Deparafiiniseerimine ja valkude ekstraheerimine FFPE-st

Hõlbustage valgu ekstraheerimist formaliiniga fikseeritud parafiiniga manustatud (FFPE) koelõikudest, kasutades optimeeritud kombinatsiooni deparafiiniseerimisest, lahustumisest ja ultrahelitöötlusest VialTweeteri mitmetorulise ultrasonikaatoriga. See protokoll toetab allavoolu massispektromeetrial põhinevat proteoomikat ning ühildub SP3 puhastamise ja ensümaatilise seedimise töövoogudega.

See SOP on mõeldud laboritöötajatele, kes tegelevad FFPE koeproovide proteoomilise analüüsiga, kasutades suure jõudlusega ultrahelitöötlust. See on optimeeritud kuni kümne FFPE proovi jaoks, mida töödeldakse paralleelselt, kasutades VialTweeter Multi-Tube Sonicatorit.

Protokoll: Valgu ekstraheerimine FFPE proovidest VialTweeteri abil

Materjalid ja reaktiivid

Reaktiivid

• Ksüleen (histoloogiline aste)
• Etanool (absoluutne 96%)
• Lüüsi puhver:

6 M Guanidiinvesinikkloriid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (tris(2-karboksütüül)fosfiin)
40 mM CAA (2-kloroatsetamiid)

• Proteaasi inhibiitor (valikuline; nt cOmplete™ mini EDTA-vaba)

Varustus

• VialTweeter mitme toruga ultrasonikaator
• 1,5 ml või 2,0 ml madala siduvusega mikrotsentrifuugitorud
• Soojusplokk või inkubaator (95 °C ja 80 °C seadistused)
• Mikrotsentrifuug
• Termomikser (valikuline, kuid soovitatav)

Sisendi näidis

• 1–2 lõiku 10 μm paksusest FFPE koest proovi kohta (st viaali kohta)

või

• Kokku ~100 μg kude proovi kohta (st viaali kohta)

Märge: Kasutage mikrotoomia jaoks värskeid terasid, et minimeerida parafiinijäätmete saastumist.

Menetlus

1. deparafiniseerimine
   1. FFPE sektsioonid viiakse madala siduvusega mikrotsentrifuugitorudesse.
   2. Lisage korraks 1 ml ksüleeni, keeris.
   3. Inkubeerige 10 minutit toatemperatuuril.
   4. Tsentrifuugitakse 14 000 × g juures 2 minutit; visake supernatant ära.
   5. Korrake ksüleenpesu veel üks kord (sammud 2–4).
   6. Peske graanuleid 1 ml 96% etanooliga, keeris, seejärel tsentrifuugige 14 000 × g juures 2 minutit. Visake supernatant ära.
   7. Korrake etanoolipesu veel kord (kokku 2 etanoolipesu).
   8. Kuivatage graanulit 10 minutit õhu käes toatemperatuuril avatud kaantega, et aurustada etanoolijäägid.
2. Valgu ekstraheerimine ja ultrahelitöötlus
   1. Igale kuivale graanulile lisatakse 200 μl lüüsipuhver.
      Märge: Kuigi ultraheligaator mahutab kuni 1 ml, on 200 μL optimaalne allavoolu töötlemiseks.

   2. Segage vortekseerimise või õrna pipeteerimise teel.
3. Esimene termiline inkubatsioon
   1. Katseklaase inkubeeritakse temperatuuril 95 °C 30 minutit, loksutades kiirusel 400 pööret minutis, kasutades termosegisti või soojusplokki.
   2. Lase proovidel 5 minutit toatemperatuuril jahtuda.
4. Esimene ultrahelitöötlus VialTweeteriga
   1. Asetage torud VialTweeterisse.
   2. Seadke VialTweeter UP200St allolevatele väärtustele ja ultraheliga.
Sonicatori seaded
• Seadke amplituud (A) väärtusele 100%
• Seadke pulsatsioonirežiimiks (C) 100%
• Perioodi kell: sees
• Õigel ajal: 60s
• Väljalülitusaeg: 30s
• Piirväärtus: 15 min (vastab 10 tsüklile)
(Arvutusmärkus: (60 s sees + 30 s väljas) × 10 tsüklit = 900 s = 15 min)
5. Teine termiline inkubatsioon
   Torud eemaldatakse ja inkubeeritakse uuesti 95 °C juures 15 minutit 400 pööret minutis.
6. Teine ultrahelitöötlus
   Korrake ultrahelitöötlust VialTweeteril, kasutades samu seadeid (nagu ülal) veel 10 tsüklit (kokku 15 minutit).
7. Lüsaadi selgitamine
   1. Proove tsentrifuugitakse 13 000 × g juures 10 minutit temperatuuril 23 °C (toatemperatuuril).
   2. Supernatant kogutakse ettevaatlikult uude 2,0 ml Safe-lock Eppendorfi torusse. Vältige graanulite häirimist.
8. Järgnev töötlemine
   Lüsaat on nüüd valmis SP3 puhastamiseks ja ensümaatiliseks seedimiseks.

Märkused ja parimad tavad

1. Ülekuumenemise ohtu ultrahelitöötluse ajal leevendab programmeeritud ON/OFF tsükkel.
2. Valkude agregatsiooni vältimiseks vältige ultrahelitöötlusjärgset vorteksimist.

Jäätmete kõrvaldamine ja ohutus

Allolev tabel annab teile ülevaate meie laborisuuruse ultrasonikaatorite ligikaudsest töötlemisvõimsusest: