Sonikeerimisega toetatud valkude ekstraheerimine fosfoproteoomikas

Kaasaegses bioloogiateaduses on fosfoproteoomika kujunenud nurgakiviks tehnoloogiaks, mis võimaldab dešifreerida rakusiseseid signaaliradu ja mõista haiguste mehhanisme süsteemitasandil. Kuna fosforüleerimine reguleerib olulisi bioloogilisi funktsioone – alates ensüümide aktiivsusest kuni valk-valk interaktsioonideni –, on selle täpne mõõtmine hädavajalik nii alusuuringutes kui ka translatiivses meditsiinis. Massispektromeetria viimased edusammud on võimaldanud tuvastada ühes katses kümneid tuhandeid fosforüleerimissündmusi, rõhutades vajadust töökindlate, skaleeritavate ja reprodutseeritavate proovide ettevalmistamise töövoogude järele.
Kõige mõjuvamate arengute hulka selles valdkonnas kuulub sonikeerimisega toetatud valkude ekstraheerimise kasutuselevõtt, mis parandab oluliselt proovide kvaliteeti, läbilaskevõimet ja reprodutseeritavust. Ultraheli tehnoloogiad, nagu VialTweeter ja UIP400MTP, defineerivad praegu ümber, kuidas laborid suuri proovikohorte käsitlevad, eriti suure läbilaskevõimega fosfoproteoomikas.

Tõhusa proovide ettevalmistamise teaduslik tähtsus fosfoproteoomikas

Valkude fosforüleerimine on väga dünaamiline ja pöörduv translatsioonijärgne modifikatsioon, mis mõjutab enamikku inimrakkude valke. See reguleerib valkude struktuuri, lokalisatsiooni ja interaktsioonivõrgustikke ning selle düsregulatsioon on seotud haigustega, nagu vähk ja neurodegeneratsioon.
Siiski kaasnevad fosfoproteoomilise analüüsiga ainulaadsed tehnilised väljakutsed. Fosforüleeritud peptiide on sageli vähe ja need vajavad hoolikat rikastamist ning väga tõhusat eelnevat proovide ettevalmistamist. Igasugune ebatõhusus valkude ekstraheerimisel või lõhustamisel võib põhjustada signaalikadu, halba reprodutseeritavust ja mittetäielikku fosfosaitide katvust.
Siin muutub ultraheli töötlus (sonikeerimine) otsustavaks.

Miks sonikeerimine muudab valkude ekstraheerimist

Sonikeerimine kasutab suure intensiivsusega ultrahelilaineid rakkude ja kudede mehaaniliseks lõhkumiseks, mis võimaldab tõhusat valkude vabastamist rakkudest, kudedest, biovedelikest ja rakuvälistest vesiikulitest. Võrreldes tavapäraste lüüsimismeetoditega pakub sonikeerimine mitmeid selgeid eeliseid:

• Esiteks tagab see kiire ja ühtlase rakkude lõhkumise (desintegreerimise), mis on eriti oluline mööduvate fosforüleerimisseisundite säilitamiseks. Fosfoproteoomikas võivad isegi väikesed viivitused või mittetäielik lüüs muuta signaaliprofiile, mistõttu on kiire ja reprodutseeritav ekstraheerimine hädavajalik.
• Teiseks parandab sonikeerimine valgusaagist ja solubiliseerimist, eriti raskesti lüüsitavate proovide puhul, nagu tihedad koed või membraanirikkad rakud. See toob otseselt kaasa parema järgneva lõhustamise ja fosfopeptiidide taaskasutuse.
• Kolmandaks on ultraheli töötlus oma olemuselt skaleeritav. Seadmed, nagu VialTweeter, võimaldavad mitut suletud tuubi korraga sonikeerida, tagades proovide vahel identsed töötlemistingimused. See kõrvaldab käsitsi käsitsemisest tuleneva varieeruvuse.
• Veelgi suurema läbilaskevõime nõuete korral kujutab UIP400MTP endast olulist tehnoloogilist hüpet. See võimaldab otse sonikeerida tervet mikroplaati või tuubialuseid, sealhulgas autosampleri viaale, muutes selle ideaalseks sadade proovide paralleelseks töötlemiseks. See võimekus on eriti väärtuslik süsteemibioloogias ja kliinilistes uuringutes, kus suured proovikohordid on tavapärased.

Suure läbilaskevõimega sonikeerimine: VialTweeter ja UIP400MTP lähivaates

Täiustatud ultraheliseadmete integreerimine fosfoproteoomilistesse töövoogudesse ei ole pelk mugavus – see on metodoloogiline täiustus.
VialTweeter on mõeldud mitme suletud viaali sünkroniseeritud ultraheli töötluseks, minimeerides ristsaastumist ja tagades samal ajal reprodutseeritavuse. See sobib eriti keskmise läbilaskevõimega rakendusteks ja standardiseeritud töövoogudeks.

Vastupidiselt on UIP400MTP optimeeritud suure läbilaskevõimega keskkondadele, võimaldades:

• Ühtlane ultraheli töötlus kogu standardsete mikroplaatide ulatuses, nt 96- või 384-kannuga plaatidel
• Katsutiraamide ja automaatsüstla viaalide otsene töötlemine
• Käsitsitöö aja märkimisväärne vähenemine
• Parem korratavus suurtes andmekogumites

See skaleeritavus sobib suurepäraselt kaasaegsete fosfoproteoomika lähenemisviisidega, kus töövoogudes töödeldakse rutiinselt paralleelselt kümneid kuni sadu proove.

Ultraheli töötlusega toetatud fosfoproteoomilise proovide ettevalmistamise üldprotokoll

Töökindel fosfoproteoomiline töövoog hõlmab tõhusat valgu ekstraktsiooni, ensümaatilist lagundamist ja fosfopeptiidide rikastamist. Järgnev ülevaade kajastab väljakujunenud parimaid tavasid, mis on kohandatud ultraheli töötlusel (sonikeerimisel) põhinevale proovide ettevalmistamisele:

1. Proovide kiire kvenšimine ja kogumine
   Rakud või koed kvenšitakse kiiresti – tavaliselt hetkkülmutamise teel –, et säilitada fosforüleerumise olekud. See etapp on otsustava tähtsusega, kuna fosforüleerumissündmused on mööduva iseloomuga.
2. Rakkude ultraheli lüüs ja valgu ekstraktsioon
   Proovid sulatatakse ja allutatakse ultraheli töötlusele (sonikeerimisele), tavaliselt lühikeste tsüklitena. Ultraheli energia lõhub rakumembraanid ja vabastab valgud tõhusalt. Valideeritud töövoogudes tehakse ultraheli töötlus mitme tsüklina, et tagada täielik lüüs.
   Näide: pärast proovide sulatamist jääl viidi rakkude lüüs läbi ultraheli töötlusega, nt instrumendiga Vialtweeter 2 tsüklit, igaüks 1 min.
3. Selitamine ja valgu kvantifitseerimine
   Pärast lüüsi tsentrifuugitakse proovid prahi eemaldamiseks. Lahustuvaid valke sisaldav supernatant kogutakse ja kvantifitseeritakse, et tagada proovide ühtlane sisend.
4. Redutseerimine ja alküülimine
   Disulfiidsidemed redutseeritakse (nt DTT abil) ja alküülitakse (nt IAA abil), et stabiliseerida valke ja parandada lagundamise efektiivsust.
5. Proteolüütiline lagundamine
   Valgud lagundatakse ensümaatiliselt, tavaliselt trüpsiiniga, mille tulemusel tekivad massispektromeetriliseks analüüsiks sobivad peptiidid. Loe lähemalt ultraheliga kiirendatud valgu lagundamise kohta!
6. Peptiidide puhastamine ja soolade eemaldamine
   Peptiidid puhastatakse C18-põhiste meetoditega, et eemaldada lisandid, mis võiksid LC-MS analüüsi segada.
7. Fosfopeptiidide rikastamine
   Arvestades fosforüleeritud peptiidide väikest sisaldust, kasutatakse fosfopeptiidide selektiivseks eraldamiseks rikastamistehnikaid, näiteks Fe-NTA või TiO₂ afiinsusmeetodeid.
8. LC-MS/MS analüüs ja andmetöötlus
   Rikastatud proove analüüsitakse kõrglahutusega massispektromeetria abil, sageli kasutades andmetest sõltumatut analüüsi (DIA), et parandada kvantifitseerimist ja korratavust.

Eriti väärib märkimist, et suuremahulisi töövooge saab kohandada 96-kannuga plaadi formaatidele, mis võimaldab paralleelselt töödelda kuni sadu proove – lähenemisviis, mis sobib täielikult kokku ultraheli töötlusega, mis põhineb seadmel UIP400MTP.

Optimeeritud protokoll fosfoproteoomi kiireks kvenšimiseks, fosfopeptiidide rikastamiseks ja meetodi Phos-DIA-MS jaoks.
Protokoll ja pilt: ©Die et al. 2023

Korratavuse ja andmekvaliteedi parandamine ultraheli töötluse abil

Fosfoproteoomika üks keskseid väljakutseid on ühtlase kvantifitseerimise saavutamine suurtes andmekogumites. Proovide ettevalmistamisel tekkiv varieeruvus võib varjata bioloogiliselt tähendusrikkaid erinevusi.

Ultraheli töötlus lahendab selle, tagades:

1. Proovideülese standardiseeritud energiasisendi
2. Väiksema käsitsitööst tuleneva varieeruvuse
3. Parema korratavuse valgu ekstraktsioonis ja lagundamises

Koos suure läbilaskevõimega platvormidega, nagu UIP400MTP, saavutavad laborid ühtlustaseme, mis on süsteemibioloogia uuringute ja kliiniliste biomarkerite avastamise jaoks hädavajalik.

Fosfoproteoomika tulevik: automatiseerimine ja skaleeritavus

Kuna fosfoproteoomika laieneb pidevalt suuremahulistele ja kliinilistele rakendustele, kasvab ainult nõudlus automatiseerimise ja läbilaskevõime järele. Ultraheli töötlusel (sonikeerimisel) põhinev proovide ettevalmistus, eriti kui see on integreeritud mikroplaatidega ühilduvatesse süsteemidesse, on oluline võtmetehnoloogia.
Ühendades tõhusa ultraheli abil toimuva lüüsi, paralleelse töötlemise ja ühilduvuse automatiseeritud töövoogudega, kehtestavad sellised seadmed nagu VialTweeter ja UIP400MTP uusi standardeid proteoomika proovide ettevalmistuses.
Loe lähemalt UIP400MTP integreerimisest automatiseeritud laboritöövoogudesse!

Kasutage ära ultraheli abil toimuva proovide ettevalmistuse eeliseid fosfoproteoomikas!

Ultraheli abil toimuvast valgu ekstraktsioonist (sonikeerimisest) on saanud kaasaegse fosfoproteoomika oluline osa, mis pakub võrreldamatut tõhusust, skaleeritavust ja reprodutseeritavust. Kasvava vajaduse tõttu analüüsida keerukaid bioloogilisi süsteeme suurtes proovikohortides ei ole ultraheli tehnoloogiad mitte ainult kasulikud – need on hädavajalikud.
Tänu suure läbilaskevõimega standardiseeritud töövoogude võimaldamisele kiirendavad lahendused nagu VialTweeter ja UIP400MTP avastusi rakusignaalides, haigusmehhanismides ja täppismeditsiinis.

Disain, tootmine ja konsulteerimine – Saksamaal valmistatud kvaliteet

Hielscheri ultraheli seadmed on tuntud oma kõrgeima kvaliteedi ja disainistandardite poolest. Töökindlus ja lihtne kasutamine võimaldavad meie ultraheli seadmete sujuvat integreerimist tööstusrajatistesse. Hielscheri ultraheli seadmed tulevad hõlpsasti toime karmide tingimuste ja nõudlike keskkondadega.

Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifitseeritud ettevõte ja pöörab erilist tähelepanu suure jõudlusega ultraheli seadmetele, mis on varustatud tipptehnoloogia ja kasutajasõbralikkusega. Loomulikult vastavad Hielscheri ultraheli seadmed CE nõuetele ning täidavad UL-i, CSA ja RoHs nõudeid.

Hielscheri multiproovi sonikaatorite mudelid UIP400MTP mikroplaatidele, VialTweeter ja CupHorn: kiire ja suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistus