Bakteriproovide rakkude lagundamine ultraheliga
Bakteriproovid jõuavad harva kohale tõeliste üherakuliste suspensioonidena. Kultuurid kasvavad ahelatena ja klompidena, keskkonnaisolaadid moodustavad ekstratsellulaarsete polümeersete ainete poolt seotud agregaate ning tsentrifuugitud sadestised ei lase end sageli uuesti suspendeerida isegi põhjaliku vorteksimise järel. Eluvõimeliste rakkude arvu määramine, optiline tihedus, voolutsütomeetria ja mikrobiomi profiili koostamine eeldavad kõik, et üks osake võrdub ühe rakuga. Ultraheli abil toimuv rakkude lagundamine lahendab selle vastuolu: lühikesed, kontrollitud ultraheliimpulsid eraldavad agregaadid üksikrakkudeks neid lüüsimata.
Miks rakkude koondumine mõjutab teie tulemusi negatiivselt
Aгреgeerumine on bioloogiline omadus, mitte analüüsi ettevalmistamisel tehtud viga. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces ja paljud keskkonnas esinevad liigid kasvavad ahelatena, klastritena või biofilmi fragmentidena, ning rakuväline DNA ja polüsahhariidid liimivad rakud kokku graanuliteks ja tampoonieluaatideks. Selle mõju analüüsile on süstemaatiline:
- Kolooniate arvu on alahinnatud, sest üks kimp moodustab ühe koloonia, olenemata sellest, kui palju rakke see sisaldab.
- Optiline tihedus ja osakeste loendurid näitavad agregaate, mitte rakke, mis moonutab kasvukõveraid.
- Voolutsütomeetria ja rakkude sorteerimine loevad kokkukleepunud sündmusi valesti ning jätavad need analüüsist välja.
- DNA ja valkude eraldamisel võetakse arvesse ainult agregaadi pinnal asuvaid rakke, mis moonutab mikrobiomi ja oomikaandmeid.
Tavapärased meetodid on aeglased, ebatäielikud või muudavad keemilist koostist. Intensiivne pipeteerimine ja vorteksimine jätavad maha mikroagregate. Ensüümidel või kelaatoritel põhinev dispersioon muudab raku pinda, mida soovitakse analüüsida. Kontrollitud kavitatsiooni abil toimuv mehaaniline desagregatsioon toimib sekundite jooksul ega vaja lisandeid.
Üks agregaat võrdub ühe kolooniaga – ja üks vale tulemus. Vaadake, kuidas ultraheliline tükeldamine võimaldab saada tõelisi üherakulisi suspensioone ilma rakkude lõhustumise, aerosoolide tekke või sondi käsitsemiseta. Küsige lisateavet!
Multi-Tube Sonicator VialTweeter kontaktivaba proovi ettevalmistamiseks: hajutage rakukogumid suletud proovitorudes
Kuidas ultraheli mõjub rakkudele, neid purustamata
Ultrahelil põhinev rakkude lahtihajutamine kasutab ära mehaanilise tugevuse erinevusi. Bakterite agregaate hoiavad koos suhteliselt nõrgad rakusiseseid sidemeid ja ekstratsellulaarne maatriks, samas kui terviklik rakumembraan talub märkimisväärselt suuremat nihkejõudu. Kui kalibreeritud ultraheli jõuab suspensiooni, tekitab akustiline kavitatsioon mikrovoolu, rõhuimpulsse ja nihkejõude, mis mõjutavad esmalt agregaatide piirpindu. Klombid, ahelad ja biofilmi fragmendid lõigatakse lahti (deagglomereerumine) enne, kui saavutatakse energiatase, mille juures membraanid purunevad (lüüs).
Bakterirakkude klompide ultrahelilise lagundamine
Lõhustamine või lüüs – Miks on ultraheli parameetrid olulised
Praktiline tagajärg on see, et disaggregatsioon ja lüüs on sama seade, mida kasutatakse erinevate parameetritega. Mõõduka amplituudi, lühikeste impulsitsüklite ja kontrollitud temperatuuri juures saadakse eluvõimeline üherakuline suspensioon. Amplituudi, kokkupuuteaja või proovi temperatuuri suurendamine nihutab protsessi rakusiseste sihtmärkide täieliku purustamise suunas. Hielscheri generaatorid võimaldavad teil täpselt seadistada amplituudi, võimsust, impulsi ja sisendenergiat ning salvestada meetodi, mistõttu on disagregatsioonietapp korratav erinevate proovide, operaatorite ja katsete puhul.
Tõhus kontaktivaba ultrahelitöötlus
Vannipõhine ultrahelipuhastus ei suuda seda kontrolli tagada. Ultrahelipuhastusvannid ja -mahutid pakuvad vaid vähest ultrahelienergiat, mille tulemuseks on ebapiisav ettevalmistus, ning kavitatsioon toimub ebaühtlaselt, mistõttu iga proovitoru töödeldakse vastavalt selle asukohale vannis. VialTweeter edastab intensiivseid, fokuseeritud ultrahelijõude otse anumaseina kaudu kuni 10 suletud proovi korraga. Töötlemised, mis nõuavad pikka ja muutuvat kokkupuudet vannis, viiakse lõpule standardiseeritud impulssmustri järgi.
Hielscheri kontaktivabad ultrahelikäsitlusseadmed rakendavad intensiivset, fokuseeritud ultraheli läbi suletud viaalide seinte. VialTweeter töötleb kuni 10 viaali korraga ühesuguse intensiivsusega, ilma et proovisse viidaks sondi, ilma ristsaastumiseta ja ilma aerosoolide eraldumiseta. Kui tootlikkus seda nõuab, laiendavad mikroplaadi ultraheliseadmed UIP400MTP ja UIP550MTP sama kontrollitud energiaülekande mitme auguga plaatidele.
The VialTweeter Sonicates korraga kuni 10 väiksemat viaali ja kuni 5 suuremat katseklaasi.
Kontaktivaba ultrahelilise lagundamise eelised
- Ristsaastumise täielik puudumine: Kuna proovipudelid jäävad kogu aeg suletuks ja proovi sisse ei kasteta ühtegi sondi, on ristkontaminatsioon ja proovikaotus täielikult välistatud. Proovide vahel pole midagi steriliseerida ning üks katsetsükkel ei mõjuta järgmist.
- Aerosoolikaitse: Avatud sondiga ultrahelitöötlus tekitab nakkusohtlikke aerosoolid ja saastab seadmete pindu. Suletud proovivialiga ultrahelitöötlus hoiab proovi oma toru sees, mis on oluline patogeensete bakterite, nagu Mycobacterium tuberculosis ja muude BSL-2 või BSL-3 taseme patogeenide käitlemisel.
- Jootraha vähenemist ei toimu: Titaanist sondid võivad töötamise ajal eraldada proovi sisse väikese koguse mikroosakesi. Need osakesed mõjutavad optilist tihedust ja osakeste arvu proovi järgnevas osas. Kaudne ultrahelitöötlus läbi anumaseina kõrvaldab selle tahkete osakeste allika täielikult.
- Ühtlane läbilaskevõime: VialTweeter tagab ühesuguse ultraheli intensiivsuse kuni 10 proovipudelile, mistõttu on ultrahelitöötluse tulemused ühtlased ja korratavad. Kaovad asukohast tulenevad mõjud, mis on tüüpilised ultraheli-vannide ja üksikproovide ultrahelitöötluse puhul, ning teie baasjooned jäävad korduskatsete vahel võrreldavaks.
- Proovi terviklikkus: proovivõtturid jäävad kogu töötlemise vältel suletuks, mistõttu proov ei saa saastuda, rikneda ega aurustuda. Väikeseid proovimahte saab töödelda lahjendamata, sealhulgas väärtuslikke kliinilisi pelletid, mille puhul ei ole võimalik teha täiendavat ülekandetoimingut.
- Protsessi juhtimine: Amplituudi saab reguleerida vahemikus 20–100%, impulsi režiimi vahemikus 0–100%, ning süsteemid toetavad temperatuuri jälgimist, et temperatuuritundlikud tüved ja valgud püsiksid kahjustavatest piirmääradest allpool.
Tüüpilised rakendused
- Mikrobiomi ja soole sisu analüüs: Lactobacillus’e, Bifidobacterium’e ja fekaaliproovide hajutamine enne plaadile kandmist või sekveneerimist, et klompid ei vähendaks loendustulemusi.
- Toidu ja vee mikrobioloogia: flokkide lagundamine proovivõttudest, loputusvedelikest ja rikastamispõhjadest, et täpselt määrata kolooniate arvu ja eluvõimelisust.
- Biofilmi uurimine: rakkude eraldamine kandjatelt ja pindadelt üherakuliste suspensioonidena, ilma ensümaatilise töötlemiseta, mis eemaldaks pinnaproteiine.
- Kliiniline diagnostika: röga, mäda ja proovivõttelõhustuste resuspendeerimine ohutustingimustes.
- Rakukultuur: imetajate, putukate ja CHO-rakkude klompide eraldamine enne loendamist ja edasikandmist.
- Kogu töövoo ettevalmistamine: sama seade, mis madalal amplituudil teostab proovi lagundamist, teostab kõrgematel seadistustel rakkude täieliku purustamise, mistõttu lüüs, valkude ekstraheerimine ja DNA fragmenteerimine toimuvad ilma proovi ümbervalamiseta.
Mitme augu plaadi sonikaator UIP400MTP rakkude klompide suure läbilaskevõimega deagglomereerimiseks
Mikroplaadi ultraheli seadmed mudelid UIP400MTP ja UIP550MTP sobivad mitte ainult mitme auguga plaatide, vaid ka proovitorude hoidjate töötlemiseks.
Leidke oma dispersiooniprotsessile sobiv ultrasonikaator
VialTweeter Multi-Tube Sonicator
Eelistatud meetod steriilsete, suletud viaalide lahtimurdmiseks. Seadet juhib 200-vattine UP200St protsessor sagedusel 26 kHz koos automaatse häälestusega, edastab VialTweeter ultraheli kaudselt läbi kuni 10 suletud viaali seinte korraga, võimsusega kuni 10 W viaali kohta, tagades ühtlased ja korratavad tulemused ilma ristsaastumiseta ja proovikaotuseta. Titaanist VialTweeteri sonotrood on autoklaavitav ning amplituudi ja impulsi saab reguleerida ja salvestada, mis vastab aglomeerumise eemaldamise protokollile vajalikule reguleerimisvahemikule. Standardne 10-positsiooniline sonotrood sobib automaatproovivõtja viaalide, mikrotsentrifuugitorude ning 1–5 ml mahutavusega Eppendorfi või Nunci torudega. VialPressi kinnitusseade mahutab kuni 5 suuremat anumat, mille läbimõõt on kuni 20 mm.
Falcon-torudele ja anumate suurusele kohandatud üheproovitorudele on saadaval spetsiaalsed üheproovitoruga VialTweeter-mudelid. Blokksonotroodi lahti monteerides töötab UP200St põhiüksus tavapärase sondiga ultraheliseadmena, mis võimaldab väikeste ja keskmise suurusega proovide otsest töötlemist.
Mikroplaadi ultraheli-seadmed
Suurendage läbilaskevõimet proovide ettevalmistamisel mitme auguga plaadi ultrahelitöötluse abil: plaadipõhiste töövoogude puhul laiendavad mikroplaadi ultraheliseadmed UIP400MTP ja UIP550MTP kontaktivaba ja ühtlase ultrahelitöötluse ulatust kümnest proovitorust kogu plaadile.
400-vattine UIP400MTP on mõeldud tavaliste mikrotiter- ja mitmeauguliste plaatide, sealhulgas 96-auguliste formaatide töötlemiseks, pakkudes täpset amplituudi, võimsuse ja impulside juhtimist, samuti taimerit, temperatuuriandurit ja veevanni jahutust. Biofilmi eemaldamine ja bakterikultuuride töötlemine on UIP400MTP mikroplaadi ultraheliseadme väljakujunenud rakendused.
550-vattine UIP550MTP on võimsam variant – sobib ideaalselt nõudlikumatele rakendustele.
Mõlemad kontaktivabad ultrahelisüsteemid töötlevad usaldusväärselt 6-, 12-, 24-, 48-, 96- ja 384-auguga plaate, samuti proovitorude aluseid ja Petri tasse. Hielscheri mikroplaadi ultraheliseadmed töötavad mis tahes standardplaadiga, vältides kallite tootjaspetsiifiliste tarvikute kasutamist. Programmeeritavate temperatuuripiiride abil peatub ultrahelitöötlus automaatselt proovi maksimaalse temperatuuri saavutamisel ja jätkub pärast jahutamist, kaitstes proovi eluvõimelisust korduvate tsüklite jooksul. Nutikas ja usaldusväärne suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistus korratavate tulemuste saavutamiseks.
Allpool olev tabel annab ülevaate meie laboriproovide ultraheli-seadmete ligikaudsest töötlemisvõimsusest, mida kasutatakse bioteadustes, genoomikas, proteoomikas ja diagnostikas:
| Soovitatavad seadmed | Partii maht | Voolukiirus |
|---|---|---|
| VialTweeter Multi-Tube Sonicator | 00,5–1,5 ml viaalid | mujal liigitamata |
| UIP400MTP mitme auguga plaadi ultraheli-seade (440 vatti) | mitme kaevu / mikrotiitri plaadid | mujal liigitamata |
| UIP550MTP mitme auguga plaadi ultraheli-seade (550 vatti) | mitme kaevu / mikrotiitri plaadid | mujal liigitamata |
| Ultraheli CupHorn | CupHorn viaalide või keeduklaasi jaoks | mujal liigitamata |
| UP100H 100-vattine sondtüüpi ultraheliseade | 1 kuni 500 ml | 10 kuni 200 ml / min |
| UP200Ht, UP200St 200-vattised sondtüüpi ultraheliseadmed | 10 kuni 1000 ml | 20 kuni 200 ml / min |
| UP400St 400-vattine sond-tüüpi ultrahelikatseaparaat | 10 kuni 2000 ml | 20 kuni 400 ml / min |
| GDmini2 | steriilne ultraheliline mikrovooreaktor | mujal liigitamata |
| Ultraheli sõela loksuti | mujal liigitamata | mujal liigitamata |
Korduma kippuvad küsimused ultrahelil põhineva rakkude lagundamise kohta
Mis vahe on rakkude lahtihargnemisel ja rakkude lüüsil?
Disagregatsioon, mida nimetatakse ka deagglomeratsiooniks, eraldab kokku kleepunud rakud üherakulisse suspensiooni, kusjuures rakud jäävad terveks ja eluvõimeliseks. Lüüs purustab raku membraani ja vabastab raku sisu. Mõlemat protsessi ajendab kavitatsiooniline lõikumisjõud, erinevus seisneb aga energiakulu suurus. Optimeeritud amplituudi, impulsi ja temperatuuri seadistustega saavutatakse ultraheli abil disaggregatsioon, mis jääb allapoole lüüsi künnist.
Miks ultraheli-puhastusvannid ei sobi standardiseeritud lagundamiseks?
Vannid pakuvad vaid vähest ultrahelienergiat, mis toob kaasa ebatäieliku ettevalmistuse, ning kavitatsioon areneb mahuti ulatuses väga ebaühtlaselt, mistõttu iga proov saab sõltuvalt oma asukohast erineva töötluse. Mikrobioloogilised loendused ja võrdlevad uuringud sõltuvad võrreldavusest. Kontaktivabad ultraheliseadmed, nagu näiteks Multi-Tube Sonicator VialTweeter, samuti mikroplaadi ultraheliseadmed mudelid UIP400MTP ja UIP550MTP töötlevad kõiki nõusid reguleeritud ultrahelitingimustes, mis parandab tulemuste korratavust korduskatsete vahel.
Kas ultraheli võib rakke kahjustada?
Jah, kui parameetreid ei kontrollita. Liigne ultrahelitöötlus või kontrollimatu kuumutamine võib rakke kahjustada, ning vabanenud DNA muudab proovid viskoosseteks ja soodustab uuesti aggregeerumist. Seetõttu tuleks protsessi läbimõeldult välja töötada: mõõdukas amplituud, impulssitsüklid, jahutus ja temperatuuri piiravad seadmed hoiavad töötlemise kõveral lahtimurdumise poolel.
Kõik Hielscheri digitaalsed ultrahelikuivatid pakuvad täpselt reguleeritavaid parameetreid, ühendatavaid temperatuuriandureid, programmeeritavaid seadeid ja automatiseeritud andmete salvestamist, mis tagavad proovide usaldusväärse ettevalmistamise.
Kas proov tuleb üle kanda teise anumasse?
Ei. Vialid ja plaadid töödeldakse nende originaalsetes, suletud pakendites. Kaudne ultrahelitöötlus aitab vältida nii ülekandekadusid kui ka sondi käsitsemisega seotud ülekandumist.
Milliseid viaalivorme suudab VialTweeter töödelda?
Standardne 10-positsiooniline sonotrood sobib automaatproovivõtja viaalide, mikrotsentrifuugitorude ning 1–5 ml mahutavusega Eppendorfi või Nunci torudega. VialPressi lisaseade mahutab kuni 5 suuremat anumat, mille läbimõõt on kuni 20 mm. Falcon-torudele ning kohandatud üheproovivialide või suuremate formaatide jaoks on saadaval spetsiaalsed üheproovivialiga VialTweeter-mudelid.
Kas saan ühe seadmega teha eraldamist ja lüüsimist?
Jah. Sama seadistus, mis mõõduka amplituudi juures teostab rakkude lagundamist, tagab suurema amplituudi ja pikema kokkupuute korral rakkude täieliku lagundamise, mistõttu saab üherakulise suspensiooni valmistamist ja järgnevat ekstraheerimist läbi viia järjest, ilma et oleks vaja vahetada platvormi.
Kas MBEC-analüüsides kasutatakse ultraheli töötlemist?
Ultrahelitöötlus on väljakujunenud ja suures osas standardne protseduur. Peg-lid MBEC-analüüsis viiakse polüstüreenist tapid pärast biofilmide kasvatamist ja antibiootikumiga kokkupuutumist üle värskesse kasvukeskkonda ning neile rakendatakse vorteksimist ja sonikatsiooni, et eemaldada ja lagundada kinnitunud biofilmirakke planktonilisse suspensiooni enne seeriaviimist ja eluvõimeliste rakkude loendamist (MBEC-väärtusena loetakse madalaimat kontsentratsiooni, mis vähendab saadud rakuarvu ≥3 log10 võrreldes töötlemata biofilmiga). Ultrahelitöötlus parandab dispersiooni kvaliteeti märkimisväärselt: kui EPS-maatriksist kinnitunud rakud vabanevad ebapiisavalt, alahinnatakse hävitamist ja MBEC-väärtused osutuvad liiga kõrgeteks. Mikroplaadi sonikaatori UIP400MTP abil läbi viidud sihipärane sonikatsioon prooviplaatide PEG-hoidjate kaevudes kõrvaldab traditsioonilise vannsonikatsiooni nõrgad küljed – nimelt energia ebaühtlane jaotumine, ülekuumenemine ning aerosoolide ja ristsaastumise oht.
Uuri, kuidas kontaktivaba mikroplaadi ultraheliseade UIP400MTP hõlbustab MBEC-analüüside läbiviimist!
Kas MIC-määramistes kasutatakse ultraheli?
Ultraheli kasutatakse mitmesugustes MIC-ga seotud tööprotsessides, et parandada nende tõhusust ja korratavust:
- mükobakterioloogia, kus röga ja muud viskoossed proovid desinfitseeritakse ja homogeniseeritakse rutiinselt – mõnikord ultraheli abil – enne tundlikkuse määramist, ning klompide moodustavate mükobakterite inokulaatide puhul on täpsete minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) väärtuste saamiseks kasulik neid lühiajaliselt hajutada;
- agregatsioonile kalduvad organismid (nt streptokokid, graanulitena esinevad stafülokokid), mille puhul mikroagregaadid moonutavad inokulaadi tihedust; ja
- kombineeritud diagnostika, nagu näiteks implantaadi ultraheli-puhastus ja vedeliku kultuur, millele järgneb ravimtundlikkuse test proteesliigese infektsiooni korral (MBEC-laadne, mitte klassikaline MIC-meetod).
Kirjandus / Viited
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Vali endale sobiv taldrik! Mikroplaadi ultraheli-seade UIP550MTP eraldab bakteriproovid mis tahes standardse mitme auguga plaadil.
Hielscher Multi-Sample Sonicator mudelid UIP400MTP mikroplaatide jaoks, VialTweeter ja kupael: kiire ja suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistamine