Bakteriproovide ultraheliga rakkude disagregeerimine

Bakteriproovid ei ole harva tõelised üksikrakkude suspensioonid. Kultuurid kasvavad ahelatena ja helvestena, keskkonnaisolaadid moodustavad rakuvälistest polümeersetest ainetest seotud agregaate ning tsentrifuugitud sade ei suuda sageli resuspendeeruda isegi põhjaliku vortekseerimise järel. Elujõuliste rakkude arvukus, optiline tihedus, voolutsütomeetria ja mikrobioomi profileerimine eeldavad kõik, et üks osake võrdub ühe rakuga. Ultraheliga rakkude disagregeerimine lahendab selle vastuolu: lühikesed kontrollitud ultraheli töötluse impulsid eraldavad agregaadid üksikrakkudeks, neid lõhkumata.

Miks rakkude agregatsioon ohustab teie tulemusi

Agregatsioon on bioloogiline omadus, mitte proovi ettevalmistamise viga. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces ja paljud keskkonnaliigid kasvavad ahelate, klastrite või biofilmi fragmentidena ning rakuväline DNA ja polüsahhariidid liimivad rakke kokku sadedes ja tampooniproovide eluaatides. Analüütilised tagajärjed on süstemaatilised:

• Kolooniate arvu alahinnatakse, sest üks tükk annab ühe kolooniana tulemuse, olenemata sellest, kui palju rakke see sisaldab.
• Optiline tihedus ja osakeste loendurid registreerivad rakkude asemel agregaate, mis moonutab kasvukõveraid.
• Voolutsütomeetria ja rakkude sortimine loevad kokkukleepunud sündmused valesti ning jätavad need analüüsist välja.
• DNA ja valgu ekstraktsioonid esindavad ainult agregaadi pinnal olevaid rakke, mis moonutab mikrobioomi- ja omics-andmeid.

Tavapärased abinõud on aeglased, mittetäielikud või muudavad proovi keemiliselt. Intensiivne pipeteerimine ja vortekseerimine jätavad maha mikroagregaate. Ensüümidel või kelaatoritel põhinev dispergeerimine muudab rakupinda, mida te võite soovida analüüsida. Mehaaniline disagregeerimine kontrollitud kavitatsiooni abil toimib sekunditega ega vaja lisaaineid.

Kuidas ultraheli töötlus disagregeerib rakke neid lõhkumata

Ultraheliga rakkude disagregeerimine kasutab ära mehaanilise tugevuse erinevust. Bakteriaalseid agregaate hoiavad koos suhteliselt nõrgad rakkudevahelised sidemed ja rakuväline maatriks, samas kui terve rakukest talub oluliselt suuremat nihet. Kui kalibreeritud ultraheli siseneb suspensiooni, tekitab akustiline kavitatsioon mikrovoolu, rõhuimpulsse ja nihkejõude, mis mõjuvad esmalt agregaatide piirpindadel. Tükid, ahelad ja biofilmi fragmendid lagundatakse üksteisest lahti (deaglomeratsioon) enne, kui jõutakse energiatasemeni, mille juures membraanid rebenevad (lüüs).

Bakterirakutükkide ultraheliga disagregeerimine

Disagregeerimine või lüüs – kuidas ultraheli töötluse parameetrid loevad

Praktiline tagajärg on see, et disagregeerimine ja lüüs toimuvad ühe ja sama seadmega, mida kasutatakse erinevate parameetritega. Mõõduka amplituudi, lühikeste impulsstsüklite ja kontrollitud temperatuuri korral saate elujõulise üksikrakkude suspensiooni. Amplituudi, kokkupuuteaja või proovi temperatuuri suurendamine nihutab protsessi rakkude täieliku lõhkumise suunas intratsellulaarsete sihtmärkide jaoks. Hielscheri generaatorid võimaldavad amplituudi, võimsust, impulssi ja energiasisendit täpselt seada ning meetodit salvestada, mistõttu on disagregeerimisetapp korratav eri proovide, operaatorite ja katsete vahel.

Tõhus kontaktivaba ultraheli töötlus

Vannisonikeerimine ei suuda sellist kontrolli pakkuda. Ultraheli puhastusvannid ja -mahutid annavad ainult madalat ultraheli energiat, mis põhjustab mittetäieliku proovi ettevalmistuse, ning kavitatsioon tekib ebaühtlaselt, mistõttu iga tuubi töödeldakse vastavalt selle asukohale vannis. VialTweeter edastab intensiivseid, fokuseeritud ultraheli jõude otse anuma seina kaudu kuni 10 suletud proovi korraga. Töötlused, mis nõuavad vannis pikka ja muutuvat kokkupuuteaega, viiakse lõpule standardiseeritud pulsimustriga.
Hielscheri kontaktivabad sonikaatorid rakendavad intensiivset, fokuseeritud ultraheli suletud viaalide seinte kaudu. VialTweeter töötleb kuni 10 viaali samaaegselt identse intensiivsusega, ilma sondita proovis, ilma ristsaastumiseta ja ilma aerosooli eraldumiseta. Kui läbilaskevõime seda nõuab, laiendavad mikroplaatide sonikaatorid UIP400MTP ja UIP550MTP sama kontrollitud energiaülekannet mitme süvendiga plaatidele.

Kontaktivaba ultraheli disagregatsiooni eelised

• Null ristsaastumist: Kuna viaalid jäävad püsivalt suletuks ja proovi ei ole sukeldatud ühtegi sondi, välditakse ristsaastumist ja proovikadu täielikult. Proovide vahel ei ole midagi steriliseerida ning üks töötlus ei saa mõjutada järgmist.
• Aerosoolikaitse: Avatud sondiga sonikeerimine tekitab nakkusohtlikke aerosoole ja saastab seadme pindu. Suletud viaalis sonikeerimine hoiab proovi omas tuubis, mis on oluline patogeensete bakterite, näiteks Mycobacterium tuberculosis’e ning muude BSL-2 või BSL-3 ohurühma tekitajate käsitsemisel.
• Ei mingit otsaku erosiooni: Titaanist sondid võivad töö ajal proovi eraldada väikese koguse mikroosakesi. Need osakesed muudavad optilist tihedust ja osakeste arvu edasistes etappides. Kaudne sonikeerimine anuma seina kaudu kõrvaldab selle tahkete osakeste allika täielikult.
• Ühtlane proovide töötlus: VialTweeter annab igale kuni 10 viaalile sama ultraheli intensiivsuse, mistõttu on sonikeerimise tulemused ühtlased ja reprodutseeritavad. Asukohaefektid, mis vaevavad vanne ja üksikproovi sondiga töötlemist, kaovad ning teie võrdlusalused püsivad korduste lõikes võrreldavad.
• Proovi terviklikkus: tuubid jäävad kogu töötluse ajaks suletuks, mistõttu proovi ei saa saastada, rikkuda ega aurustada. Väikesed mahud töötavad ilma lahjendamata, sealhulgas väärtuslikud kliinilised sademed, mis ei talu lisaülekandeetappi.
• Protsessi kontroll: Amplituudi saab reguleerida vahemikus 20 kuni 100%, pulsirežiimi vahemikus 0 kuni 100% ning süsteemid toetavad temperatuuri jälgimist, et termotundlikud tüved ja valgud püsiksid kahjustavatest piirväärtustest allpool.

Tüüpilised rakendused

• Mikrobioomi ja soolesisalduse analüüs: Lactobacillus’e, Bifidobacterium’i ja väljaheiteproovide dispergeerimine enne külvamist või sekveneerimist, et kogumid ei vähendaks loendusi.
• Toidu- ja veemikrobioloogia: helveste disagregeerimine tampoonides, loputusvedelikes ja rikastuskeediskeskkondades täpseks kolooniate ja elujõulisuse määramiseks.
• Biokile uuringud: rakkude taastamine kandjatelt ja pindadelt üksikrakususpensioonidena, ilma ensümaatilise töötluseta, mis eemaldaks pinnavalke.
• Kliiniline diagnostika: röga, mäda ja tampooniloputusvedelike resuspendeerimine isolatsioonitingimustes.
• Rakukultuur: kokkukleepunud imetaja-, putuka- ja CHO-rakkude agregaatide eraldamine enne loendamist ja ümberkülvamist.
• Kogu töövoo ettevalmistus: sama seade, mis disagregeerib madalal amplituudil, teostab kõrgematel seadistustel täieliku rakkude lõhkumise, nii et lüüs, valkude ekstraheerimine ja DNA fragmenteerimine järgnevad ilma tuubide ümberkandmiseta.

Kirjandus / viited

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
• Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.