Proteoomika protokoll: kontaktivaba ultraheli töötlus (sonikeerimine) täiustab peptiidproovide ettevalmistamist MS analüüsiks
Alt-üles proteoomika on kujunenud tänapäevase biomarkerite avastamise, struktuuribioloogia ja kliinilise diagnostika nurgakiviks. Valkude lagundamine peptiidideks enne massispektromeetria (MS) analüüsi võimaldab teadlastel saavutada suurema järjestuse katvuse ja usaldusväärsema kvantifitseerimise. Siiski on kõrge keerukusega bioloogiliste proovide ettevalmistamine MS jaoks endiselt tehniliselt nõudlik. Hiljutised metodoloogilised edusammud näitavad, kuidas kontrollitud ultraheli töötlus – eelkõige kontaktivaba mitme tuubi sonikaatoriga VialTweeter ja mikroplaadi sonikaatoriga UIP400MTP – võib oluliselt sujuvamaks muuta selle töövoo, parandada korratavust ja ära hoida levinud instrumentaalseid kitsaskohti.
Siit leiate üksikasjaliku proovide ettevalmistamise protokolli MS analüüsiks sobiva suurusega peptiidide saamiseks.
Kes peaks kasutama kontaktivaba ultraheli töötlust (sonikeerimist) peptiidproovide ettevalmistamiseks?
- Alt-üles proteoomika ja avastuslaborid: Teadlased, kes valmistavad ette kõrge keerukusega proove LC-MS või MALDI töövoogude jaoks ning vajavad järjepidevat, kõrge saagisega peptiidide taastumist erinevates bioloogilistes maatriksites.
- S-Trap™ ja suspensioonipüüdmise kasutajad: Meeskonnad, kes tuginevad mikrokolonnipõhisele puhastusele ning vajavad kontrollitud DNA nihkelõhkumist, et vältida kolonni ummistumist ning tagada sujuv proovi laadimine ja lagundamine.
- Kliinilised ja translatsiooniuuringute rühmad: Laborid, mis töötlevad kudesid, rakke, plasmat, seerumit või tserebrospinaalvedelikku ning kus partiidevaheline korratavus ja proovi terviklikkus on kriitilise tähtsusega.
- Kvantitatiivsed ja sihitud MS meeskonnad: Laborid, mis teevad rangeid võrdlevaid uuringuid, kus sondsonikaatorid toovad kaasa ristsaastumisriskid, mis võivad kahjustada madala sisaldusega peptiidide kvantifitseerimist.
- Tugilaborid ja suure läbilaskevõimega tegevused: Rühmad, kes töötlevad samaaegselt mitut bioloogilist kordusproovi ja kellele on kasulik suletud tuubidega mitme tuubi blokk-sonikeerimine sonikaatoriga VialTweeter, mis välistab sondi puhastamise, vähendab käsitsi tehtavat tööd ja säilitab aseptilised tingimused.
- PTM-i ja struktuurvalkude uurijad: Teadlased, kes vajavad õrna, temperatuuri kontrollivat töötlust, et säilitada labiilsed modifikatsioonid ja maksimeerida järjestuse katvus rakkude lüüsi ja homogeniseerimise ajal.
Mitme proovi sonikaator „VialTweeter“ proteoomika jaoks mõeldud mitme suletud viaali kontaktivabaks proovide ettevalmistamiseks
Protokolli ülevaade: koest ja rakkudest MS jaoks valmis peptiidideni
Laialdaselt kasutusele võetud alt-üles proteoomika töövoog, mille on kirjeldanud Wojtkiewicz et al., pakub töökindlat ja skaleeritavat meetodit peptiidproovide ettevalmistamiseks erinevatest bioloogilistest maatriksitest. Alustades 50–100 mg šokkkülmutatud koest või 1–20 miljonist rakust, integreerib protokoll suspensioonipüüdmise (S-Trap™) tehnoloogia, et enne ensümaatilist lagundamist tõhusalt eemaldada detergendid, soolad ja saasteained.
Pärast lüüsi, valgu kvantifitseerimist, redutseerimist ja alküülimist happestatakse proov ning laaditakse S-Trap™ tsentrifuugikolonnile, kus toimub trypsin/lysC lagundamine. Saadud peptiidid eluteeritakse, kuivatatakse ja suunatakse LC-MS analüüsile. Kui seda töövoogu rakendatakse 50 mg inimese südamekoele, saadakse järjepidevalt piisavalt peptiide 30–40 injektsiooniks, tuvastades üle 4 000 unikaalse valgu ühe analüüsi kohta. Kuigi keemia ja kolonnipõhine puhastus on hästi määratletud, sõltub kogu protsessi edukus suuresti esialgsest füüsilisest lõhkumisest ja DNA käsitlemise etappidest.
Protokoll soovitab kasutada mitme tuubi sonikaatorit VialTweeter rakkude ultraheli lüüsiks ja DNA nihkelõhkumiseks – mõlemad etapid on peptiidanalüüsi jaoks kriitilised.
VialTweeter sonikeerib suletud 1,0, 1,5 ja 2,0 mL Eppendorfi tuube ning mitmesuguseid NUNC-viaale
Rakkude ja kudede ultraheli lüüs valkude ekstraheerimiseks
Bottom-up proteoomika töövoos on sonikeerimine rakuproovide lüüsimise võtmeetapp, et ekstraheerida valgud järgnevaks massispektromeetria analüüsiks. Pärast SDS-rakulüüsipuhvri lisamist rakusetetele töödeldakse proove ultrahelil, kasutades mitme tuubi sonikaatorit VialTweeter. Protokollis kasutatakse 1,5 mL mikrotsentrifuugituube ning sonikaatorit käitatakse 30% võimsusel 10 sekundit sees ja 10 sekundit väljas, korrates 3 tsüklit. Pärast 1-minutilist ootamist korratakse tsüklit veel kaks korda. Proove jahutatakse pidevalt jääga.
See protsess ei aita ainult rakke lõhkuda, vaid on spetsiaalselt vajalik lüüsi käigus vabanenud genoomse DNA nihkeks katkestamiseks. Tõhus DNA nihkelõikamine on oluline proovi viskoossuse vähendamiseks ja S-Trap™ kolonnide ummistumise vältimiseks, tagades seeläbi optimaalse valgusaagise ja usaldusväärse järgneva peptiidide lõhustamise.
Ultraheli DNA nihkelõikamise kriitiline roll
Üks sagedasemaid tõrkeid S-Trap™-põhistes töövoogudes on kolonni ummistumine, mille põhjustab peaaegu eranditult raku- või koehomogeniseerimisel vabanev suure molekulmassiga genoomne DNA. Terve DNA suurendab drastiliselt proovi viskoossust, püüab kinni peptiide ja ummistab S-Trap™ mikropoorse sorbendikihi.
Ultraheli töötlus lahendab selle probleemi, killustades DNA mehaaniliselt väikesteks lahustuvateks fragmentideks. Kontrollitud akustilist energiat rakendades lõikab VialTweeter nukleiinhapped tõhusalt nihkega ilma liigset soojust tekitamata või võõraid saasteaineid sisse viimata. See viskoossuse vähenemine tagab sujuva proovi laadimise, ühtlase läbivoolukiiruse ja katkematu lõhustamiskineetika.
Sonikaatori VialTweeter optimeeritud sonikeerimisparameetrid
Protokoll määrab väga reprodutseeritava sonikeerimisrežiimi, mis on optimeeritud bioloogilise proovi terviklikkuse ja järgneva MS ühilduvuse jaoks. 1,5 mL mikrotsentrifuugituubides olevate proovide puhul tagavad Hielscheri kontaktivaba plokk-sonikaatori VialTweeter kasutamisel järgmised parameetrid lüüsi ja optimaalse DNA nihkelõikamise, säilitades samal ajal valgu struktuuri:
- Amplituud: 30% võimsus
- Tsükli muster: 10 sekundit SEES / 10 sekundit VÄLJAS
- Kestus: 3 tsüklit (10 s SEES/10 s VÄLJAS) → 1-minutiline puhkus jääl → korrata veel 2 korda
- Temperatuuri juhtimine: proovid asetatakse töötlemise ajaks jääle, et vältida termilist denatureerumist ja enneaegset ensümaatilist aktiivsust
See pulseeriv sonikeerimisviis hoiab ära lokaalse ülekuumenemise, minimeerib peptiidide oksüdeerumist ja tagab ühtlase akustilise mõjutuse kõigis viaalides. Suletud tuubi lahendus välistab ka vajaduse sondi proovide vahel puhastada, vähendades drastiliselt käsitsitöö aega ja operaatorist tulenevat varieeruvust.
Peamised eelised kaasaegsetele proteoomika töövoogudele
Sonikaatori VialTweeter integreerimine oma bottom-up proteoomika töövoogu pakub mitmeid operatiivseid ja teaduslikke eeliseid:
- Ühtlane DNA fragmenteerimine: Ühtlane akustilise energia edastamine kõigisse viaalidesse tagab reprodutseeritava viskoossuse vähenemise ja hoiab ära partiidevahelise varieeruvuse S-Trap™ laadimisel.
- Labiilsete modifikatsioonide säilimine: Madalatemperatuuriline töötlus jäävannis kaitseb translatsioonijärgseid modifikatsioone (PTM-e) ja hoiab ära kuumusest tingitud valkude agregeerumise rakulüüsi ajal.
- Sujuvam järgnev töötlus: Lüsaate, mida on töödeldud sonikaatoriga VialTweeter, saab otse tsentrifuugimisega selitada ja kvantifitseerida ilma täiendavate puhastusetappideta, mis kiirendab teed S-Trap™ lõhustamiseni.
- Skaleeritavus ja paindlikkus: Samu sonikeerimisseadeid saab kasutada nii suure keerukusega koeproovide kui ka rakususpensioonide puhul, toetades avastusproteoomikat, sihipärast kvantifitseerimist ja glükoproteoomika töövoogusid. Hielscheri mikroplaatide sonikaatorid võimaldavad hõlpsat skaleerimist suurele hulgale proovidele mitmekaevulistes plaatides.
Kontaktivaba mitme tuubi sonikaatorit VialTweeter saab kasutada jahutatud kappides
Sonikaatorid proteoomika proovide ettevalmistamiseks
Mass-spektromeetria jaoks kvaliteetsete peptiidiproovide ettevalmistamine nõuab enamat kui tõhusat lüüsi – see eeldab täpset kontrolli DNA nihkelõhkumise, temperatuuri ja saastumise vältimise üle. Kui lisate Hielscheri sonikaatori VialTweeter oma bottom-up proteoomika töövoogu, saate vältida S-Trap™ ummistumist, tagada korratava valgusaagise ja säilitada tundlike MS analüüside jaoks vajaliku puhtuse. Olenemata sellest, kas töötlete inimkude, kultiveeritud rakke või keerukaid lüsaate, pakub ultraheli plokktöötlus töökindlust, skaleeritavust ja protsessikontrolli, mida tänapäevased proteoomikalaborid nõuavad.
Suuremate proovide arvude jaoks kasutage ära Hielscheri fokuseeritud kontaktivabu mikroplaadi sonikaatorite mudeleid UIP400MTP ja UIP550MTP! Töödelge mis tahes standardset mitmekaevulist plaati suure läbilaskevõimega proteoomika jaoks!
Suletud tuubide töötlus vs. traditsioonilised sondsonikaatorid
Ajalooliselt on teadlased DNA nihkejõudude all lõhkumiseks kasutanud otsekontaktiga sondsonikaatoreid. Kuigi sondsüsteemid on tõhusad, toovad need proteoomika töövoogudesse mitu olulist piirangut:
- Ristsaastumise risk: Sondi taaskasutamine mitme proovi puhul tekitab aerosooli ülekannet ja toob kaasa ristsaasteaineid, mis moonutavad kvantitatiivseid MS tulemusi.
- Proovikadu: Otsene sissesukeldumine võib põhjustada pritsimist, aurustumist ja väärtuslike peptiidide kleepumist sondi pinnale.
- Puhastamine: Sondi põhjalik dekontamineerimine proovide vahel on aeganõudev ja sageli mittetäielik, mis kahjustab vähese sisaldusega valkude uuringuid.
Plokksonikaator VialTweeter töötleb proove täielikult suletud mikrotsentrifuugituubides. See suletud süsteemi disain välistab sondi ja proovi vahelise kontakti, hoiab ära aerosooli teket ja säilitab range aseptilisuse kogu homogeniseerimise ja lüüsi vältel. Kõrge keerukusega koelüsaate või mitut rakuliini töötlevate laborite jaoks tähendab see puhtamaid MS andmeid, suuremat peptiidide saagist ja usaldusväärsemaid bioloogilisi kordusproove.
Skaleerimine suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistamisele mitmekaevulistel plaatidel
Mikroplaadi sonikaatorite mudelitega UIP400MTP ja UIP550MTP saab tuubide töötlust hõlpsasti skaleerida suure läbilaskevõimega proovitöötluseks mis tahes standardsel mitmekaevulisel plaadil.
Mitmekaevulise plaadi sonikaator UIP400MTP proovidest valkude suure läbilaskevõimega ekstraheerimiseks
Korduma kippuvad küsimused peptiidiproovide ettevalmistamise ultraheli töötluse (sonikeerimise) kohta
Miks on enne S-Trap™ peptiidide töötlust vaja sonikeerimist?
Sonikeerimine on vajalik rakkude või kudede lüüsi käigus vabanevate suure molekulmassiga genoomse DNA nihkelõhkumiseks. Terve DNA suurendab oluliselt proovi viskoossust, mis võib ummistada S-Trap™ mikrokolonni ja siduda peptiide, vähendades tugevalt saagist ja MS ühilduvust.
Kuidas parandab plokksonikaator VialTweeter proovide ettevalmistamist võrreldes traditsiooniliste sondsonikaatoritega?
Erinevalt otsekontaktiga sondsonikaatoritest, mis nõuavad hoolikat puhastamist proovide vahel ja mille puhul esineb aerosooli ülekande oht, töötleb VialTweeter proove täielikult suletud viaalides ja mikrotsentrifuugituubides. See suletud tuubide disain välistab ristsaastumise, hoiab ära proovikao ja säilitab range aseptilisuse kogu homogeniseerimise ja rakulüüsi vältel.
Millised on proteoomika proovide ettevalmistamise optimaalsed sonikeerimisparameetrid?
Bioloogiliste proovide, näiteks rakkude ja kudede puhul kasutatakse soovitatud protokollis sonikaatorit VialTweeter 30% võimsusel tsükliga 10 sekundit sees / 10 sekundit väljas, korrates 3 korda. Proove tuleks töötluse ajal hoida jääl ning tsüklit korrata veel kaks korda, kui töödeldakse ≥5 miljonit rakku. (vrd Wojtkiewicz et al., 2021)
Mida teha, kui minu S-Trap™ kolonn proovi laadimisel ummistub?
Kolonni ummistumine on tavaliselt põhjustatud DNA kõrgest viskoossusest või ebapiisavast selitamisest. Selle lahendamiseks tsentrifuugige lüsaat enne pipeteerimist põhjalikult ja veenduge, et DNA on sonikeerimisega piisavalt väikesteks fragmentideks lõhutud.
Kuidas toob mittekontaktne sonikeerimine kasu kvantitatiivse proteoomika töövoogudele?
Kvantitatiivsetes uuringutes võib isegi jälgkoguses ristsaastumine proovide vahel moonutada vähese esinemissagedusega peptiidide mõõtmistulemusi. Sonikaatori VialTweeter suletud tuubides toimuv mitme viaali töötlus välistab sondi sisestamise, tagab partiidevahelise korratavuse ja säilitab proovi terviklikkuse täpseks võrdlevaks analüüsiks.
Millist valgusaagist ja MS analüüsi sügavust võin selle protokolliga oodata?
Alustades 50 mg inimese südamekoest või 5 miljonist rakust, annab S-Trap™ töövoog tavaliselt piisavalt peptiide 30–50 LC-MS injektsiooniks, tuvastades järjepidevalt üle 4 000 unikaalse valgu analüüsi kohta. (vrd Wojtkiewicz et al., 2021)
Kirjandus / viited
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics pakub võimsaid kontaktivabu sonikaatoreid proovide ettevalmistamiseks ja kliiniliseks analüüsiks. Mitme süvendiga plaadi sonikaator UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn ja läbivoolu sonikaator GDmini2 töötlevad proove neid puudutamata.