Mikroplaadi ultrahelitöötlus shotgun-proteoomikas – Kasutusjuhend
Shotgun-proteoomika sõltub tõhusast ja korratavast proovide ettevalmistamisest, et muuta keeruline bioloogiline materjal LC-MS/MS-analüüsiks sobivateks peptiidideks. UIP400MTP mikroplaadi ultraheliseade toetab seda protsessi, võimaldades väikese mahuga proovide standardiseeritud ja paralleelset ultrahelitöötlust, aidates laboritel parandada proovide lagundamist, ekstraheerimist ja uuesti lahustamist mikroplaadil põhinevates töövoogudes. Käesolevas rakendusjuhendis kirjeldatakse, kuidas UIP400MTP-d saab integreerida proteoomilisse proovide ettevalmistamisse, kasutades laboris testitud näitena PLA2G12A/Th17 uuringutest avaldatud ekstratsellulaarsete vesikulite töövoolu.
Mikroplaadi ultrahelitöötlus, et saavutada paremini korratav shotgun-proteoomika
Proteoomika uurijate jaoks on korratav proovide ettevalmistamine ülioluline kõrgekvaliteediliste LC-MS/MS-andmete saamiseks. UIP400MTP mikroplaadi ultraheliseade toetab standardiseeritud, paralleelset ultrahelitöötlust nii plaadipõhistes kui ka väikese mahuga ja suure läbilaskevõimega töövoogudes.
See on eriti kasulik laboritele, mis tegelevad:
- Suured proovikogumid, mis nõuavad ühtset töötlemist paljudes kaevudes
- Piiratud sisendmaterjal, mille puhul tuleb proovi kadu ja varieeruvus viia miinimumini
- Lipideid sisaldavad proovid, näiteks rakuvälised vesiklid
- Keerukad bioloogilised preparaadid, mis nõuavad tõhusat lagundamist, ekstraheerimist või uuesti lahustamist
- Võrdlev shotgun-proteoomika, kus oluline on tulemuste korratavus erinevates tingimustes ja kordustes
Integreerides mikroplaadi ultrahelitöötluse enne lagundamist, saavad teadlased parandada proovide valmisolekut järgmistel eesmärkidel:
- Valgu ekstraheerimine ja taaslahustamine
- Trypsiini/Lys-C lagundamine
- Andmete kogumine Nano-LC/MS/MS-meetodil
- Kvantitatiivne proteoomika analüüs järgnevas etapis
Tutvuge, kuidas mikroplaadi ultrahelitöötlus aitab vähendada käsitsi teostatavate toimingute varieeruvust, parandada proovide purustamist ning valmistada ette keerukaid bioloogilisi proove usaldusväärseks LC-MS/MS analüüsiks.
Mikroplaadi ultrahelitöötlus võib olla kasulik:
- Proteoomika keskused
- Elektrisõidukite uurimislaborid
- Immunoloogia ja rakubioloogia laborid
- Translatsioonilised uurimisrühmad
- Eluteaduste valdkonna meeskonnad, kes laiendavad oma tegevust ühe proovi ettevalmistamisest suurema läbilaskevõimega töövoogudeni
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
Suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistamine rakuväliste vesikulite proteoomi analüüsiks
Mis on Shotgun-proteoomika?
Shotgun-proteoomika on muutunud keskseks analüüsistrateegiaks keerukate bioloogiliste proovide iseloomustamisel, alates tervete rakkude lüsaatidest ja koekstraktidest kuni puhastatud organellide, ekstratsellulaarsete vesikulite ja väikese sisendkogusega kliiniliste proovideni. Selle peamine tugevus seisneb valkude lagundamise, kõrge eraldusvõimega vedelikkromatograafia-tandem-massispektromeetria ning arvutusliku peptiidist valgu järeldamise ühendamises. Lõpliku proteoomi andmekogumi kvaliteet määratakse aga kindlaks juba ammu enne, kui proov jõuab massispektromeetrini. Proovi tõhus purustamine, valkude lahustamine, segavate ainete eemaldamine, korratav ensümaatiline lagundamine ja usaldusväärne peptiidide eraldamine on kõik otsustava tähtsusega katvuse sügavuse ja kvantitatiivse usaldusväärsuse tagamisel.
Proteoomika uurijate ja piiratud või väärtuslike proovidega töötavate bioteaduste laborite jaoks on proovide ettevalmistamine sageli kitsaskoht.
UIP400MTP tagab usaldusväärse proovide ettevalmistamise ja lihtsa integreerimise olemasolevate labori töövoogudega
Rakuväliste vesikulite väljakutse proteoomikas
Näiteks rakuvälised vesiklid (EV-d) kujutavad endast eriti keerulist prooviliiki. Need on membraaniga ümbritsetud, lipiididerikkad, nanomõõtmetega osakesed, millel on suhteliselt madal valkude saagis ja suur oht lipiidide, soolade, detergentide, seerumvalkude ja muude maatriksi komponentide ülekandumiseks. Need omadused võivad häirida lagundamise efektiivsust, kromatograafilist tulemuslikkust, elektrospray-stabiilsust ja peptiidide identifitseerimist. Seetõttu peab EV-proteoomika ettevalmistusprotsess olema piisavalt tugev, et purustada vesiklite struktuurid ja lahustada valkude sisu, jäädes samal ajal ühilduvaks järgneva ensümaatilise lagundamise ja LC-MS/MS analüüsiga.
Selles kontekstis pakub mikroplaadiga ühilduv ultrahelitöötlus praktilist lähenemisviisi proovide korratavaks ja paralleelseks töötlemiseks. Hielscheri mikroplaadiga ühilduvad ultraheliseadmed mudelid UIP400MTP (400 W) ja UIP550MTP (550 W) on mõeldud proovide ultrahelitöötluseks mitme auguga plaatidel ja väikese mahuga anumates, toetades suurema läbilaskevõimega töövooge kui tavapärased ühe sondiga ultraheliseadmed. Proteoomikalaborite jaoks on see formaat atraktiivne, kuna see võimaldab vähendada käsitsitööga seotud variatiivsust, parandada mitme proovi paralleelset töötlemist ning integreeruda loomulikumalt plaadipõhistesse proovide ettevalmistamise protsessidesse.
Näidis-töövoog
Hiljutine rakuväliste vesikulite proteoomika töövoog PLA2G12A-st tingitud Th17-rakkude bioloogias pakub kasulikku, laboris testitud näidet sellest, kuidas mikroplaadi sonikaatorit UIP400MTP saab integreerida shotgun-proteoomika proovide ettevalmistamisse. Selles uuringusarjas töötleti ekstratsellulaarsete vesikulite proove proteoomi analüüsiks metanooliga töötlemise, UIP400MTP sonikatsiooni, tsentrifuugimise, kuivatamise, trüpsiini/Lys-C lagundamise ning nano-voolu LC-kõrglahutusega tandem-MS-i abil. Sama bioloogiline töö avaldati esmalt bioRxivi eeltrükisena ja seejärel ajakirjas „Cell Reports“, kus proteoomikaanalüüs aitas iseloomustada, kuidas PLA2G12A muudab EV-de lastiproteiine patogeensete T-rakkude vastuste kontekstis.
96-auguga plaadi ultraheli-ekstraktor UIP400MTP suure läbilaskevõimega valkude ekstraheerimiseks
Sonicator: UIP400MTP mikroplaadi sonikaator
Sisend: 5 µg EV-valgu ekvivalenti
Seede: Trüpsiin/Lys-C
Näit: Nano-LC-MS/MS / DIA-proteoomika
Samm-sammuline juhend: UIP400MTP-meetodil toetatud elektrisõiduki proovide ettevalmistamine Shotgun-proteoomika jaoks
Käesolevas töövoos kirjeldatakse UIP400MTP mikroplaadi ultraheliseadme abil rakendatavat ekstratsellulaarsete vesikulite (EV) proovide ettevalmistamise meetodit, mis nõuab vähe sisendmaterjali. See põhineb avaldatud EV-proteoomika töövoogul, mille raames EV-proovid normaliseeriti, kuivatati, töödeldi metanooliga, sonikeeriti, lagundati trüpsiiniga/Lys-C-ga, hapestati ja analüüsiti nano-LC-MS/MS-meetodil.
Meetod on mõeldud proteoomika uurijatele ja bioteaduste laboritele, kes valmistavad ette ekstratsellulaarseid vesikuleid (EV) või muid väikese mahuga, lipiididerikkaid bioloogilisi proove alt-üles-meetodil põhineva shotgun-proteoomika jaoks.
Töövoo ülevaade
| Etapp | Eesmärk | Peamine tulemus |
|---|---|---|
| Elektriauto ettevalmistamine | EV-proovide eraldamine, pesemine ja koguse määramine | Normaliseeritud EV sisend |
| Proovi kuivatamine | Eemaldage vedelik enne lahustiga töötlemist | Kuivatatud EV-materjal |
| Metanooliga töötlemine | Toetada lipiididerikka EV-materjali lagunemist | Metanooliga niisutatud proov |
| UIP400MTP ultrahelitöötlus | Edendada murrangulisi muutusi, ressursside kasutamist ja ühtlustamist | Töödeldud EV-proov |
| Seedimist | Peptiidide sünteesimine EV-valkudest | Trüpsiiniga/Lys-C-ga lagundatud peptiidid |
| LC-MS/MS analüüs | Peptiidide eraldamine, tuvastamine ja kvantifitseerimine | Proteoomika andmekogum |
| Andmete analüüs | Peptiidide ja valkude identifitseerimine ja kvantifitseerimine | Tulemused valkude tasandil |
Samm-sammuline juhend
| samm | Juhend | Olulised parameetrid |
|---|---|---|
| 1 | Valmistage puhastatud EV-proovid laboris kehtiva isoleerimisprotseduuri kohaselt. | Eemaldage rakud, jäägid ja suuremad saasteained enne proteoomika ettevalmistamist. |
| 2 | Määrake EV-valgu sisaldus, näiteks BCA-meetodiga. | Normaliseeri kõik proovid nii, et nende valguekvivalentne sisend oleks võrdne. |
| 3 | Kandke 5 µg EV-valgu ekvivalenti puhtadesse PCR-torudesse või sobivatesse väikese mahuga torudesse. | Kui proovi kadu on probleemiks, kasutage madala siduvusega torusid. |
| 4 | Kuivatage EV-proovid täielikult. | Vältige ülekuumenemist; veenduge, et nähtavat vedelikku ei oleks jäänud. |
| 5 | Lisage igale kuivatatud EV-proovile 25 µL metanooli. | Veenduge, et kuivatatud materjal oleks täielikult läbi niisutatud. |
| 6 | Töötlege proove 3 minutit ultraheliga, kasutades UIP400MTP mikroplaadi ultraheli seadet. | Kasutage kõigi proovide puhul ühesuguseid ultrahelitöötluse seadeid ja paigutusloogikat. |
| 7 | Tsentrifuugige ultraheliga töödeldud proove 19 000 × g kiirusel 20 minutit 4 °C juures. | Vältige tsentrifuugimise järel graanulite või lahustumatu materjali segamist. |
| 8 | Eemalda ettevaatlikult 20 µL supernatanti. | Kasutage kõigi proovide puhul ühtset pipeteerimistehnikat. |
| 9 | Kuivatage järelejäänud proovimaterjal täielikult kuivaks. | Jätkake otse lagundamisega või hoidke seda ainult valideeritud tingimustes. |
| 10 | Lisa 4 µL 100 ng/µL kontsentratsiooniga trüpsiini/Lys-C lahust 50 mM ammooniumbikarbonaadis. | Valmistage ensüümilahus värskelt või kasutage nõuetekohaselt säilitatud alikvoote. |
| 11 | Käsitle kuivatatud valguainet lühikest aega ultraheliga, et see lagunduslahuses lahustuks. | Koguge pärast ultrahelitöötlust kogu vedelik toru põhja. |
| 12 | Lõhustada 2 tundi 37 °C juures, loksutades kiirusel 300 rpm. | Hoidke korgid tihedalt suletuna, et vältida aurustumist. |
| 13 | Lisage 1 µL 1,25% TFA-d, et happeerida lagundusvedelik. | Happestamine peatab lagundamise ja valmistab peptiidid ette LC-MS/MS-analüüsiks. |
| 14 | Kandke hüdrolüsaat üle LC-MS-ga ühilduvatesse viaalidesse või plaatidele. | Vältige lahustumatute osakeste edasikandmist. |
| 15 | Analüüsida nano-LC-MS/MS meetodil. | Kasutage ühtlast süstimismahutavust, LC-gradienti ja MS-andmete kogumise seadeid. |
| 16 | Töötle toorandmeid vastavalt vajadusele DIA-, DDA- või sihtproteoomika tarkvara abil. | Kasutage sobivat andmebaasi, ensüümi spetsiifilisust, modifikatsiooniseadeid ja FDR-lävesid. |
Mitme kaevuga plaadi sonikaatori UIP400MTP
Miks kasutada mikroplaadi ultrahelitöötlust?
Seade UIP400MTP võimaldab väikese mahuga proovide standardiseeritud ja paralleelset ultrahelitöötlust. See on kasulik juhul, kui olulised on tulemuste korratavus, väike proovikogus ja mitme proovi töötlemise võime.
Kasutage mis tahes tavalist mikroplaati! Proovide ettevalmistamine suure läbilaskevõimega seadmega UIP400MTP
Viidatud EV-proteoomika töövoos kasutati 5 µg valgu ekvivalenti EV-sisendit, 25 µL metanooli, 3-minutilist UIP400MTP-sonikatsiooni, trüpsiini/Lys-C lagundamist, TFA-ga hapestamist ja nano-LC-MS/MS analüüsi.
Soovitatavad LC-MS/MS-meetodid ja andmete analüüsi etapid
Pärast lagundamist ja hapestamist saab proove analüüsida nano-vooluga pöördfaasi vedelikkromatograafia abil, mis on ühendatud kõrge eraldusvõimega tandem-massispektromeetriaga. Avaldatud töövoos eraldati peptiidid nano-LC-süsteemis ja analüüsiti andmetest sõltumatu andmete kogumise meetodil Orbitrap-massispektromeetril.
| Etapp | Soovitus | Eesmärk |
|---|---|---|
| Proovi laadimine | Kasutage C18-lõksu või samaväärset peptiidide laadimisseadet. | Kontsentreerib peptiide ja eemaldab väga polaarsed saasteained. |
| Peptiidide eraldamine | Kasutage nano-vooluga pöördfaasilist vedelikkromatograafiat. | Parandab peptiidide eraldamist ja massispektromeetri tundlikkust. |
| MS-i omandamine | Kasutage sõltuvalt uuringu ülesehitusest DIA-d, DDA-d või sihtotstarbelist MS-i. | Loo peptiiditasandi spektraalandmeid. |
| Andmebaasi otsing | Kasutage liigile sobivat andmebaasi. | Võimaldab peptiidide ja valkude identifitseerimist. |
| FDR-juhtimine | Kohalda peptiidide ja valkude valeavastuste määra künniseid. | Mõjutab identifitseerimise usaldusväärsust. |
| Kvantifitseerimine | Ekspordi peptiidide, prekursorite ja valkude esinemissageduse tabelid. | Võimaldab rühmadevahelist statistilist võrdlust. |
Kvaliteedikontrolli kontrollnimekiri
- Veenduge, et kõigi proovide puhul on kasutatud võrdset kogust EV-valgu ekvivalenti.
- Kasutage juhuslikult valitud või tasakaalustatud valimite töötlemise skeeme.
- Hoidke metanooli maht, ultrahelitöötluse aeg, kuivamisaeg ja lagundamise maht ühtlasena.
- Jälgige peptiidide saagist ja tuvastatud valkude koguhulka.
- Kontrollige lõhustumata jääkide määra ja peptiidide pikkuse jaotust.
- Kontrollige kromatograafilise piigi kuju ja retentsiooniaja korratavust.
- Jätke tühjad kohad, et jälgida ülekandumist.
- Kasutage suuremate uuringute puhul koondatud kvaliteedikontrolliproove.
- Hinda kordusvariatsioonikoefitsienti.
- Kasutage PCA-d või sellega seotud meetodeid partiiefektide või hälbivate proovide tuvastamiseks.
Soovitused protokollide koostamiseks
Selle töövoo avaldamisel või dokumenteerimisel tuleb märkida EV sisendkogus, plaadi formaat, metanooli maht, UIP400MTP amplituud ja ultrahelitöötluse kestus, tsentrifuugimistingimused, kuivatamismeetod, lagundamispuhver, ensüümi kontsentratsioon, lagundamisaeg, hapestamistingimused, LC-MS/MS-platvormi, andmete kogumise režiimi, tarkvara versiooni, andmebaasi, FDR-läve, normaliseerimismeetodi ja statistilise töövoo.
Kõik Hielscheri mikroplaadi ultraheliseadmed salvestavad automaatselt olulised protsessiparameetrid, nagu amplituud, ultrahelitöötluse kestus ja temperatuur, koos kuupäeva- ja ajamärgistusega integreeritud SD-kaardile CVS-failina. Andmete protokollimine reprodutseeritavuse ja kvaliteedikontrolli eesmärgil pole kunagi olnud lihtsam!
DIA-proteoomika puhul kasutage kõigi proovide puhul ühtseid andmete kogumise seadeid ning lisage võimaluse korral koondatud kvaliteedikontrolliproovid. Jälgige prekursorite arvu, retentsiooniaja stabiilsust ja korduste vahelist variatiivsust.
Käesolev töövoog on laboris testitud näide elektromobiilide proteoomika kohta. Muude prooviliikide puhul tuleb enne uuringu täismahule laiendamist optimeerida sisestatav kogus, lahusti tingimused, ultrahelitöötluse aeg, lagundamise maht ja LC-MS/MS süstimisstrateegia.
Uuringu üksikasjalik kirjeldus: EV-shotgun-proteoomika PLA2G12A uuringus
PLA2G12A uuring on konkreetne näide UIP400MTP kasutamisest shotgun-proteoomika töövoos. Bioloogiline küsimus oli, kuidas sekreteeritud fosfolipaas PLA2G12A modifitseerib Th17-rakkudest pärinevaid ekstratsellulaarseid vesikuleid ja mõjutab seeläbi patogeensete T-rakkude diferentseerumist. Autorid näitasid, et PLA2G12A mõjutab ekstratsellulaarsete vesikulite membraane, tekitades lüsofosfolipiide, sealhulgas 1-oleoil-lüsofosfatidüületanoolamiini, ning et LPA2 kaudu toimuv lüsofosfatidhappe signaalimine aitab kaasa Th17-rakkude diferentseerumisele. Lisaks lipiidide signaalimisele uuriti uuringutes ka ekstratsellulaarsete vesikulite sisu, sealhulgas RNA- ja valkude sisaldust, mistõttu sai shotgun-proteoomikast iseloomustamisstrateegia oluline osa.
EV-valmistamise töövoos kasvatati Th17-rakke keskkonnas, mis sisaldas eksosoomidest vabastatud veise loote seerumit. Kultuuri supernatantid tsentrifuugiti esmalt rakkude eemaldamiseks, filtreeriti läbi 0,22 µm filtri, kontsentreeriti ultrafiltratsiooni/ultratsentrifuugimise teel, pestud, resuspendeeriti PBS-is ja kvantifitseeriti BCA valguanalüüsiga. See EV-de eelnev ettevalmistus tagas, et proteoomika töövoogusse saaks viia kindlaksmääratud valgu ekvivalendina väljendatud kogus EV-materjali.
Shotgun-proteoomika analüüsiks kasutasid autorid EV-proove, mis vastasid 5 µg valgu ekvivalendile. Need proovid kuivatati PCR-torudes ja neile lisati 25 µL metanooli. Seejärel sonikeeriti proove 3 minutit, kasutades UIP400MTP mikroplaadi sonikaatorit. Pärast sonikatsiooni tsentrifuugiti proove 4 °C juures 20 minutit kiirusel 19 000 × g. Pärast 20 µL supernatandi eemaldamist tsentrifuugiti proove kuivaks. Seejärel lahustati valgud ultrahelitöötlemise abil 4 µL trüpsiini/Lys-C lahuses kontsentratsiooniga 100 ng/µL 50 mM ammooniumbikarbonaadis. Hüdrolüüsi teostati 2 tundi 37 °C juures, loksutades kiirusel 300 rpm. Hüdrolüsaati hapestati 1 µL 1,25% trifluoroäädikhappega ja analüüsiti nano-voolu LC-kõrglahutusega tandem-massispektromeetria abil.
Käesolev töövoog toob esile mitu kasulikku põhimõtet väikese sisendkogusega EV-proteoomika jaoks. Esiteks normaliseeriti sisend valgu ekvivalendi alusel, mis on oluline erinevate genotüüpide või ravirežiimide EV-de võrdlemisel. Teiseks kasutati enne ultrahelitöötlust metanooli, mis soodustas rakkude purustamist ja ekstraktsiooni, vältides samal ajal detergentide kasutamist, mis võivad LC-MS/MS-analüüsi keerulisemaks muuta. Kolmandaks oli ultrahelitöötlusetapp lühike ja standardiseeritud, mis sobib hästi paralleelse proovide töötlemisega. Neljandaks viidi trypsiini/Lys-C lagundamine läbi väga väikeses mahus, vähendades lahjendamist ja soodustades vähese sisendiga peptiidide saagikust. Lõpuks vähendas otsene üleminek lagundamiselt hapestamisele ja LC-MS/MS-ile tarbetuid käitlemisetappe.
Järgnevas LC-MS/MS-meetodis kasutati nano-vooluga pöördfaasi eraldamist, mis oli ühendatud Q-Exactive HF Orbitrap massispektromeetriga. Proovid koguti C18 eelkolonnile, seejärel eraldati need siseläbimõõduga 50 µm analüütilises kolonnis voolukiirusel 200 nL/min ja temperatuuril 40 °C. Gradient kulges 60 minuti jooksul madala orgaanilise lahusti sisaldusest kuni 35% lahustini B, millele järgnes kõrge orgaanilise lahusti sisaldusega pesemine ja tasakaalustamine. MS-andmete kogumine toimus positiivsete ioonide režiimis, kasutades andmetest sõltumatut andmete kogumist koos kõrgemal energiatasemel toimuva kokkupõrke dissotsiatsiooniga. DIA-toorfailid analüüsiti programmi DIA-NN 1.8 abil, kasutades arvutisimulatsiooni teel ennustatud spektrite andmebaasi.
Suure läbilaskevõimega valkude ekstraheerimine 96-augulise plaadiga sonikaatoriga UIP400MTP
Korduma kippuvad küsimused
Kes saab shotgun-proteoomikas mikroplaadi ultrahelitöötlusest kõige rohkem kasu?
Mikroplaadi ultrahelitöötlus on eriti kasulik proteoomika laborites, kus töödeldakse mitut proovi paralleelselt, sealhulgas ühiskasutuslaborites, proteoomi uurimisrühmades, immunoloogia laborites, translatsioonilise teadustöö meeskondades ning eluteaduste laborites, mis liiguvad suurema läbilaskevõimega LC-MS/MS-töövoogude suunas. See on eriti oluline juhul, kui proovidevaheline reprodutseeritavus on otsustava tähtsusega.
Miks kasutada UIP400MTP-d tavalise sondiga ultraheliseadme asemel?
Tavapärane sondsonikaator töötleb proove tavaliselt ükshaaval ning nõuab proovide vahel hoolikat puhastamist, et vähendada ülekandumist. Mikroplaadi ultraheli-seadmete mudelid UIP400MTP ja UIP550MTP toetavad paralleelset ultrahelitöötlust plaadipõhises või väikese mahuga formaadis, aidates vähendada käsitsitööd, parandada tulemuste ühtlust ja tõhustada mitme proovi ettevalmistamist. Need võimaldavad ka hõlpsat integreerimist automatiseeritud töövoogudesse.
Milline on ultraheli kasutamine shotgun-proteoomika töövoos?
Ultraheli töötlemist kasutatakse tavaliselt proovi ettevalmistamise etapis enne ensüümilist lagundamist. See aitab kaasa rakkude purustamisele, ekstraktsioonile, homogeniseerimisele ja uuesti lahustumisele enne ensüümilist lagundamist trüpsiiniga, Lys-C-ga või trüpsiini ja Lys-C seguga.
Lisaks võib ultraheli kasutada ka lagundamise käigus, et märkimisväärselt kiirendada valkude ensümaatilist lagundamist. Avastage ultraheli abil toimuva suure läbilaskevõimega valkude lagundamise potentsiaal kiire proteoomika töövoo jaoks!
Kas mikroplaadi ultrahelitöötlus on kasulik rakuväliste vesikulite proteoomika uurimisel?
Jah. Rakuvälised vesiklid on lipiididerikkad, membraaniga ümbritsetud osakesed, mille töötlemine reprodutseeritavalt võib osutuda keeruliseks. Viidatud PLA2G12A uuringutes töödeldi EV-proove metanooliga, sonikeeriti seadmega UIP400MTP, kuivatati, lagundati trüpsiiniga/Lys-C-ga ja analüüsiti nano-LC/MS/MS-meetodil.
Millistele prooviliikidele võib mikroplaadi ultrahelitöötlus kasu tuua?
Mikroplaadi ultrahelitöötlus võib olla kasulik rakulüsaatide, organellide fraktsioonide, immunopretsipitaatide, valkude agregaatide, membraanirikkaste proovide, ekstratsellulaarsete vesikulite ja muude väikese mahuga bioloogiliste preparaatide puhul. Iga proovitüübi puhul tuleks optimeerida ultrahelitöötluse intensiivsust ja kestust, lahusti tingimusi, sisestatavat kogust ning lagundamisstrateegiat.
Kas ultrahelitöötlus asendab ensüümilist lagundamist?
Ei. Ultrahelitöötlus aitab proovi lagundamiseks ette valmistada, parandades rakkude purustamist, ekstraktsiooni või uuesti lahustumist. Proteolüütiline lagundamine on endiselt vajalik peptiidide saamiseks „bottom-up“ shotgun-proteoomika jaoks.
Loe lähemalt ultraheliga kiirendatud valkude lagundamisest proteoomika töövoogudes!
Kas UIP400MTP sobib kasutamiseks madala sisendiga proteoomikas?
Jah, mikroplaadi formaat sobib hästi väikese mahuga töövoogudele, kus proovi säilitamine ja ühtlane töötlemine on olulised. Avaldatud EV-töövoos viidi proteoomika ettevalmistus läbi 5 µg valgu ekvivalendiga EV-sisendiga.
Kas mikroplaadi ultrahelitöötlus võib parandada tulemuste korratavust?
Hielscheri ultraheliseadmed tagavad tulemuste korratavuse, rakendades mitmete proovide puhul standardiseeritud ultrahelitöötlemise tingimusi. Siiski mõjutavad proteoomika üldist korratavust ka muud tegurid, nagu rakkude või ekstratsellulaarsete osakeste eraldamine, sisendproovide normaliseerimine, lagundamise efektiivsus, LC-MS/MS stabiilsus, andmete töötlemine ja statistiline analüüs.
Kas mikroplaadi ultrahelitöötlus parandab valkude identifitseerimise põhjalikkust?
See võib aidata suurendada identifitseerimissügavust, kui proovi lagundamine või uuesti lahustumine on piirav tegur. Mõju sõltub proovi tüübist, valgu keemilisest koostisest, puhastamisstrateegiast, lagundamistingimustest ja LC-MS/MS-meetodi jõudlusest.
Mida tuleks optimeerida enne töövoo rutiinse kasutuselevõttu?
Peamised parameetrid hõlmavad proovi sisestamist, puhvri või lahusti koostist, plaadi formaati, ultraheli amplituudi ja kestust, kuivatamistingimusi, lagundamismahtu, ensüümi kontsentratsiooni, inkubatsiooniaega ning LC-MS/MS süstimiskogust. Enne töövoo rakendamist täielikule katseseeriale on soovitatav läbi viia pilootkatsed.
Kas seda töövoogu saab kasutada DIA-proteoomikas?
Jah. Viidatud EV-töövoos kasutati andmesõltumatut andmete kogumist, millele järgnes DIA-NN-analüüs. Mikroplaadi ultrahelitöötlus on osa proovide ettevalmistamise algfaasist ning seda saab integreerida DIA-, DDA- või sihtproteoomika meetoditega.
Milliseid kvaliteedikontrolli näitajaid tuleks jälgida?
Soovitatavad kvaliteedikontrolli näitajad hõlmavad peptiidide saagist, identifitseeritud peptiidide ja valkude rühmade arvu, lõikamata jäänud peptiidide osakaalu, peptiidide pikkuse jaotust, kromatograafilise piigi kuju, retentsiooniaja stabiilsust, korduskatse variatsioonikoefitsienti, ülekandumist ning bioloogiliste rühmade eraldamist PCA või sellega seotud meetodite abil.
Milline on mikroplaadi ultraheliseadmete mudelite UIP400MTP või UIP550MTP integreerimise peamine eelis proteoomika proovide ettevalmistamisel?
Peamine eelis on väikese mahuga proovide standardiseeritud ja paralleelne töötlemine. See aitab laboritel vähendada käsitsi töötlemisest tulenevat varieeruvust ning valmistada keerukaid bioloogilisi proove ühtlasemalt ette lagundamiseks, LC-MS/MS-andmete kogumiseks ja kvantitatiivseks proteoomikaanalüüsiks.
Hielscheri mikroplaadi ultraheliseadmed on võimalik sujuvalt integreerida automatiseeritud töövoogudesse.
Kirjandus / Viited
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Mochizuki-Ono C., Taketomi Y., Irie A., Kano K. et al. (2026): PLA2G12A-driven extracellular vesicle-lipid signaling amplifies pathogenic T cell responses in inflammatory diseases. Cell Reports 45, 2026.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Lischnig A., Bergqvist M., Ochiya T., Lässer C. (2023): Corrigendum for “Quantitative Proteomics Identifies Proteins Enriched in Large and Small Extracellular Vesicles”. Molecular & Cellular Proteomics, 22; 2023.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid alates Lab kuni tööstuslik suurus.