Proteoomika protokoll: kontaktivaba ultrahelitöötlus parandab peptiidiproovide ettevalmistamist massispektromeetria jaoks
Alt-üles-lähenemisega proteoomika on muutunud tänapäevase biomarkerite avastamise, struktuuribioloogia ja kliinilise diagnostika nurgakiviks. Lõhustades valgud peptiidideks enne massispektromeetria (MS) analüüsi, saavad teadlased saavutada põhjalikuma järjestuse katvuse ja usaldusväärsema kvantifitseerimise. Siiski on suure keerukusega bioloogiliste proovide ettevalmistamine MS-analüüsiks endiselt tehniliselt nõudlik. Hiljutised metoodilised edusammud rõhutavad, kuidas kontrollitud ultrahelitöötlus – eelkõige puutevaba VialTweeter Multi-Tube ultraheliseadme ja UIP400MTP mikroplaadi ultraheliseadme puhul – võib seda töövoogu märkimisväärselt tõhustada, parandada tulemuste korratavust ja vältida seadmetega seotud tavalisi kitsaskohti.
Leidke üksikasjalik proovi ettevalmistamise juhend, et saada MS-analüüsiks sobiva suurusega peptiide.
Kes peaks peptiidiproovide ettevalmistamiseks kasutama kontaktivaba ultrahelitöötlust?
- Alt-üles proteoomika & Discovery Labs: Teadlased, kes valmistavad ette väga keerukaid proove LC-MS- või MALDI-analüüsiprotsessideks ja vajavad erinevates bioloogilistes maatriksites ühtlast ja suure saagisega peptiidide eraldamist.
- S-Trap™ & Kasutajate kinnihoidmine riputamise abil: Meeskonnad, kes kasutavad puhastamiseks mikrokolonne ja vajavad kontrollitud DNA-lõikamist, et vältida kolonni ummistumist ning tagada proovi sujuv laadimine ja lagundamine.
- Kliinilised & Translatsioonilised uurimisrühmad: Laborid, kus töödeldakse kudesid, rakke, plasma, seerumit või tserebrospinaalvedelikku ning kus partiidevaheline reprodutseeritavus ja proovi terviklikkus on otsustava tähtsusega.
- Kvantitatiivne & Sihtgrupiks olevad MS Teams’id: Laborid, kus viiakse läbi rangeid võrdlusuuringuid, kus korduvkasutatavad sondiga ultraheli-seadmed tekitavad ristsaastumise ohtu, mis võib ohustada haruldaste peptiidide kvantifitseerimist.
- Põhiteenused & Suure läbilaskevõimega operatsioonid: Rühmad, kes töötlevad samaaegselt mitut bioloogilist replikaati ja kellele on kasulik VialTweeteriga läbiviidav suletud torude ja mitme toru plokiga ultrahelitöötlus, mis välistab sondi puhastamise vajaduse, vähendab käsitsitöö aega ja tagab aseptilised tingimused.
- Vanemate ja õpetajate koosolek & Struktuurvalkude uurijad: Teadlased, kes vajavad õrna, temperatuurikontrollitud töötlemist, et säilitada ebastabiilsed modifikatsioonid ja maksimeerida järjestuse katvust rakkude lüüsi ja homogeniseerimise käigus.
Mitme prooviga sonikaator “VialTweeter” proteoomika jaoks mitme suletud viaali kontaktivaba proovide ettevalmistamiseks
Protokollide ülevaade: kudedest ja rakkudest MS-analüüsiks sobivate peptiidideni
Wojtkiewicz jt poolt kirjeldatud laialdaselt kasutusele võetud alt-üles proteoomika töövoog pakub usaldusväärset ja skaleeritavat meetodit peptiidiproovide ettevalmistamiseks erinevatest bioloogilistest maatriksitest. Alustades 50–100 mg kiirkülmutatud koest või 1–20 miljonist rakust, integreerib protokoll suspensiooni püüdmise (S-Trap™) tehnoloogia, et eemaldada enne ensümaatilist lagundamist tõhusalt detergendid, soolad ja saasteained.
Pärast lüüsi, valkude kvantifitseerimist, redutseerimist ja alküülimist hapestatakse proov ja laaditakse S-Trap™ tsentrifuugikolonnile, kus toimub tripsiin/lysC-lagundamine. Saadud peptiidid elueeritakse, kuivatatakse ja suunatakse LC-MS analüüsile. Kui seda töövoogu rakendatakse 50 mg inimese südamekoe suhtes, annab see järjepidevalt piisavalt peptiide 30–40 süstiks, tuvastades ühe analüüsi jooksul üle 4000 unikaalse valgu. Kuigi keemiline protsess ja kolonnipõhine puhastamine on hästi määratletud, sõltub protsessi edukus suuresti esialgsest füüsilisest lagundamisest ja DNA-ga seotud etappidest.
Protokollis soovitatakse kasutada VialTweeter Multi-Tube Sonicatorit rakkude sonikatsioonilisamiseks ja DNA lõikamiseks – Mõlemad etapid on peptiidide analüüsimisel otsustava tähtsusega.
VialTweeter töötleb ultraheliga suletud 1,0-, 1,5- ja 2,0-milliliitriseid Eppendorfi torusid ning mitmesuguseid NUNC-viaale
Valgu eraldamiseks kasutatav ultraheliline rakkude ja kudede lüüsimine
Alustavast proteoomika töövoost on ultrahelitöötlus rakuproovide lüüsimise võtmetähtsusega etapp, mille eesmärk on valkude eraldamine järgnevaks massispektromeetriliseks analüüsiks. Pärast SDS-rakulüüsipuhvri lisamist rakupelletile töödeldakse proove ultraheliga, kasutades VialTweeter Multi-Tube Sonicatorit. Protokollis kasutatakse 1,5 ml mikrotsentrifuugitorusid ning sätestatakse, et sonikaatorit tuleb kasutada 30% võimsusel, 10 sekundit sisse lülitatuna ja 10 sekundit välja lülitatuna, seda korratakse 3 tsüklit. Pärast 1-minutilist ootamist korratakse tsüklit veel kaks korda. Proove jahutatakse pidevalt jääga.
See protsess ei aita mitte ainult rakke lagundada, vaid on eriti vajalik lüüsi käigus vabanenud genoomse DNA tükeldamiseks. Tõhus DNA tükeldamine on ülioluline proovi viskoossuse vähendamiseks ja S-Trap™-kolonnide ummistumise vältimiseks, tagades seeläbi optimaalse valgu saagise ja usaldusväärse edasise peptiidide lagundamise.
Ultraheli abil toimuva DNA lõikamise otsustav roll
Üks sagedasemaid tõrkeid S-Trap™-põhistes töövoogudes on kolonnide ummistumine, mille põhjuseks on peaaegu eranditult rakkude või kudede homogeniseerimise käigus vabanev kõrge molekulmassiga genoomne DNA. Terve DNA suurendab proovi viskoossust märkimisväärselt, püüab kinni peptiide ja ummistab mikropoorse S-Trap™ sorbendikihi.
Ultrahelitöötlus lahendab selle probleemi, tükeldades DNA mehaaniliselt väikesteks lahustuvateks fragmentideks. Kontrollitud akustilise energia rakendamise abil lõikab VialTweeter nukleiinhappeid tõhusalt, tekitamata liigset soojust ega lisamata võõraineid. See viskoossuse vähenemine tagab proovi sujuva laadimise, ühtlased läbivoolukiirused ja katkematu lagundamise kineetika.
Optimeeritud VialTweeteri ultraheliparameetrid
Protokollis on määratletud väga hästi korratav ultrahelitöötlemise kava, mis on optimeeritud bioloogiliste proovide terviklikkuse säilitamiseks ja järgneva massispektromeetria (MS) ühilduvuse tagamiseks. 1,5 ml mikrotsentrifuugitorudes olevate proovide puhul, kasutades Hielscheri VialTweeteri kontaktivaba plokk-ultraheliseadet, tagavad järgmised parameetrid lüüsi ja optimaalse DNA lõikamise, säilitades samal ajal valkude struktuuri:
- Amplituud: 30% võimsusest
- Tsükli skeem: 10 sekundit sisse / 10 sekundit välja
- Kestus: 3 tsüklit (10 sekundit sisse / 10 sekundit välja) → 1-minutiline puhkus jääl → korrata veel 2 korda
- Temperatuuri reguleerimine: Proovid asetatakse töötlemise ajaks jääle, et vältida termilist denaturatsiooni ja enzymide enneaegset aktiivsust
Selline impulss-ultrahelitöötlusmeetod hoiab ära kohaliku ülekuumenemise, vähendab peptiidide oksüdeerumist miinimumini ja tagab ühtlase akustilise mõju kõigile viaalidele. Suletud toru seadistus välistab ka vajaduse sondi puhastamiseks proovide vahel, vähendades oluliselt käsitsitöö aega ja operaatori poolt põhjustatud variatiivsust.
Kaasaegsete proteoomika töövoogude peamised eelised
VialTweeteri integreerimine teie alt-üles proteoomika töövoolu pakub mitmeid praktilisi ja teaduslikke eeliseid:
- Järjepidev DNA-fragmentatsioon: Akustilise energia ühtlane jaotumine kõigi viaalide vahel tagab viskoossuse vähendamise korratavuse ja hoiab ära S-Trap™-i laadimisel partiidevahelised erinevused.
- Labiilsete modifikatsioonide säilitamine: Madalal temperatuuril töötlemine jäävannis kaitseb posttranslatsionaalseid modifikatsioone (PTM-e) ja takistab kuumusest tingitud valkude agregatsiooni rakkude lüüsi ajal.
- Optimeeritud järelkäsitlus: VialTweeteriga töödeldud lüsaateid saab tsentrifuugimise teel otse selitada ja nende kogust määrata ilma täiendavate puhastamisetappideta, mis kiirendab S-Trap™-digestiooni protsessi.
- Mastaapsus & Paindlikkust: Samad ultraheliseadistused kehtivad nii väga keeruliste koeproovide kui ka rakususpensioonide puhul, toetades avastusproteoomikat, sihipärast kvantifitseerimist ja glükoproteoomika töövooge. Hielscheri mikroplaadi ultraheliseadmed võimaldavad hõlpsalt suurendada töömahte, et töödelda suurt arvu proove mitmes augus.
Kontaktivaba Multi-Tube Sonicator VialTweeterit saab kasutada külmkappides
Proteoomiliste proovide ettevalmistamiseks mõeldud ultraheli-seadmed
Kvaliteetsete peptiidiproovide ettevalmistamine massispektromeetria jaoks nõuab enamat kui vaid tõhusat lüüsi – See nõuab DNA lõikamise, temperatuuri ja saastumise vältimise täpset kontrolli. Hielscheri VialTweeteri integreerimisega oma alt-üles proteoomika töövoogusse saate vältida S-Trap™ ummistumist, tagada valgu taastamise korratavuse ning säilitada tundlike MS-analüüside jaoks vajaliku puhtuse. Olenemata sellest, kas töötlete inimkude, kultiveeritud rakke või keerukaid lüsaate, pakub ultrahelipõhine plokktöötlus usaldusväärsust, skaleeritavust ja protsessikontrolli, mida tänapäevased proteoomikalaborid nõuavad.
Suuremate proovide töötlemiseks kasutage Hielscheri fokuseeritud, kontaktivaba mikroplaadi ultraheliseadmeid mudelid UIP400MTP ja UIP550MTP! Töötlege mis tahes standardseid mitme auguga plaate suure läbilaskevõimega proteoomika jaoks!
Suletud toruga töötlemine võrreldes traditsiooniliste sond-ultraheliseadmetega
Ajalooliselt on teadlased DNA lõikamiseks kasutanud otsesekontaktiga sondiga ultraheliseadmeid. Kuigi need on tõhusad, tekitavad sondisüsteemid proteoomika töövoogudes mitmeid olulisi piiranguid:
- Ristsaastumise oht: Proovi võtmise toru korduv kasutamine mitme proovi puhul põhjustab aerosoolide ülekandumist ja toob kaasa ristsaastumise, mis moonutab kvantitatiivseid MS-tulemusi.
- Proovi kadu: Otsene lisamine võib põhjustada väärtuslike peptiidide pritsimist, aurustumist ja kinnitumist sondi pinnale.
- Puhastamine: Proovide põhjalik dekontamineerimine katsete vahel on aeganõudev ja sageli ebapiisav, mis kahjustab haruldaste valkude uuringuid.
VialTweeter-plokk-ultraheliseadme abil töödeldakse proove täielikult suletud mikrotsentrifuugitorudes. Selline suletud süsteemi konstruktsioon välistab sondi ja proovi kokkupuute, takistab aerosoolide teket ning tagab range aseptilise keskkonna kogu homogeniseerimise ja lüüsi vältel. Laborite jaoks, kus töödeldakse väga keerukaid koelüsaate või mitmeid rakuliine, tähendab see puhtamaid MS-andmeid, suuremat peptiidide saagist ja usaldusväärsemaid bioloogilisi replikaate.
Üleminek suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistamisele mitme auguga plaatidel
Mikroplaadi ultraheli-seadmetega mudelid UIP400MTP ja UIP550MTP, saab proovide töötlemist proovitorudes hõlpsasti laiendada suure läbilaskevõimega proovide töötlemiseks mis tahes standardse mitme auguga plaadil.
Mitme kaevuga plaadi sonikaatori UIP400MTP valkude ekstraheerimiseks proovidest suure läbilaskevõimega
Korduma kippuvad küsimused peptiidiproovide ettevalmistamisel kasutatava ultrahelitöötluse kohta
Miks on enne S-Trap™ peptiidide töötlemist vaja kasutada ultraheli?
Ultrahelitöötlus on vajalik rakkude või kudede lüüsi käigus vabanenud suure molekulmassiga genoomse DNA lõikamiseks. Terve DNA suurendab proovi viskoossust märkimisväärselt, mis võib ummistada S-Trap™ mikrokolonni ja kinni pidada peptiide, vähendades oluliselt saagist ja MS-ühilduvust.
Kuidas parandab VialTweeter-plokk-ultraheliseadme kasutamine proovide ettevalmistamist võrreldes traditsiooniliste sond-ultraheliseadmetega?
Erinevalt otsekontaktiga sondiga ultraheliseadmetest, mis nõuavad katsete vahel hoolikat puhastamist ja millega kaasneb aerosoolide ülekandumise oht, töötleb VialTweeter proove täielikult suletud viaalides ja mikrotsentrifuugitorudes. Selline suletud toru konstruktsioon välistab ristsaastumise, hoiab ära proovi kadu ja tagab rangete aseptiliste tingimuste säilimise kogu homogeniseerimise ja rakkude lüüsi vältel.
Millised on optimaalsed ultraheliparameetrid proteoomika proovide ettevalmistamiseks?
Rakud ja koed ning muud bioloogilised proovid: soovitatava protokolli kohaselt kasutatakse VialTweeter-ultraheliseadme 30% võimsusel, tsükliga 10 sekundit sisse / 10 sekundit välja, mida korratakse 3 korda. Proove tuleb töötlemise ajal hoida jääl ning tsüklit tuleb korrata veel kaks korda, kui töödeldakse ≥5 miljonit rakku. (vt Wojtkiewicz jt, 2021)
Mida peaksin tegema, kui mu S-Trap™ kolonn ummistub proovi laadimise ajal?
Kolonni ummistumise põhjuseks on tavaliselt DNA kõrge viskoossus või ebapiisav selitamine. Selle probleemi lahendamiseks tsentrifuugige lüsaati enne pipeteerimist põhjalikult ja veenduge, et DNA on ultraheli abil piisavalt tükeldatud.
Kuidas aitab kontaktivaba ultrahelitöötlus kaasa kvantitatiivse proteoomika töövoogudele?
Kvantitatiivsetes uuringutes võib isegi proovidevaheline vähene ristsaastumine moonutada harva esinevate peptiidide mõõtmistulemusi. VialTweeteri suletud toruga mitme proovipudeli töötlemissüsteem välistab sondi sisestamise, tagab partiidevahelise reprodutseeritavuse ja säilitab proovi terviklikkuse, mis võimaldab teha täpseid võrdlevaid analüüse.
Millist valgu saagist ja MS-sügavust võin selle protokolli puhul oodata?
Alustades 50 mg inimese südamekudedest või 5 miljonist rakust, annab S-Trap™-töövoog tavaliselt piisava koguse peptiide 30–50 LC-MS-süstiks, tuvastades iga analüüsi käigus järjepidevalt üle 4 000 unikaalse valgu. (vt Wojtkiewicz jt., 2021)
Kirjandus / Viited
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics pakub võimsaid kontaktivabasid ultraheliseadmeid proovide ettevalmistamiseks ja kliiniliseks analüüsiks. Mitme auguga plaadi ultraheliseade UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn ja voolu-ultraheliseade GDmini2 töötlevad proove neid puudutamata.