Parafiinist vabastamine ja valkude ekstraheerimine FFPE-proovidest

Hõlbustage valkude ekstraheerimist formaliiniga fikseeritud parafiini sisse topitud (FFPE) koelõikudest, kasutades parafiinist vabastamise, solubiliseerimise ja mitme tuubi ultraheliseadmega VialTweeter tehtava ultraheli töötluse (sonikeerimise) optimeeritud kombinatsiooni. See protokoll toetab massispektromeetrial põhinevat proteoomikat ning sobib kokku SP3 puhastuse ja ensümaatilise lagundamise töövoogudega.

See SOP on mõeldud laborispetsialistidele, kes tegelevad FFPE koeproovide proteoomse analüüsiga suure jõudlusega ultraheli töötluse abil. See on optimeeritud kuni kümne FFPE proovi paralleelseks töötlemiseks mitme tuubi sonikaatoriga VialTweeter.

Protokoll: valkude ekstraheerimine FFPE proovidest seadmega VialTweeter

Materjalid ja reagendid

Reagendid

• Ksüleen (histoloogiline kvaliteet)
• Etanool (absoluutne 96%)
• Lüüsipuhver:

6 M guanidiinvesinikkloriid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (tris(2-karboksüetüül)fosfiin)
40 mM CAA (2-kloroatseetamiid)

• Proteaasi inhibiitor (valikuline; nt cOmplete™ mini EDTA-free)

Seadmed

• VialTweeter mitme tuubi ultraheli homogenisaator
• 1,5 mL või 2,0 mL madala seondumisega mikrotsentrifuugitorud
• Kuumutusblokk või inkubaator (95°C ja 80°C seaded)
• Mikrotsentrifuug
• Thermomixer (valikuline, kuid soovitatav)

Proovi kogus

• 1–2 lõiku 10 µm paksust FFPE kudet proovi kohta (st ühe tuubi kohta)

VÕI

• Kokku ~100 µg kudet proovi kohta (st ühe tuubi kohta)

Märkus: mikrotoomia jaoks kasutage värskeid tera, et minimeerida parafiinijääkidega saastumist.

Protseduur

1. Parafiinist vabastamine
   1. Viige FFPE lõigud madala seondumisega mikrotsentrifuugitorudesse.
   2. Lisage 1 mL ksüleeni, vorteksige lühidalt.
   3. Inkubeerige 10 minutit toatemperatuuril.
   4. Tsentrifuugige 14 000 × g juures 2 minutit; visake supernatant ära.
   5. Korrake ksüleeniga pesu veel üks kord (sammud 2–4).
   6. Peske sadet 1 mL 96% etanooliga, vorteksige ja seejärel tsentrifuugige 14 000 × g juures 2 minutit. Visake supernatant ära.
   7. Korrake etanooliga pesu veel üks kord (kokku 2 etanoolipesu).
   8. Kuivatage sadet õhu käes 10 minutit toatemperatuuril avatud kaantega, et jääketanool aurustuks.
2. Valkude ekstraheerimine ja ultraheli töötlus
   1. Lisage igale kuivale sadele 200 µL lüüsipuhvrit.

      Märkus: kuigi sonikaator mahutab kuni 1 mL, on järgnevaks töötlemiseks optimaalne 200 µL.

   2. Segage vorteksimise või õrna pipeteerimisega.
3. Esimene termiline inkubatsioon
   1. Inkubeerige tuube 95 °C juures 30 min, loksutades kiirusel 400 rpm termomikseri või kuumutusbloki abil.
   2. Laske proovidel toatemperatuuril 5 min jahtuda.
4. Esimene ultraheli töötlus seadmega VialTweeter
   1. Asetage tuubid seadmesse VialTweeter.
   2. Seadke VialTweeter UP200St allpool toodud väärtustele ja teostage ultraheli töötlus.
Sonikaatori seaded
• Seadke amplituud (A) väärtusele 100%
• Seadke pulsatsioonirežiim (C) väärtusele 100%
• Perioodikell: sees
• Sisselülitusaeg: 60s
• Väljalülitusaeg: 30s
• Piirväärtus: 15 min (vastab 10 tsüklile)
(Arvutusmärkus: (60 s sees + 30 s väljas) × 10 tsüklit = 900 s = 15 min)
5. Teine termiline inkubatsioon
   Eemaldage tuubid ja inkubeerige uuesti 95 °C juures 15 min, 400 rpm.
6. Teine ultraheli töötlus
   Korrake ultraheli töötlust seadmega VialTweeter samade seadetega (nagu ülal) veel 10 tsükli jooksul (kokku 15 min).
7. Lüsaadi selitamine
   1. Tsentrifuugige proove 13 000 × g juures 10 min temperatuuril 23°C (toatemperatuur).
   2. Koguge supernatant ettevaatlikult uude 2,0 mL Safe-lock Eppendorfi tuubi. Vältige sademe häirimist.
8. Järgnev töötlus
   Lüsaat on nüüd valmis SP3 puhastuseks ja ensümaatiliseks lagundamiseks.

Märkused ja head tavad

1. Ülekuumenemise ohtu ultraheli töötluse ajal vähendab programmeeritud SEES/VÄLJAS tsüklite kasutamine.
2. Vältige vorteksimist pärast ultraheli töötlust, et vältida valkude agregeerumist.

Jäätmete kõrvaldamine ja ohutus

Allolev tabel annab ülevaate meie laborimõõtmetes ultraheli seadmete ligikaudsest töötlemisvõimsusest: