Ekstratsellulaarse maatriksi ekstraheerimine 96-augulise sonikaatoriga UIP400MTP
Traditsioonilised ekstratsellulaarse maatriksi (EM) ekstraheerimismeetodid hõlmavad biokile maatriksi katkestamiseks sageli mitut etappi. Kuid need tehnikad võivad olla aeganõudvad ja ebajärjekindlad, põhjustades tulemuste varieeruvust. 96-augulise plaadi sonikaatori UIP400MTP abil on EM-i ekstraheerimisprotsess märkimisväärselt lihtsam, pakkudes väga tõhusat, täpset ja ühtlast biokile katkestust suure läbilaskevõimega vormingutes. UIP400MTP kasutab kontrollitud kavitatsiooni genereerimiseks fokuseeritud ultraheli, lagundades tõhusalt biokile maatriksi, säilitades samal ajal biokilega varjatud rakkude elujõulisuse ja terviklikkuse. UIP400MTP kasutamine suurendab tootmisahela järgmise etapi analüüside, näiteks metaboloomiliste ja proteoomiliste analüüside, eluvõimelisuse testide ja antimikroobse tundlikkuse uuringute reprodutseeritavust ja täpsust. EM-i ekstraheerimise sujuvamaks muutmisega võimaldab UIP400MTP teadlastel saavutada järjepidevaid ja kvaliteetseid tulemusi, pakkudes sügavamat ülevaadet biokile dünaamikast ja interaktsioonidest väliste mõjuritega.
rakuvälise maatriksi ekstraheerimine
Ekstratsellulaarne maatriks (EM) on mikroorganismide, näiteks Candida albicansi moodustatud biokilede kriitiline komponent. Koosneb polüsahhariididest, valkudest, lipiididest ja rakuvälisest DNA-st, EM tagab struktuurse terviklikkuse, vahendab adhesiooni pindadele ja aitab oluliselt kaasa antimikroobsele resistentsusele. EM-i ekstraheerimine ja analüüsimine on oluline biokile bioloogia mõistmiseks, ravimresistentsuse mehhanismide selgitamiseks ja uudsete terapeutiliste sihtmärkide tuvastamiseks.
Ekstratsellulaarse maatriksi (EM) ekstraheerimise protokoll Candida albicansi biokiledest, kasutades UIP400MTP
See protokoll keskendub staatiliste Candida albicans'i biokilede rakuvälise maatriksi (EM) ekstraheerimisele. UIP400MTP sonikaatori integreerimine, et asendada traditsioonilised kraapimis- või ensüümipõhised sammud tõhususe ja reprodutseeritavuse parandamiseks.
Vajalikud materjalid
EM-i ekstraheerimise samm-sammulised juhised
- Staatilise biokile moodustumine
Staatiliste biokilede puhul inokuleeritakse C. albicans 96-augulise plaadi aukudesse, kasutades RPMI-1640 söödet. Igas augus peaks olema ühtlane kogus inokulaati (nt 200 μl augu kohta).
Plaati inkubeeritakse 37 °C juures staatilistes tingimustes 24 tundi, et biokile tekiks süvendi pindadele. - Biokile ettevalmistamine ekstraheerimiseks
Pärast inkubeerimist aspireerige ja visake kasutatud sööde ettevaatlikult igast august ära, ilma et see häiriks biokilet.
Iga auku loputatakse hoolikalt steriilse fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega (nt 200 μL), et eemaldada lõdvalt kinnitunud rakud ja planktoni prahid. Korrake seda sammu kaks korda.
Lisage värsket fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahust või ekstraheerimispuhvrit (nt 200 μL) igasse auku, et valmistuda ultrahelitöötluseks. - Ultrahelitöötlus koos UIP400MTP
Asetage PBS-i või ekstraheerimispuhvrit sisaldav 96-auguline plaat sonikaatori UIP400MTP salve. Mitme süvendiga plaadi õigeks paigutamiseks järgige kasutusjuhendi juhiseid.
Sonikeerige 5-6 minutit õrnas keskkonnas (amplituud, impulsi režiim), tagades biokile struktuuri ühtlase katkemise ja EM-komponentide vabanemise.
Kasutage UIP400MTP sonikaatori temperatuuri reguleerimist (temperatuuriandur ja seaded), et vältida liigset kuumutamist või proovi kahjustusi. - Katioonivahetusvaigu (CER) töötlemine
Viige ultraheliga töödeldud vedelik igast süvendist uude 96-süvendisse plaadile.
Igasse auku lisatakse kahekordne kogus CER-suspensiooni (valmistatud fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses või puhvris) (nt kogumaht 400 μl augu kohta).
Plaat suletakse ja inkubeeritakse plaadiloksutil või rootoril kiirusel 400 pööret minutis 3 tundi, et võimaldada elektromagneteralduse komponentide sidumist ja eraldamist. - Eraldamine ja filtreerimine
Plaati tsentrifuugitakse 2 000 × g juures 10 minutit, et eraldada vaik ja rakud supernatandist.
EM-i sisaldav supernatant viiakse ettevaatlikult igast august üle uuele 96augulisele plaadile.
Supernatant filtreeritakse läbi 0,22 μm filtri, kasutades puhta EM-ekstrakti saamiseks plaadipõhist vaakumkollektorisüsteemi või samaväärset süsteemi. - EM-i analüüs
Kasutage EM-komponentide iseloomustamiseks selliseid meetodeid nagu UPLC-Q-TOF-MS sihtimata metaboliitide profileerimiseks või kasutage spetsiifilisi analüüse (nt valkude, triglütseriidide ja süsivesikute kvantifitseerimiskomplektide BCA).
UIP400MTP tagab usaldusväärse proovide ettevalmistamise ja lihtsa integreerimise olemasolevate labori töövoogudega
UIP400MTP ei ole ultraheli vann. See on kõrge intensiivsusega tassisarv keskendunud ultrahelitöötluseks. See võimas kontaktivaba sonikaator tagab ühtlase ultrahelitöötluse teie standardse kaevuplaadi kõigis kaevudes. Teil on täpne kontroll amplituudi, võimsuse ja pulseerimise üle. Sisseehitatud taimer ja temperatuuriandur tagavad ühtlased tulemused. Plaadi sonikaatori UIP400MTP jahutab proove veevanniga (väline jahuti valikuline).
Suure läbilaskevõimega rakuvälise maatriksi ekstraheerimine
Ekstratsellulaarse maatriksi (EM) ekstraheerimise kõrge efektiivsus UIP400MTP sonikaatoriga on muutnud proovide ettevalmistamist analüüsideks, mis nõuavad biokile omaduste täpset analüüsi. UIP400MTP kasutab ultraheli laineid, et täpselt ja ühtlaselt häirida biokile maatriksit, võimaldades EM-komponentide tõhusat vabastamist, säilitades samal ajal rakkude elujõulisuse ja terviklikkuse. See lähenemisviis suurendab märkimisväärselt selliste analüüside usaldusväärsust nagu biokile elujõulisuse testid, proteoomilised ja metaboloomilised uuringud ning antimikroobse tundlikkuse hindamised.
Biokile regenereerimise testide puhul, näiteks kolooniaid moodustava ühiku (CFU) loendamine, tagab EM-ekstraheerimine UIP400MTP-ga reaktiivide takistamatu juurdepääsu biokilega manustatud rakkudele. Samamoodi saavad proteoomilised ja metaboloomilised analüüsid, nagu UPLC-Q-TOF-MS, kasu valkude, lipiidide ja metaboliitide kõrge saagisega isoleerimisest. UIP400MTP toetab ka täpset antimikroobse tundlikkuse testimist, mis võimaldab täpselt määrata biokile MIC ja MBEC väärtusi. Lisaks aitab UIP400MTP hõlbustatud tõhus ekstraheerimine ensüümide aktiivsuse testides, komponentide kvantifitseerimisel ja struktuuriuuringutes, pakkudes väärtuslikku teavet rakuväliste maatriksite rolli kohta biokile arhitektuuris, adhesioonis ja resistentsusmehhanismides.
See suure läbilaskevõimega reprodutseeritav ekstraheerimismeetod optimeerib EM-i ettevalmistamist, tagades suurepärased tulemused mitmesugustes biokilega seotud testides.
Suure läbilaskevõimega EM-ekstraheerimine 96-augulise plaadiga sonikaatoriga UIP400MTP
Kirjandus / Viited
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Korduma kippuvad küsimused
Mis on ekstratsellulaarse maatriksi eesmärk?
Ekstratsellulaarne maatriks (EM või ECM) pakub rakkudele struktuurset tuge, reguleerib rakkudevahelist suhtlust ja mõjutab rakkude käitumist.
Mida teeb ekstratsellulaarne maatriks kudede jaoks?
Kudede jaoks toimib EM tellinguna, mis säilitab struktuurse terviklikkuse, hõlbustab mehaanilist vastupidavust ja vahendab biokeemilist signaalimist, et reguleerida selliseid protsesse nagu kasv, diferentseerumine ja parandamine.
Mis on rakuvälise maatriksi adhesioon?
Rakuvälise maatriksi adhesioon viitab rakkude ja EM-i vahelisele interaktsioonile, mida vahendavad peamiselt raku-pinna adhesioonimolekulid nagu integriinid, võimaldades rakkude ankurdamist, signaali transduktsiooni ja migratsiooni.
Miks ekstraheeritakse ekstratsellulaarne maatriks testide jaoks?
EM-i ekstraheeritakse testide jaoks, et uurida selle koostist, mõista selle rolli rakulistes protsessides ja uurida selle mõju haiguse progresseerumisele, sealhulgas biokile moodustumisele ja antimikroobsele resistentsusele.
Millised on rakuvälise maatriksi tavalised ekstraheerimisprotseduurid?
Tavalised ekstraheerimisprotseduurid hõlmavad füüsikalisi meetodeid, nagu ultraheli, keemiline töötlemine detergentide või sooladega ja ensümaatiline lagundamine EM-komponentide isoleerimiseks, säilitades samal ajal nende terviklikkuse.
Mis on rakuväline maatriks (dECM)?
Detsellulaarne ekstratsellulaarne maatriks (dECM) saadakse rakulise materjali eemaldamisel kudedest, säilitades samal ajal EM-i struktuursed ja biokeemilised omadused. Seda kasutatakse regeneratiivses meditsiinis koetehnoloogia ja rakukultuuri tellingutena.
Loe lähemalt rakuvälise maatriksi ultraheli abil toimuva detsellulariseerimise kohta!
Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid alates Lab kuni tööstuslik suurus.