakse MS-analüüsiks.

See ultraheli meetod vähendab kogu ettevalmistusaega 12 tunnilt alla 30 minuti. Vaatamata kiirendatud protsessile jäävad peptiidi saagis ja kvaliteet traditsiooniliste üleöö meetoditega kooskõlla.

Ultraheli valgu seedimise tõhusus

Võrdlevates uuringutes, kus kasutatakse E. coli proteoome:

• Valgu identifitseerimine: Ultraheli lagundatud proovid tuvastasid 5 minuti jooksul 777 valku, võrreldes 817-ga 12 tunni jooksul. Jagatud valgu identifitseerimine ületas 70%.
• Reprodutseeritavuse: Korduvad analüüsid näitasid, et korrelatsiooniväärtused olid iga meetodi puhul üle 98%, mis näitab usaldusväärsust.
• Selektiivsus: Teatud valgud lagundati eelistatult iga meetodiga, ultraheli seedimine soodustas 65 valku ja üleöö seedimist 54 valku. Sellised nüansirikkad erinevused rõhutavad ultraheli ainulaadset potentsiaali konkreetsete rakenduste jaoks.

Märgistuseta valgu kvantifitseerimise tulemused seitsmest E. coli'ks lisatud valgust
Proovi. Järgmised valgud lisati kahel erineval tasemel, nagu on märgitud kolonnis
nimega "Theo Ratio". Theo suhe on teoreetiline suhe kahe selles kasutatava taseme vahel
eksperiment. Veiste seerumi albumiin (ALBU), β-laktoglobuliin (LACB), α-S1 kaseiin (CASA1),
α-S2 kaseiin (CASA2), tsütokroom c (CYC), ovalbumiin (OVAL) ja karboanhüdraas 2
(CAH2). Suhtarvud arvutati MaxQuantist saadud LFQ valgu intensiivsuse abil
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Uuring ja graafik: © Martins et al., 2019)

Nanoosakesed-immobiliseeritud trüpsiin

Immobiliseeritud trüpsiini nanoosakeste (nt T-FMNP) integreerimine ultraheliga suurendab veelgi proteoomika töövooge. Need nanoosakesed tagavad ensüümi ja substraadi interaktsioonide suure pindala, suurendades efektiivsust. Komplekssete proteoomide, näiteks E. coli puhul saavutatakse kombineeritud meetodiga:

• Kiirus: Täielik seedimine 5 minuti jooksul.
• Täpsus: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Mastaapsus: Kohandamine mitme kaevuga platvormidele, nagu UIP400MTP, võimaldab suure läbilaskevõimega töötlemist.

Üksikasjaliku protokolli saamiseks koos samm-sammult juhistega klõpsake siin!
(vrd Martins et al., 2019)

Proteolüütiline lagundamine suure kiirusega ja suure läbilaskevõimega Hielscheri sonikaatoritega

Parimad sonikaatori mudelid proteoomika jaoks

Hielscher Ultrasonics pakub erinevaid sonikaatori mudeleid samaaegseks mitme proovi ettevalmistamiseks, hõlbustades suure läbilaskevõimega töövooge. Kas te töötate viaalide, katseklaaside, mitmeauguliste taldrikutega (nt 6-, 24-, 96-augulised taldrikud) või Petri tassidega – Pakume teile katsete jaoks ideaalseid sonikaatorid.

UIP400MTP mitme kaevuga plaadi sonikaator

Lõpliku läbilaskevõime tagamiseks annab UIP400MTP võimaluse töödelda 96-süvendi plaate ultraheliga. Ühildub mis tahes standardse mikroplaadiga, UIP400MTP ei vaja kalleid patenteeritud ühekordselt kasutatavaid materjale ja annab teile vabaduse valida oma uurimistööks parim mitme kaevuga plaat. Pakkudes ühtlast energiat kogu plaadil, võimaldab see kuni 200 kompleksse proteoomi kiiret vähendamist, alküülimist ja seedimist vaid 1 tunniga. See automatiseerimise ja tõhususe tase on suure läbilaskevõimega proteoomika ja kliiniliste rakenduste jaoks ülioluline. Lisateave mitme kaevuga plaadi sonikaatori kohta!

VialTweeter

VialTweeter on kohandatud laboritele, mis vajavad samaaegset ultrahelitöötlust kuni 10 viaali või katseklaasiga. Selle mitteinvasiivne lähenemisviis kõrvaldab ristsaastumise ohu, tagades samal ajal valkude paljundatava kääritamise. See seade sobib ideaalselt teadlastele, kes töötavad piiratud proovimahtude või mitmekesiste proovitüüpidega.
Lisateave VialTweeteri mitme toruga sonikaatori kohta!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorni sonikaator on võimas seade, mis on mõeldud mitme proovi samaaegseks töötlemiseks suletud mahutites. See tagab ühtlase ultraheli energiajaotuse ja täpse temperatuuri reguleerimise. Võimalus töödelda samaaegselt kuni viit proovi koos selle ühilduvusega vähendatud, alküülitud ja seeditud töövoogudega muudab CupHorni usaldusväärseks tööriistaks MS-põhise proteoomika jaoks.
Lisateave CupHorn SonoReactori kohta!

Samm-sammuline protokoll ultraheli abil proteolüütiliseks seedimiseks, kasutades nanoosakestega immobiliseeritud trüpsiini

(2019) on optimeeritud kiireks valgu seedimiseks, kasutades ultraheli energiat ja nanoosakeste immobiliseeritud trüpsiini (T-FMNP). Kirjeldatud sammud tagavad tõhusa redutseerimise, alküülimise ja proteolüüsi, mis sobib massispektromeetria (MS) rakendusteks.
Protokolli sammud

1. Disulfiidsidemete vähendamine
   • 20 μL valguproovile (0,5 mg/ml) lisatakse AmBici puhvris 2 μL DTT lahust (110 mM).
   • Asetage katseklaas sonoreactor UP200St-CupHorni.
   • Sonikeerige proovi 2,5 minutit 50% amplituudiga (200 W, 26 kHz).
   • Jahutamiseks peatage lühike intervall, seejärel sonikeerige samadel tingimustel veel 2,5 minutit.
2. Redutseeritud tsüsteiinijääkide alküülimine
   • Redutseeritud valguproovile lisatakse 2 μL IAA lahust (400 mM).
   • Sonikeerige 2,5 minutit 50% amplituudiga, et hõlbustada alküülimist.
   • Peatage jahutamiseks, seejärel sonikeerige veel 2,5 minutit.

   Märkus: Alküülitud proovi kokkupuude valgusega viiakse miinimumini, et vältida IAA lagunemist.

3. Proovi lahjendamine
   • Alküülitud valguproov lahjendatakse lõppmahuni 100 μL, kasutades 25 mM AmBic-puhvrit, mis sisaldab 4% atsetonitriili (v/v).
   • Segage hoolikalt õrnalt pipeteerides.
4. Proteolüütiline seedimine nanoosakestega immobiliseeritud trüpsiiniga
   • Lahjendatud valguproovile lisatakse 20 μL T-FMNP lahust (3 mg/ml).
   • Sonikeerige segu sonoreaktoris 2,5 minutit 50% amplituudiga.
   • Paus jahutamiseks, seejärel sonikeerige veel 2,5 minutit samadel tingimustel.
5. Trüpsiini nanoosakeste eraldamine
   • T-FMNP-de eraldamiseks lagundatud peptiide sisaldavast supernatandist kasutatakse magnetit.
   • Supernatant viiakse uude mikrotsentrifuugiküvetti.
6. Peptiidide ettevalmistamine MS-analüüsiks
   • Peptiide sisaldav supernatant kuivatatakse vaakumtsentrifuugis.
   • Kuivatatud peptiide säilitatakse -20 °C juures kuni edasise analüüsini massispektromeetriliselt.