Protokoll, mis kasutab Hielscheri mitme prooviga sonikaatoreid biofilmis ja proteoomilises analüüsis

Mitme prooviga sonikaatorite, näiteks VialTweeter Multi-Tube Sonicator ja UIP400MTP Microplate Sonicator kasutamine lihtsustab laboratoorseid töövooge suure läbilaskevõimega rakenduste jaoks. Mõlemad seadmed võimaldavad täpset ja ühtlast ultraheli töötlemist mitme proovi vahel, minimeerides varieeruvust ja suurendades reprodutseeritavust. See on eriti kasulik katsetes, mis nõuavad järjepidevat proovi lüüsi, biokile eemaldamist, valgu ekstraheerimist või proteolüütilist lagundamist, kus manuaalsed või ühe prooviga meetodid on vähem tõhusad ja ebajärjekindlad.

Sujuvamaks töövood mitme prooviga sonikaatoritega

Näiteks võimaldab UIP400MTP mikroplaatide kaevude samaaegset ultraheli töötlemist, tagades biokilede või rakulise materjali ühtlase eraldumise. Vahepeal pakub VialTweeter mitme toruproovi täpset lüüsi ja homogeniseerimist ilma ristsaastumiseta. Need sonikaatorid vähendavad märkimisväärselt töötlemisaega, parandavad eksperimentaalset reprodutseeritavust ja säilitavad kõrge proovi terviklikkuse, muutes need asendamatuteks vahenditeks mikrobioloogias, proteoomikas ja molekulaarbioloogia uuringutes.
Allpool on üksikasjalik protokoll, mis illustreerib Hielscheri mitme prooviga sonikaatori mudelite, VialTweeteri mitme toruga sonikaatori ja mikroplaadi sonikaatori UIP400MTP kasutamist uuringus, mis hõlmab E. coli biokile moodustumist ja sellele järgnevat proteoomilist analüüsi.

Protokoll: biokile moodustumine, eraldumine ja proteoomiline analüüs Hielscheri mitme prooviga sonikaatorite abil

1. Bakterikultuuri ettevalmistamine

• E. coli bakterite (tüvi W3110) kasvatamine temperatuuril 30 °C, mis on soodne E. coli biokile moodustumiseks, trüptoonipuljongis (TB) söötmes, mis sisaldab:
  – 10 g/l trüptoon
  – 5 g/l NaCl
• Täiendage vajadusel antibiootikumidega, et tagada plasmiidide retentsioon.
• Mikroskoopia ja promootori aktiivsuse uuringutes kasutage W3110 E. coli tüve koos genoomiliselt täiustatud GFP (eGFP) reporteriga rplL-promootori kontrolli all.
• Kasutage GFP reporteri plasmiide erinevate promootorite jaoks (nt csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) et mõõta promootorite tegevust.

2. Biokile kasvatamine ja eraldamine

• 1,5 ml lahjendatud bakterikultuuri külvatakse augu kohta 12 auguga plaadile (CellStar 12 auguga plaadid, Greiner Bio-One).
• Inkubeerida, et võimaldada biokile moodustumist.
• Eemaldage planktoni (mittekleepuv) kultuur hoolikalt.

– Iga auku pestakse 500 μL fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega.
– Eemaldage kinnitatud rakud, töödeldes 12-augulise plaadi ultraheliga UIP400MTP mikroplaadi sonikaatoris. UIP400MTP tagab ühtlase eraldumise, pakkudes järjepidevat ultraheli energiat kõigis kaevudes.
– Sonikatsiooni seaded: 60% amplituud, tsükli režiim: 60 sek ON / 30 sek VÄLJAS.

3. Rakkude kogumine ja lüüs

• Eraldatud biokilerakke tsentrifuugitakse 4 500 g juures 5 minutit.
• Granuleeritud rakke pestakse fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega.
• Resuspendeerige rakud 100 μl 2% naatriumlauroüülsarkosinaadis (SLS) ja inkubeerige 95 °C juures 15 minutit.
• Sonikeerige raku täieliku lüüsi tagamiseks VialTweeter Multi-Tube Sonicatori abil.
  – Sonikatsiooni seaded: 100% amplituud, 50 s ON / 10 s OFF 10 min kogu tööaja jooksul; Hoidke proove jääl.

4. Redutseerimine ja alküülimine

• Disulfiidsidemete vähendamiseks lisatakse 5 mM Tris(2-karboksüetüül)fosfiin (TCEP) ja inkubeeritakse 95 °C juures 15 minutit.
• Alkülaatvalgud 10 mM jodoatseetamiidiga 30 minutit temperatuuril 25 °C.

5. Valgu kvantifitseerimine ja seedimine

• Tsentrifuugitakse lüsaate prahi eemaldamiseks.
• Kvantifitseerige valgu kogusisaldus, kasutades Pierce BCA valguanalüüsi komplekti.
• 50 μg üldvalku lagundatakse 1 μg trüpsiiniga lahuses, mis sisaldab 2% SLS-i ja 100 mM ammooniumvesinikkarbonaati.
• Inkubeeritakse tehisseedereaktsiooni üleöö temperatuuril 30 °C.

6. Peptiidide puhastamine

• SLS sadestatakse, lisades 1,5% trifluoroäädikhapet (TFA), seejärel tsentrifuugitakse.
• Puhastage peptiidid C18 mikrospin-kolonnide abil.
• Kuivatage puhastatud peptiidid ja resuspendeerige 0,1% TFA-s.

7. Vedelikkromatograafia-massispektromeetria (LC-MS/MS)

• Analüüsige peptiide Q-Exactive Plus massispektromeetril koos Ultimate 3000 RSLC nanosüsteemiga.
• Peptiidid eraldatakse pöördfaasilise HPLC-kolonni abil (75 μm × 42 cm), mis on täidetud C18 vaiguga (2,4 μm).
• Kandke 140 minuti jooksul gradient 2% kuni 35% lahustit B (atsetonitriil 0,15% sipelghappega).
• Hankige andmeid kõrge eraldusvõimega MS-skaneeringute abil, millele järgneb 10 kõige intensiivsema iooni tandem MS/MS-skaneerimine.

8. Andmete analüüs

• Töötle töötlemata LC-MS andmeid Progenesis tarkvara abil.
• Eksportige .mgf-faile ja analüüsige neid MASCOTiga.
• Tehke peptiidide kvantifitseerimine, kasutades SafeQuant'i kvaliteedikontrolliks ja vale avastamise reguleerimiseks.
• Kõik katsed tehakse korratavuse tagamiseks kahes või kolmes eksemplaris.

Mitme prooviga sonikaatorid suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistamiseks

Mitme prooviga sonikaatorimudelid VialTweeter ja UIP400MTP suurendavad oluliselt eksperimentaalsete töövoogude täpsust ja tõhusust, eriti biokile uuringutes ja proteoomikas. Nende võime töödelda mitut proovi ühtlaselt tagab suure läbilaskevõime, kahjustamata andmete kvaliteeti. Need eelised koos ülaltoodud sujuvate töövoogudega muudavad Hielscheri mitme prooviga sonikaatorid kaasaegsete bioloogiliste uuringute jaoks olulisteks tööriistadeks.

Disain, tootmine ja nõustamine – Kvaliteet Valmistatud Saksamaal

Hielscheri ultrasonikaatorid on tuntud oma kõrgeimate kvaliteedi- ja disainistandardite poolest. Vastupidavus ja lihtne kasutamine võimaldavad meie ultrasonikaatorite sujuvat integreerimist tööstusrajatistesse. Hielscheri ultrasonikaatorid saavad kergesti käsitseda karmid tingimused ja nõudlikud keskkonnad.

Hielscher Ultrasonics on ISO sertifitseeritud ettevõte ja paneb erilist rõhku suure jõudlusega ultrasonikaatoritele, millel on tipptasemel tehnoloogia ja kasutajasõbralikkus. Loomulikult on Hielscheri ultrasonikaatorid CE-nõuetele vastavad ja vastavad UL, CSA ja RoHs nõuetele.