Hielscheri mitme proovi sonikaatorite kasutamise protokoll biokile ja proteoomika analüüsis

Mitme proovi sonikaatorite, nagu VialTweeter Multi-Tube Sonicator ja UIP400MTP mikroplaadi sonikaator, kasutamine sujuvamaks muudab laboritöövooge suure läbilaskevõimega rakenduste jaoks. Mõlemad seadmed võimaldavad täpset ja ühtlast ultraheli töötlust mitmel proovil korraga, vähendades varieeruvust ja parandades korratavust. See on eriti kasulik katsetes, mis nõuavad ühtlast proovide lüüsi, biokile eraldamist, valkude ekstraheerimist või proteolüütilist lagundamist, kus käsitsi või ühe proovi meetodid on vähem tõhusad ja kalduvad ebaühtlusele.

Töövoogude sujuvamaks muutmine mitme proovi sonikaatoritega

UIP400MTP võimaldab näiteks mikroplaadi süvendite samaaegset ultraheli töötlust, tagades biokilede või rakumaterjali ühtlase eraldumise. VialTweeter pakub samal ajal mitme tuubi proovide täpset lüüsi ja homogeniseerimist ilma ristsaastumiseta. Need sonikaatorid lühendavad oluliselt töötlusaegu, parandavad katsete korratavust ja säilitavad proovide kõrge terviklikkuse, olles seeläbi asendamatud vahendid mikrobioloogia, proteoomika ja molekulaarbioloogia uuringutes.
Allpool on üksikasjalik protokoll, mis näitlikustab Hielscheri mitme proovi sonikaatorite mudelite – VialTweeter Multi-Tube Sonicator ja mikroplaadi sonikaator UIP400MTP – kasutamist uuringus, mis hõlmab E. coli biokile teket ja sellele järgnevat proteoomikaanalüüsi.

Protokoll: biokile teke, eraldamine ja proteoomikaanalüüs Hielscheri mitme proovi sonikaatoritega

1. Bakterikultuuri ettevalmistus

• Kasvatage E. coli baktereid (tüvi W3110) temperatuuril 30°C, mis on E. coli biokile tekkeks soodne, trüptoonpuljongi (TB) söötmes, mis sisaldab:
  – 10 g/L trüptooni
  – 5 g/L NaCl
• Lisage vajaduse korral antibiootikume, et tagada plasmiidi säilimine.
• Mikroskoopia ja promootori aktiivsuse uuringute jaoks kasutage E. coli tüve W3110, mille genoomis on tugevdatud GFP (eGFP) reporter rplL promootori kontrolli all.
• Kasutage GFP reporterplasmiide erinevate promootorite jaoks (nt csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) promootorite aktiivsuse mõõtmiseks.

2. Biokile kasvatamine ja eraldamine

• Külvake 1,5 mL lahjendatud bakterikultuuri süvendi kohta 12-süvendilisele plaadile (CellStar 12-süvendilised plaadid, Greiner Bio-One).
• Inkubeerige biokile tekkimiseks.
• Eemaldage planktoniline (mittekinnitunud) kultuur ettevaatlikult.

– Peske iga süvendit 500 µL PBS-iga.
– Eraldage kinnitunud rakud, sonikeerides 12-süvendilist plaati UIP400MTP mikroplaadi sonikaatoris. UIP400MTP tagab ühtlase eraldumise, edastades ühtlast ultraheli energiat kõikidesse süvenditesse.
– Sonikeerimise seaded: 60% amplituud, tsüklirežiim: 60 s sees / 30 s väljas.

3. Rakkude koristamine ja lüüs

• Tsentrifuugige eraldatud biokile rakke 4 500 g juures 5 minutit.
• Peske sadestatud rakke PBS-iga.
• Suspendeerige rakud uuesti 100 µL 2% naatriumlauroüülsarkosinaadis (SLS) ja inkubeerige 95°C juures 15 minutit.
• Sonikeerige VialTweeter Multi-Tube Sonicatoriga, et tagada rakkude täielik lüüs.
  – Sonikeerimise seaded: 100% amplituud, 50 s sees / 10 s väljas, kogutöö aeg 10 min; hoidke proove jääl.

4. Redutseerimine ja alküülimine

• Lisage 5 mM tris(2-karboksüetüül)fosfiini (TCEP) disulfiidsidemete redutseerimiseks ja inkubeerige 95°C juures 15 minutit.
• Alküülige valgud 10 mM jodoatseetamiidiga 30 minutit temperatuuril 25°C.

5. Valgu kvantifitseerimine ja lagundamine

• Tsentrifuugige lüsaate prahi eemaldamiseks.
• Kvantifitseerige üldvalgu sisaldus Pierce BCA Protein Assay Kitiga.
• Lagundage 50 µg üldvalku 1 µg trüpsiiniga lahuses, mis sisaldab 2% SLS-i ja 100 mM ammooniumvesinikkarbonaati.
• Inkubeerige lagundamisreaktsiooni üleöö temperatuuril 30°C.

6. Peptiidide puhastamine

• Sadestage SLS, lisades 1,5% trifluoroäädikhapet (TFA), seejärel tsentrifuugige.
• Puhastage peptiide C18 mikrotsentrifuugikolonnidega.
• Kuivatage puhastatud peptiidid ja suspendeerige need uuesti 0,1% TFA-s.

7. Vedelikkromatograafia-massispektromeetria (LC-MS/MS)

• Analüüsige peptiide Q-Exactive Plus massispektromeetril, mis on ühendatud Ultimate 3000 RSLC nano süsteemiga.
• Eraldage peptiide pöördfaasilise HPLC kolonniga (75 µm × 42 cm), mis on pakitud C18 vaiguga (2,4 µm).
• Rakendage gradienti 2%-st kuni 35% lahustini B (atsetonitriil 0,15% sipelghappega) 140 minuti jooksul.
• Koguge andmeid kõrglahutusega MS skaneeringutega, millele järgnevad tandem MS/MS skaneeringud 10 kõige intensiivsemast ioonist.

8. Andmeanalüüs

• Töödelge LC-MS toorandmeid Progenesis tarkvaraga.
• Eksportige .mgf failid ja analüüsige neid MASCOTiga.
• Teostage peptiidide kvantifitseerimine SafeQuantiga kvaliteedikontrolliks ja valepositiivsete tulemuste korrigeerimiseks.
• Tehke kõik katsed duplikaatides või triplikaatides, et tagada korratavus.

Mitme proovi sonikaatorid suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistuseks

Mitme proovi sonikaatorite mudelid VialTweeter ja UIP400MTP parandavad oluliselt katsete töövoogude täpsust ja tõhusust, eriti biokile uuringutes ja proteoomikas. Nende võime töödelda mitut proovi ühtlaselt tagab suure läbilaskevõime andmete kvaliteeti kahjustamata. Need eelised koos eespool kirjeldatud sujuvamaks muudetud töövoogudega muudavad Hielscheri mitme proovi sonikaatorid kaasaegse bioloogilise uurimistöö hädavajalikeks vahenditeks.

Disain, tootmine ja konsulteerimine – Made in Germany kvaliteet

Hielscheri ultrasonikaatorid on tuntud oma kõrgeima kvaliteedi ja disainistandardite poolest. Töökindlus ja lihtne kasutamine võimaldavad meie ultrasonikaatorite sujuvat integreerimist tööstusrajatistesse. Hielscheri ultrasonikaatorid tulevad kergesti toime karmide tingimuste ja nõudlike keskkondadega.

Hielscher Ultrasonics on ISO sertifitseeritud ettevõte ja pöörab erilist tähelepanu suure jõudlusega ultrasonikaatoritele, mis on varustatud tipptasemel tehnoloogia ja kasutajasõbralikkusega. Loomulikult vastavad Hielscheri ultrasonikaatorid CE nõuetele ning täidavad UL, CSA ja RoHs nõudeid.