Mikroplaatide ultraheli töötlus shotgun-proteoomikas – rakendusjuhend
Shotgun-proteoomika sõltub tõhusast ja reprodutseeritavast proovide ettevalmistusest, et muuta keeruline bioloogiline materjal peptiidideks, mis sobivad LC-MS/MS analüüsiks. Mikroplaatide sonikaator UIP400MTP toetab seda protsessi, võimaldades väikese mahuga proovide standardiseeritud paralleelset ultraheli töötlust (sonikeerimist) ning aidates laboritel parandada lõhkumist, ekstraheerimist ja uuesti lahustamist mikroplaadipõhistes töövoogudes. See rakendusjuhend kirjeldab, kuidas seadet UIP400MTP saab integreerida proteoomika proovide ettevalmistusse, kasutades laboris testitud näitena PLA2G12A/Th17 uuringutes avaldatud rakuväliste vesiikulite töövoogu.
Mikroplaatide ultraheli töötlus reprodutseeritavama shotgun-proteoomika jaoks
Proteoomikauurijate jaoks on reprodutseeritav proovide ettevalmistus kvaliteetsete LC-MS/MS andmete saamisel ülioluline. Mikroplaatide sonikaator UIP400MTP toetab standardiseeritud paralleelset ultraheli töötlust (sonikeerimist) plaadipõhistes ning väikese mahuga/suure läbilaskevõimega töövoogudes.
See on eriti kasulik laboritele, mis töötavad järgmisega:
- Suured proovikomplektid, mis nõuavad ühtlast töötlust paljudes aukudes
- Piiratud koguses lähtematerjal, kus proovikadu ja varieeruvust tuleb minimeerida
- Lipiidirikkad proovid, näiteks rakuvälised vesiikulid
- Keerulised bioloogilised preparaadid, mis vajavad tõhusat lõhkumist, ekstraheerimist või uuesti lahustamist
- Võrdlev shotgun-proteoomika, kus reprodutseeritavus eri tingimuste ja replikaatide vahel on hädavajalik
Mikroplaatide ultraheli töötluse integreerimine enne lagundamist võimaldab teadlastel parandada proovide valmisolekut järgmisteks etappideks:
- Valkude ekstraheerimine ja uuesti lahustamine
- Trüpsiin/Lys-C lagundamine
- Nano-LC/MS/MS andmete kogumine
- Kvantitatiivne järgnev proteoomikaanalüüs
Uurige, kuidas mikroplaatide ultraheli töötlus aitab vähendada käsitsitöötlusest tingitud varieeruvust, parandada proovide lõhkumist ning valmistada keerulisi bioloogilisi proove ette usaldusväärseks LC-MS/MS analüüsiks.
Mikroplaatide ultraheli töötlusest võivad kasu saada:
- Proteoomika tuumiklaborid
- Rakuväliste vesiikulite uurimislaborid
- Immunoloogia- ja rakubioloogialaborid
- Translatiivse uurimistöö rühmad
- Bioteadusmeeskonnad, kes liiguvad üksikproovide ettevalmistuselt suurema läbilaskevõimega töövoogudele
Suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistus rakuväliste vesiikulite proteoomi analüüsiks
Mis on shotgun-proteoomika?
Shotgun-proteoomikast on saanud keskne analüütiline strateegia keeruliste bioloogiliste proovide iseloomustamiseks alates tervete rakkude lüsaatidest ja kudede ekstraktidest kuni puhastatud organellide, rakuväliste vesiikulite ning väikese lähtekogusega kliiniliste proovideni. Selle põhitugevus seisneb valkude lagundamise, kõrglahutusega vedelikkromatograafia-tandem-massispektromeetria ning arvutusliku peptiidilt valgule järeldamise sidumises. Lõpliku proteoomiandmestiku kvaliteet määratakse aga kindlaks juba kaua enne seda, kui proov jõuab massispektromeetrisse. Tõhus proovi lõhkumine, valkude lahustamine, segavate ainete eemaldamine, reprodutseeritav ensümaatiline lagundamine ja töökindel peptiidide taaskasutus on kõik määrava tähtsusega katvuse sügavuse ja kvantitatiivse usaldusväärsuse jaoks.
Piiratud või väärtuslike proovidega töötavate proteoomikauurijate ja bioteaduslaborite jaoks on proovide ettevalmistus sageli kitsaskoht.
UIP400MTP tagab usaldusväärse proovide ettevalmistuse ja lihtsa integreerimise olemasolevatesse laboritöövoogudesse
Rakuväliste vesiikulite väljakutse proteoomikas
Rakuvälised vesiikulid (EV-d) kujutavad endast eriti nõudlikku proovitüüpi. Need on membraaniga ümbritsetud, lipiidirikkad nanomõõtmelised osakesed, millel on suhteliselt väike valgusaagis ja suur potentsiaal lipiidide, soolade, detergentide, seerumivalkude ja muude maatriksikomponentide ülekandumiseks. Need omadused võivad mõjutada seedimise tõhusust, kromatograafilist jõudlust, elektropihustuse stabiilsust ja peptiidide identifitseerimist. EV proteoomika proovi ettevalmistamise töövoog peab seetõttu olema piisavalt tugev, et lõhkuda vesiikulite struktuure ja solubiliseerida valgukoormat, jäädes samas ühilduvaks järgneva ensümaatilise seedimise ja LC-MS/MS analüüsiga.
Selles kontekstis pakub mikroplaadiga ühilduv ultraheli töötlus praktilise lähenemise korratavaks ja paralleelseks proovitöötluseks. Hielscheri mikroplaadi sonikaatorite mudelid UIP400MTP (400 W) ja UIP550MTP (550 W) on mõeldud proovide sonikeerimiseks mitmekaevulistes plaatides ja väikese mahuga anumates ning toetavad suurema läbilaskevõimega töövooge kui tavapärased üksiksondiga sonikaatorid. Proteoomikalaboritele on see formaat atraktiivne, sest see võib vähendada käsitsi töötlemisest tulenevat varieeruvust, parandada mitme proovi paralleelset töötlemist ja integreeruda loomulikumalt plaadipõhistesse proovide ettevalmistamise liinidesse.
Näidistöövoog
Hiljutine rakuväliste vesiikulite proteoomika töövoog PLA2G12A-juhitud Th17-rakkude bioloogias pakub kasulikku, laboris testitud näidet selle kohta, kuidas mikroplaadi sonikaatorit UIP400MTP saab lisada kogu-proteoomika (shotgun) proovide ettevalmistusse. Selles uuringusarjas töödeldi EV proove proteoomilise analüüsi jaoks metanoolitöötluse, UIP400MTP sonikeerimise, tsentrifuugimise, kuivatamise, trüpsiin/Lys-C seedimise ja nanovoolu LC-kõrglahutusega tandem-MS abil. Bioloogilisest tööst anti aru 2026. aastal Mochizuki-Ono ja kolleegide poolt, kus proteoomiline analüüs aitas iseloomustada, kuidas PLA2G12A muudab EV-de kandurvalke patogeensete T-rakkude vastuste kontekstis.
96-kaevuline plaadisonikaator UIP400MTP suure läbilaskevõimega valgu ekstraktsiooniks
Sonikaator: UIP400MTP mikroplaadi sonikaator
Sisend: 5 µg EV valguekvivalenti
Seedimine: Trüpsiin/Lys-C
Väljund: Nano-LC-MS/MS / DIA proteoomika
Samm-sammuline juhend: EV proovide ettevalmistus shotgun-proteoomikaks seadme UIP400MTP abil
See töövoog kirjeldab väikese sisendiga rakuväliste vesiikulite (EV) kogu-proteoomika (shotgun) proovide ettevalmistamise meetodit, kasutades UIP400MTP mikroplaadi sonikaatorit. See põhineb avaldatud EV proteoomika töövool, kus EV proovid normaliseeriti, kuivatati, töödeldi metanooliga, sonikeeriti, seediti trüpsiin/Lys-C-ga, hapestati ja analüüsiti nano-LC-MS/MS abil.
Protseduur on mõeldud proteoomikauurijatele ja bioteaduste laboritele, kes valmistavad EV-sid või muid väikese mahuga lipiidirikkaid bioloogilisi proove ette bottom-up kogu-proteoomikaks (shotgun).
Töövoo ülevaade
| Etapp | Eesmärk | Peamine väljund |
|---|---|---|
| EV ettevalmistus | EV proovide isoleerimine, pesemine ja kvantifitseerimine | Normaliseeritud EV sisend |
| Proovi kuivatamine | Vedeliku eemaldamine enne lahustipõhist töötlust | Kuivatatud EV materjal |
| Metanoolitöötlus | Lipiidirikka EV materjali lõhkumise toetamine | Metanooliga niisutatud proov |
| UIP400MTP sonikeerimine | Lõhkumise, ekstraktsiooni ja homogeniseerimise soodustamine | Töödeldud EV proov |
| Seedimine | Peptiidide tekitamine EV valkudest | Trüpsiin/Lys-C peptiidide seedeprodukt |
| LC-MS/MS analüüs | Peptiidide eraldamine, tuvastamine ja kvantifitseerimine | Proteoomika andmestik |
| Andmeanalüüs | Peptiidide ja valkude identifitseerimine ja kvantifitseerimine | Valgutaseme tulemused |
Samm-sammuline protokoll
| Samm | Juhis | Kriitilised parameetrid |
|---|---|---|
| 1 | Valmistage puhastatud EV proovid ette, kasutades labori väljakujunenud isoleerimistöövoogu. | Eemaldage rakud, praht ja peamised saasteained enne proteoomika proovi ettevalmistust. |
| 2 | Kvantifitseerige EV valgusisaldus, näiteks BCA testiga. | Normaliseerige kõik proovid võrdse valguekvivalendi sisendini. |
| 3 | Viige 5 µg EV valguekvivalenti puhastesse PCR-tuubidesse või ühilduvatesse väikese mahuga tuubidesse. | Kasutage vähese seondumisega (low-bind) tuube, kui proovikadu on probleemiks. |
| 4 | Kuivatage EV proovid täielikult. | Vältige ülekuumenemist; veenduge, et nähtavat vedelikku ei jää. |
| 5 | Lisage igale kuivatatud EV proovile 25 µL metanooli. | Veenduge, et kuivatatud materjal on täielikult niisutatud. |
| 6 | Töötlege proove ultraheli abil 3 minutit, kasutades mikroplaadi sonikaatorit UIP400MTP. | Kasutage kõigi proovide puhul identseid sonikeerimisseadeid ja sama paigutusloogikat. |
| 7 | Tsentrifuugige sonikeeritud proove kiirusel 19 000 × g 20 minutit temperatuuril 4°C. | Vältige pelleti või lahustumatu materjali segamist pärast tsentrifuugimist. |
| 8 | Eemaldage ettevaatlikult 20 µL supernatanti. | Kasutage kõigi proovide puhul ühtlast pipeteerimistehnikat. |
| 9 | Kuivatage allesjäänud proovimaterjal täielikult. | Jätkake otse seedimisega või säilitage ainult valideeritud tingimustes. |
| 10 | Lisage 4 µL trüpsiini/Lys-C lahust kontsentratsiooniga 100 ng/µL 50 mM ammooniumvesinikkarbonaadis. | Valmistage ensüümilahus värskelt või kasutage nõuetekohaselt säilitatud alikvoote. |
| 11 | Sonikeerige lühidalt, et lahustada kuivatatud valgumaterjal seedelahuses. | Koguge pärast sonikeerimist kogu vedelik toru põhja. |
| 12 | Seedige 2 tundi temperatuuril 37 °C, loksutades kiirusel 300 p/min. | Hoidke korgid tihedalt suletuna, et vältida aurustumist. |
| 13 | Lisage 1 µL 1,25% TFA-d, et seedelahus hapestada. | Hapestamine peatab seedimise ja valmistab peptiidid ette LC-MS/MS analüüsiks. |
| 14 | Viige seedelahus LC-MS jaoks sobivatesse viaalidesse või plaatidesse. | Vältige lahustumatu prahi ülekandmist. |
| 15 | Analüüsige meetodil nano-LC-MS/MS. | Kasutage ühtlast süstimismahtu, LC gradienti ja MS registreerimisseadeid. |
| 16 | Töödelge toorandmeid DIA-, DDA- või sihipärase proteoomika tarkvaraga vastavalt vajadusele. | Rakendage sobivat andmebaasi, ensüümi spetsiifilisust, modifikatsiooniseadeid ja FDR-lävesid. |
(vrd Mochizuki-Ono et al., 2026)
Mitmekaevuliste plaatide sonikaator UIP400MTP
Miks kasutada mikroplaadi ultraheli töötlust?
UIP400MTP võimaldab väikese mahuga proovide standardiseeritud paralleelset ultraheli töötlust (sonikeerimist). See on kasulik, kui olulised on korratavus, väike proovi sisendkogus ja mitme proovi läbilaskevõime.
Kasutage mis tahes standardset mikroplaati! Suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistus seadmega UIP400MTP
Viidatud EV-proteoomika töövoos kasutati 5 µg valguekvivalendile vastavat EV sisendit, 25 µL metanooli, 3 minutit sonikeerimist seadmega UIP400MTP, trüpsiin/Lys-C seedimist, hapestamist TFA abil ja nano-LC-MS/MS analüüsi.
Soovitatavad LC-MS/MS ja andmeanalüüsi sammud
Pärast seedimist ja hapestamist saab proove analüüsida nanovoolulise pöördfaasilise LC abil, mis on ühendatud kõrglahutusega tandem-massispektromeetriaga. Avaldatud töövoos eraldati peptiidid nano-LC süsteemis ja analüüsiti andmesõltumatu registreerimisega Orbitrap-massispektromeetril.
| Etapp | Soovitus | Eesmärk |
|---|---|---|
| Proovi laadimine | Kasutage C18 püünist või samaväärset peptiidide laadimissüsteemi. | Kontsentreerib peptiidid ja eemaldab tugevalt polaarsed saasteained. |
| Peptiidide eraldamine | Kasutage nanovoolulist pöördfaasilist LC-d. | Parandab peptiidide eraldumist ja MS tundlikkust. |
| MS andmete registreerimine | Kasutage DIA, DDA või sihipärast MS meetodit sõltuvalt uuringu kavandist. | Genereerib peptiidide tasemel spektriandmeid. |
| Andmebaasiotsing | Kasutage liigile sobivat võrdlusandmebaasi. | Toetab peptiidide ja valkude identifitseerimist. |
| FDR-i kontroll | Rakendage peptiidide ja valkude valepositiivsete tuvastuste määra (FDR) lävesid. | Kontrollib identifitseerimise usaldusväärsust. |
| Kvantifitseerimine | Eksportige peptiidide, prekursorite ja valkude arvukuse tabelid. | Võimaldab rühmade vahelist statistilist võrdlust. |
Kvaliteedikontrolli kontrollnimekiri
- Veenduge, et EV valguekvivalendi sisend on kõigi proovide puhul võrdne.
- Kasutage randomiseeritud või tasakaalustatud proovitöötluse paigutusi.
- Hoidke metanooli maht, sonikeerimise aeg, kuivatusaeg ja seedimismaht ühtlased.
- Jälgige peptiidide saagist ja valkude identifitseerimiste koguarvu.
- Kontrollige vahelejäänud lõikekohtade osakaalu ja peptiidide pikkusjaotust.
- Kontrollige kromatograafilise piigi kuju ja retentsiooniaja korratavust.
- Lisage kontrollproovid (blankid) ülekande jälgimiseks.
- Kasutage suuremate uuringute puhul koondatud kvaliteedikontrolli proove.
- Hinnake korduste variatsioonikordajat.
- Kasutage PCA-d või sarnaseid meetodeid partiiefektide või kõrvalekalduvate proovide tuvastamiseks.
Protokollimise soovitused
Selle töövoo avaldamisel või dokumenteerimisel esitage EV sisendi kogus, plaadi formaat, metanooli maht, UIP400MTP amplituud ja sonikeerimise aeg, tsentrifuugimistingimused, kuivatusmeetod, seedepuhver, ensüümi kontsentratsioon, seedimisaeg, hapestamistingimused, LC-MS/MS platvorm, registreerimisrežiim, tarkvaraversioon, andmebaas, FDR-lävi, normaliseerimismeetod ja statistiline töövoog.
Kõik Hielscheri mikroplaadi sonikaatorid salvestavad olulised protsessiparameetrid, nagu amplituud, ultraheli töötluse kestus ja temperatuur, automaatselt koos kuupäeva ja kellaaja templiga CVS-failina integreeritud SD-kaardile. Andmete protokollimine reprodutseeritavuse ja kvaliteedikontrolli jaoks pole kunagi olnud lihtsam!
DIA-proteoomika puhul kasutage kõigi proovide jaoks ühtseid andmehõive seadeid ja lisage võimaluse korral koondatud kvaliteedikontrolli (QC) proovid. Jälgige prekursorite arvu, retentsiooniaja stabiilsust ja korduste varieeruvust.
See töövoog on laboris testitud näide EV-proteoomika jaoks. Teiste proovitüüpide puhul optimeerige enne täismahus uuringule üleminekut sisendkogust, lahustitingimusi, ultraheli töötluse kestust, lagundamismahtu ja LC-MS/MS süstimisstrateegiat.
Uuring üksikasjalikult: EV-de haulipüssi-proteoomika PLA2G12A uuringus
PLA2G12A uuring pakub konkreetse näite seadme UIP400MTP kasutamisest shotgun-proteoomika töövoos. Bioloogiline küsimus oli, kuidas sekreteeritav fosfolipaas PLA2G12A muudab Th17-rakkudest pärinevaid rakuväliseid vesiikuleid ja mõjutab seeläbi patogeense T-raku diferentseerumist. Autorid näitasid, et PLA2G12A toimib EV membraanidele, tekitades lüsofosfolipiide, sealhulgas 1-oleoüül-lüsofosfatidüületanoolamiini, ning et allavoolu suunatud lüsofosfatiidhappe signaalimine LPA2 kaudu soodustab Th17 diferentseerumist. Lisaks lipiidsignaalimisele uuriti töödes ka EV lasti, sealhulgas RNA ja valgu sisaldust, mistõttu on shotgun-proteoomika iseloomustusstrateegia oluline osa.
EV preparaadi valmistamise töövoos kasvatati Th17-rakke söötmes, mis sisaldas eksosoomidest vabastatud veise loote seerumit. Kultuuri supernatandid tsentrifuugiti esmalt rakkude eemaldamiseks, filtreeriti läbi 0,22 µm filtri, kontsentreeriti ultrafiltratsiooni/ultratsentrifuugimisega, pesti, suspendeeriti uuesti PBS-is ja kvantifitseeriti BCA valguanalüüsiga. See eelnev EV preparaadi valmistamine tagas, et proteomika töövoogu oli võimalik edasi viia määratletud valguekvivalentne kogus EV materjali.
Shotgun-proteoomilise analüüsi jaoks kasutasid autorid EV proove, mis vastasid 5 µg valguekvivalendile. Need proovid kuivatati PCR-tuubides ja lisati 25 µL metanooli. Seejärel sonikeeriti proove 3 minutit mikroplaadi sonikaatoriga UIP400MTP. Pärast sonikeerimist tsentrifuugiti proove 4°C juures 20 minutit kiirusel 19 000 × g. Pärast 20 µL supernatandi eemaldamist tsentrifuugiti proovid kuivaks. Seejärel lahustati valgud sonikeerimise abil 4 µL-s trüpsiini/Lys-C lahuses kontsentratsiooniga 100 ng/µL 50 mM ammooniumvesinikkarbonaadis. Seedimine toimus 2 tunni jooksul 37°C juures loksutamisega kiirusel 300 rpm. Seedelahus hapestati 1 µL 1,25% trifluoroäädikhappega ja suunati nanovoolu vedelikkromatograafia–kõrglahutusega tandem-massispektromeetria analüüsile.
See töövoog toob esile mitu kasulikku põhimõtet väikese sisendkogusega EV proteomika jaoks. Esiteks normaliseeriti sisend valguekvivalendi alusel, mis on oluline, kui võrreldakse eri genotüüpidest või töötlustest pärinevaid EV-sid. Teiseks kasutati enne sonikeerimist metanooli, mis toetab lõhkumist ja ekstraheerimist, vältides samal ajal detergendisüsteeme, mis võivad LC-MS/MS analüüsi keerulisemaks muuta. Kolmandaks oli sonikeerimise etapp lühike ja standardiseeritud, mis sobib paralleelseks proovitöötluseks. Neljandaks teostati trüpsiin/Lys-C seedimine väga väikeses mahus, mis vähendas lahjenemist ja toetas peptiidide taaskasutust väikese sisendkoguse korral. Lõpuks vähendas otsene üleminek seedimiselt hapestamisele ja LC-MS/MS analüüsile tarbetuid käsitsemisetappe.
Järgnevas LC-MS/MS meetodis kasutati nanovoolu pöördfaas-lahutust, mis oli ühendatud Q-Exactive HF Orbitrap massispektromeetriga. Proovid püüti C18 eelkolonnile, seejärel lahutati 50 µm siseläbimõõduga analüütilisel kolonnil kiirusel 200 nL/min ja temperatuuril 40°C. Gradient kulges madalast orgaanilise lahusti sisaldusest kuni 35% lahusti B-ni 60 minuti jooksul, millele järgnes kõrge orgaanilise lahusti sisaldusega pesu ja reekvilibreerimine. MS andmete kogumine toimus positiivsete ioonide režiimis, kasutades andmest sõltumatut kogumist kõrgema energiaga kokkupõrkelise dissotsiatsiooniga. DIA töötlemata failid analüüsiti tarkvaraga DIA-NN 1.8 in silico ennustatud spektriraamatukogu abil.
Suure läbilaskevõimega valgu ekstraheerimine 96-süvendilise plaadi sonikaatoriga UIP400MTP
Korduma kippuvad küsimused
Kes saab mikroplaadi sonikeerimisest shotgun-proteomikas kõige rohkem kasu?
Mikroplaadi sonikeerimine on eriti kasulik proteomika laboritele, mis töötlevad paralleelselt mitut proovi, sealhulgas tuumiklaboritele (core facilities), proteoomi uurimisrühmadele, immunoloogialaboritele, translatsiooniuuringute meeskondadele ja bioteaduste laboritele, mis liiguvad suurema läbilaskevõimega LC-MS/MS töövoogude suunas. See on eriti oluline siis, kui proovidevaheline reprodutseeritavus on kriitilise tähtsusega.
Miks kasutada seadet UIP400MTP tavapärase sondsonikaatori asemel?
Tavapärane sondsonikaator töötleb proove tavaliselt ühekaupa ja nõuab proovide vahel hoolikat puhastamist, et vähendada ülekandumist. Mikroplaadi sonikaatorite mudelid UIP400MTP ja UIP550MTP toetavad paralleelset ultraheli töötlust plaadipõhises või väikese mahuga formaadis, aidates vähendada käsitsi käsitlemist, parandada järjepidevust ja sujuvamaks muuta mitme proovi ettevalmistamist. Samuti võimaldavad need hõlpsat integreerimist automatiseeritud töövoogudesse.
Kuhu sobib ultraheli töötlus (sonikeerimine) shotgun-proteoomika töövoos?
Ultraheli töötlust (sonikeerimist) rakendatakse tavaliselt seedimiseelses proovide ettevalmistamise etapis. See võib toetada lõhkumist, ekstraheerimist, homogeniseerimist ja uuesti lahustamist enne ensümaatilist seedimist trüpsiini, Lys-C või trüpsiini/Lys-C seguga.
Lisaks saab ultraheli töötlust rakendada ka seedimise ajal, et ensümaatilist valkude seedimist oluliselt kiirendada. Avastage suure läbilaskevõimega valkude seedimise potentsiaal ultraheli töötluse abil kiire proteoomika töövoo jaoks!
Kas mikroplaadi ultraheli töötlus on kasulik rakuväliste vesiikulite proteoomikas?
Jah. Rakuvälised vesiikulid on lipiidirikkad, membraaniga ümbritsetud osakesed, mida võib olla keeruline reprodutseeritavalt töödelda. Viidatud PLA2G12A uuringutes töödeldi EV proove metanooliga, sonikeeriti need seadmega UIP400MTP, kuivatati, seediti trüpsiin/Lys-C abil ning analüüsiti meetodil nano-LC/MS/MS.
Millised proovitüübid võivad mikroplaadi ultraheli töötlusest kasu saada?
Mikroplaadi ultraheli töötlus võib olla kasulik rakulüsaatide, organellide fraktsioonide, immunosadestite, valguagregaatide, membraanirikaste proovide, rakuväliste vesiikulite ja muude väikese mahuga bioloogiliste preparaatide puhul. Iga proovitüübi puhul tuleks optimeerida ultraheli töötluse intensiivsust ja kestust, lahustitingimusi, sisendkogust ja seedimisstrateegiat.
Kas ultraheli töötlus asendab ensümaatilist seedimist?
Ei. Ultraheli töötlus aitab proovi seedimiseks ette valmistada, parandades lõhkumist, ekstraheerimist või uuesti lahustamist. Proteolüütiline seedimine on endiselt vajalik peptiidide tekitamiseks bottom-up shotgun-proteoomika jaoks.
Lugege lähemalt ultraheliga soodustatud valkude seedimise kohta proteoomika töövoogudes!
Kas UIP400MTP sobib väikese sisendkogusega proteoomikaks?
Jah, mikroplaadi formaat sobib hästi väikese mahuga töövoogudeks, kus proovi säästmine ja järjepidev töötlus on olulised. Avaldatud EV töövoos tehti proteoomika proovide ettevalmistus 5 µg valguekvivalendile vastava EV sisendiga.
Kas mikroplaadi ultraheli töötlus võib parandada reprodutseeritavust?
Hielscheri sonikaatorid toetavad reprodutseeritavust, rakendades mitme proovi puhul standardiseeritud ultraheli töötluse tingimusi. Üldisele proteoomika reprodutseeritavusele aitavad siiski kaasa ka muud tegurid, nagu rakkude või EV isoleerimine, sisendi normaliseerimine, seedimise efektiivsus, LC-MS/MS stabiilsus, andmetöötlus ja statistiline analüüs.
Kas mikroplaadi ultraheli töötlus parandab valkude identifitseerimise sügavust?
See võib aidata kaasa identifitseerimise sügavuse paranemisele, kui proovi lõhkumine või uuesti lahustamine on piiravaks teguriks. Mõju sõltub proovitüübist, valkude keemiast, puhastusstrateegiast, seedimistingimustest ja LC-MS/MS meetodi toimivusest.
Mida tuleks optimeerida enne töövoo rutiinset kasutamist?
Peamised parameetrid hõlmavad proovi sisendkogust, puhvri või lahusti koostist, plaadi formaati, ultraheli amplituudi ja kestust, kuivatamistingimusi, seedimise mahtu, ensüümi kontsentratsiooni, inkubatsiooniaega ja LC-MS/MS süstimiskogust. Enne töövoo rakendamist täielikule katsekomplektile on soovitatav teha pilootkatse.
Kas seda töövoogu saab kasutada DIA-proteoomikas?
Jah. Viidatud EV töövoos kasutati andmest sõltumatut omandamist (DIA), millele järgnes DIA-NN analüüs. Mikroplaadi ultraheli töötlus on osa eelnevast proovide ettevalmistamise protsessist ning seda saab integreerida DIA, DDA või sihipäraste proteoomikameetoditega.
Milliseid kvaliteedikontrolli näitajaid tuleks jälgida?
Soovitatavad QC-mõõdikud on peptiidide saagis, tuvastatud peptiidide ja valgurühmade arv, vahelejäänud lõhustuskohtade määr, peptiidide pikkusjaotus, kromatograafilise piigi kuju, retentsiooniaja stabiilsus, kordusproovide variatsioonikoefitsient, ülekandumine (carry-over) ning bioloogiliste rühmade eristumine PCA või sarnaste meetodite abil.
Mis on mikroplaadi sonikaatorite mudelite UIP400MTP või UIP550MTP integreerimise peamine eelis proteoomika proovide ettevalmistamisel?
Peamine eelis on väikese mahuga proovide standardiseeritud paralleelne töötlemine. See aitab laboritel vähendada käsitsitööst tulenevat varieeruvust ning valmistada keerukaid bioloogilisi proove ühtlasemalt ette lõhustamiseks, LC-MS/MS mõõtmiseks ja kvantitatiivseks proteoomikaanalüüsiks.
Hielscheri mikroplaadi sonikaatoreid saab sujuvalt integreerida automatiseeritud töövoogudesse.
Kirjandus / viited
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Mochizuki-Ono C., Taketomi Y., Irie A., Kano K. et al. (2026): PLA2G12A-driven extracellular vesicle-lipid signaling amplifies pathogenic T cell responses in inflammatory diseases. Cell Reports 45, 2026.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Lischnig A., Bergqvist M., Ochiya T., Lässer C. (2023): Corrigendum for “Quantitative Proteomics Identifies Proteins Enriched in Large and Small Extracellular Vesicles”. Molecular & Cellular Proteomics, 22; 2023.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid alates laborimudelitest kuni tööstusliku mastaabini.