Rakuvälise maatriksi ekstraktsioon 96-augulise sonikaatoriga UIP400MTP

Traditsioonilised rakuvälise maatriksi (EM) ekstraheerimismeetodid hõlmavad sageli mitut etappi biokile maatriksi lõhkumiseks. Need tehnikad võivad aga olla aeganõudvad ja ebaühtlased, mis põhjustab tulemuste varieeruvust. 96-augulise plaadi sonikaatoriga UIP400MTP muutub EM ekstraheerimise protsess oluliselt lihtsamaks, tagades suure läbilaskevõimega formaatides väga tõhusa, täpse ja ühtlase biokile lõhkumise. UIP400MTP kasutab fokuseeritud ultraheli kontrollitud kavitatsiooni tekitamiseks, lõhkudes biokile maatriksi tõhusalt, säilitades samal ajal biokilesse kinnitunud rakkude elujõulisuse ja terviklikkuse. UIP400MTP kasutamine parandab järgnevate analüüside, näiteks metaboomika- ja proteoomikaanalüüside, elujõulisuse testide ja antimikroobse tundlikkuse uuringute korratavust ja täpsust. EM ekstraheerimist sujuvamaks muutes võimaldab UIP400MTP teadlastel saavutada ühtlaseid ja kvaliteetseid tulemusi, pakkudes sügavamat ülevaadet biokile dünaamikast ja koostoimest väliste ainetega.

Rakuvälise maatriksi ekstraktsioon

Rakuväline maatriks (EM) on mikroorganismide, näiteks Candida albicans’i moodustatud biokilede oluline komponent. EM koosneb polüsahhariididest, valkudest, lipiididest ja rakuvälisest DNA-st ning annab struktuurse terviklikkuse, vahendab kinnitumist pindadele ja aitab oluliselt kaasa antimikroobsele resistentsusele. EM ekstraheerimine ja analüüsimine on hädavajalik biokile bioloogia mõistmiseks, ravimresistentsuse mehhanismide selgitamiseks ja uute terapeutiliste sihtmärkide tuvastamiseks.

Protokoll rakuvälise maatriksi (EM) ekstraheerimiseks Candida albicans’i biokiledest UIP400MTP abil

See protokoll keskendub staatiliste Candida albicans’i biokilede rakuvälise maatriksi (EM) ekstraheerimisele. Sonikaatori UIP400MTP integreerimine, et asendada traditsioonilised kraapimis- või ensüümipõhised etapid efektiivsuse ja korratavuse parandamiseks.

Vajalikud materjalid

Samm-sammulised juhised EM ekstraheerimiseks

1. Staatilise biokile moodustamine
   Staatiliste biokilede jaoks inokuleerige C. albicans 96-augulise plaadi aukudesse, kasutades RPMI-1640 sööde. Iga auk peaks sisaldama ühtlast inokulumi mahtu (nt 200 µL augu kohta).
   Inkubeerige plaati 37°C juures staatilistes tingimustes 24 tundi, et võimaldada biokile moodustumist aukude pindadel.
2. Biokile ettevalmistamine ekstraheerimiseks
   Pärast inkubeerimist aspireerige ja visake igast august ettevaatlikult ära kasutatud sööde, biokilet häirimata.
   Loputage iga auk hoolikalt steriilse PBS-iga (nt 200 µL), et eemaldada lõdvalt kinnitunud rakud ja planktoniline praht. Korrake seda etappi kaks korda.
   Lisage igasse auku värsket PBS-i või ekstraktsioonipuhvrit (nt 200 µL), et valmistuda ultraheli töötluseks.
3. Ultraheli töötlus (sonikeerimine) seadmega UIP400MTP
   Asetage PBS-i või ekstraktsioonipuhvrit sisaldav 96-augulise plaat sonikaatori UIP400MTP alusele. Mitme augu plaadi õigeks paigutamiseks järgige kasutusjuhendi juhiseid.
   Sonikeerige 5-6 minutit õrnal seadistusel (60% amplituud, impulssrežiim), tagades biokile struktuuri ühtlase lõhkumise ja EM komponentide vabanemise.
   Kasutage sonikaatori UIP400MTP temperatuuri reguleerimist (temperatuurianduri ja seadistused), et vältida liigset kuumenemist või proovi kahjustamist.
4. Katioonvahetusvaiguga (CER) töötlemine
   Kandke sonikeeritud vedelik igast august uude 96-augulisse plaati.
   Lisage igasse auku kahekordne maht CER-suspensiooni (valmistatud PBS-is või puhvris) (nt 400 µL kogumaht augu kohta).
   Kaasake plaat ja inkubeerige seda plaadiloksutil või rotaatoril kiirusel 400 rpm 3 tundi, et võimaldada EM komponentide sidumist ja isoleerimist.
5. Eraldamine ja filtreerimine
   Tsentrifuugige plaati 2 000 × g juures 10 minutit, et eraldada vaik ja rakud supernatandist.
   Kandke EM-i sisaldav supernatant hoolikalt igast august uude 96-augulisse plaati.
   Filtreerige supernatant läbi 0,22 µm filtri, kasutades plaadipõhist vaakumkollektorsüsteemi või samaväärset, et saada puhas EM ekstrakt.
6. EM analüüs
   Kasutage selliseid tehnikaid nagu UPLC-Q-TOF-MS sihtimata metaboliitide profileerimiseks või rakendage spetsiifilisi analüüse (nt BCA valkude jaoks, triglütseriidide ja süsivesikute kvantifitseerimise komplektid), et iseloomustada EM komponente.

Suure läbilaskevõimega rakuvälise maatriksi ekstraktsioon

EM ekstraheerimise kõrge efektiivsus sonikaatoriga UIP400MTP on muutnud revolutsiooniliselt proovide ettevalmistamist analüüsideks, mis nõuavad biokile omaduste täpset analüüsi. UIP400MTP kasutab ultrahelilaineid biokile maatriksi täpseks ja ühtlaseks lõhkumiseks, võimaldades EM komponentide tõhusat vabanemist, säilitades samal ajal rakkude elujõulisuse ja terviklikkuse. See lähenemine parandab oluliselt selliste analüüside usaldusväärsust nagu biokile elujõulisuse testid, proteoomika- ja metaboomikauuringud ning antimikroobse tundlikkuse hindamised.

Biokile taastamise analüüside, näiteks pesa moodustavate ühikute (CFU) loendamise puhul tagab EM ekstraheerimine seadmega UIP400MTP reagentide takistamatu juurdepääsu biokilesse kinnitunud rakkudele. Samamoodi saavad proteoomika- ja metaboomikaanalüüsid, näiteks UPLC-Q-TOF-MS, kasu valkude, lipiidide ja metaboliitide suure saagisega isoleerimisest. UIP400MTP toetab ka täpset antimikroobse tundlikkuse testimist, võimaldades biokile MIC ja MBEC väärtuste täpset määramist. Lisaks aitab seadme UIP400MTP abil hõlbustatud tõhus ekstraheerimine kaasa ensüümide aktiivsuse analüüsidele, komponentide kvantifitseerimisele ja struktuuriuuringutele, pakkudes väärtuslikku teavet rakuväliste maatriksite rolli kohta biokile arhitektuuris, adhesioonis ja resistentsusmehhanismides.

See suure läbilaskevõimega ja korratav ekstraheerimismeetod optimeerib EM ettevalmistamist, tagades suurepärased tulemused paljudes biokilega seotud analüüsides.