MBEC testiprotokoll, kasutades 96-augulist Plate Sonicatori UIP400MTP
MBEC-testi kasutatakse antimikroobsete ainete kontsentratsiooni määramiseks, mis on vajalikud tihvtkaantele moodustunud biokilede kõrvaldamiseks. Biokile elujõulisuse hindamiseks tuleb biokiled kõigepealt eemaldada 96-augulise plaadi tihvtikaantest. Sonikatsioon on selle eraldumise kõige usaldusväärsem ja tõhusam meetod. Mitme auguga plaadi sonikaatori UIP400MTP on spetsiaalselt loodud katseplaatide töötlemiseks maksimaalse efektiivsuse ja mugavusega, lihtsustades ja kiirendades suure läbilaskevõimega MBEC-teste.
Ultrahelitöötlus biokile eraldamiseks
Sonikatsioon on oluline samm minimaalse biokile likvideerimiskontsentratsiooni (MBEC) testides, mis võimaldab biokilerakkude tõhusat eemaldamist nende pinnakinnitusest. Biokiled on oma olemuselt struktureeritud mikroorganismide kogukonnad, mis on ümbritsetud rakuvälise maatriksiga, mis muudab need antimikroobsete ainete suhtes oluliselt resistentsemaks võrreldes planktonirakkudega. MBEC-testide ajal kasutab ultrahelitöötlus ultraheli laineid, et genereerida kontrollitud kavitatsiooni, häirides biokile maatriksit ja vabastades sisseehitatud rakud suspensiooni. Selle etapiga tagatakse, et biokilerakud dispergeeruvad ühtlaselt taastesöötmes, hõlbustades eluvõimelisuse täpset hindamist plaatimise, lahjendamise või spektrofotomeetriliste meetodite abil. Ilma nõuetekohase biokile eraldumiseta võivad maatriksi jääkkomponendid rakke varjestada, mis viib antimikroobse efektiivsuse alahindamiseni. Seetõttu on ultrahelitöötlus hädavajalik usaldusväärsete ja reprodutseeritavate MBEC väärtuste saamiseks, mis peegeldavad testitud ainete tõelist likvideerimispotentsiaali. Mitme auguga plaadi sonikaatori UIP400MTP võimaldab facile suure läbilaskevõimega proovi ettevalmistamist katseplaatidel.
Mitme kaevuga plaadi sonikaatori UIP400MTP hõlbustab suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistamist katseplaatidel.
Biokile minimaalse likvideerimiskontsentratsiooni (MBEC) analüüsi protokoll
1. samm: biokile moodustumine
- Valmistage bakterisuspensioon:
Kasvatage baktereid sobivas söötmes logaritmilise faasi kasvuks.
Bakterikultuur lahjendatakse kindlaksmääratud optilise tiheduseni (nt OD600 ~0,1). - 96auguline plaat inokuleeritakse:
Lisatakse baktersuspensioon (nt 150–200 μL) standardse 96 süvendiga mikrotiiterplaadi igasse auku. - Kinnitage tihvti kaas:
Pulga kaas asetatakse inokuleeritud plaadile, et võimaldada biokile moodustumist tihvti pindadele. - Plaati inkubeeritakse:
Inkubeerida seadistust sobival temperatuuril (nt 37 °C) 24–48 tundi ilma loksutamata, et soodustada biokile kasvu.
2. samm: ravi antimikroobsete ainetega
- Valmistage antimikroobsed lahused:
Valmistage värskes söötmes ette mitmesugused antimikroobsed kontsentratsioonid.
Paljastage biokiled antimikroobsetele ainetele:
Eemaldage bakterikultuurist tihvti kaas ja loputage seda steriilses soolalahuses või fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses, et eemaldada planktonirakud.
Pulga kaas asetatakse uuele 96 süvendiga plaadile, mis sisaldab antimikroobseid lahuseid. - Plaati inkubeeritakse:
Inkubeeritakse kindlaksmääratud aja jooksul (nt 24 tundi), et võimaldada antimikroobset ravimit.
Mitme kaevuga plaadi sonikaatori UIP400MTP suure läbilaskevõimega proovi ettevalmistamiseks
3. samm: ultrahelitöötlus 96-süvendiga plaadi sonikaatoriga UIP400MTP
Ultrahelitöötluse etapp on kriitilise tähtsusega biokilede eemaldamiseks tihvti kaantest, et hinnata elujõulisust. Järgige UIP400MTP sonikaatori jaoks neid samme:
- Valmistage seadistus ette.
Värske 96 auguga plaat täidetakse igas augus regenereerimissöötmega (nt neutraliseeriv puljong või värske kasvusööde). - Viige tihvti kaas üle:
Eemaldage antimikroobse ravi plaadilt tihvti kaas.
Antimikroobsete ainete jääkide eemaldamiseks loputage tihvti kaant steriilses soolalahuses või fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses. - Asetage plaat ja sonikaator:
Kinnitage tihvti kaas taastumiskeskkonna plaadile.
Asetage taaskasutatav söötmeplaat sonikaatori UIP400MTP platvormile, tagades, et plaat on tsentreeritud ja stabiilne. - Reguleerige ultrahelitöötluse parameetreid:
Määrake ultrahelitöötluse parameetrid UIP400MTP (Seadeid saab reguleerida biokilega):
Amplituud: 70–100%.
Sonikatsiooniaeg: 1–3 minutit (reguleerige vastavalt biokile tugevusele) tsükli režiimis. - Sonikaat:
Alustage ultrahelitöötlusprotsessi. Ultraheli vibratsioon eemaldab biokiled tihvtipindadelt taastumiskeskkonda. - Jälgige protsessi:
Kasutage ühendatavat temperatuuriandurit, et jälgida proovi temperatuuri süvendites. UIP400MTP saab jahutamiseks ühendada laborijahutiga. - Ultrahelitöötluse järgne käitlemine:
Saagist saadud sööde (mis nüüd sisaldab eemaldatud biokilesid) kantakse kohe värskele steriilsele plaadile järgnevaks analüüsiks.
(A) TSB-d sisaldav plaat 2% glükoosiga, mida kasutatakse biokile moodustamiseks, rakkude taastamiseks ja
MIC ja MBCB määramine; (B) Tihvtidega kaas stafülokokkide biokilede moodustamiseks. MIC ja MBCB määramine; (B) Tihvtidega kaas stafülokokkide biokilede moodustamiseks.
Tihvtidele moodustatud biokilerakud eemaldati ultrahelitöötlusega (Hielscher Ultrasound Technology) 5 minutiks 96-süvendi plaatidel, mis sisaldasid värsket söödet rakkude taastumiseks.
(Pilt ja uuring: ©de Oliveira et al., 2016)
4. etapp: elujõulisuse hindamine
Plaadil ja kultuuris eraldatud biokiled:
- Saagisöötme ja plaadi seerialahjendused tehakse agarile, et loendada kolooniaid moodustavaid ühikuid (CFU).
Teise võimalusena võite kasutada kolorimeetrilist või fluorestsentsil põhinevat eluvõimelisuse testi. - Rekordilised tulemused:
Määrata MBEC kui antimikroobse aine madalaim kontsentratsioon, mis on hävitanud tuvastatava biokile eluvõimelisuse.
Disain, tootmine ja nõustamine – Kvaliteet Valmistatud Saksamaal
Hielscheri ultrasonikaatorid on tuntud oma kõrgeimate kvaliteedi- ja disainistandardite poolest. Vastupidavus ja lihtne kasutamine võimaldavad meie ultrasonikaatorite sujuvat integreerimist tööstusrajatistesse. Hielscheri sonikaatorid saavad kergesti käsitseda karmid tingimused ja nõudlikud keskkonnad.
Hielscher Ultrasonics on ISO sertifitseeritud ettevõte ja paneb erilist rõhku suure jõudlusega ultrasonikaatoritele, millel on tipptasemel tehnoloogia ja kasutajasõbralikkus. Loomulikult on Hielscheri ultrasonikaatorid CE-nõuetele vastavad ja vastavad UL, CSA ja RoHs nõuetele.
Tõhustada proovi ettevalmistamist 96 auguga plaatidel ja analüüsiplaatidel kasutades mitme kaevuga plaadi sonikaatorit UIP400MTP
Kirjandus / Viited
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Microplate Sonicator Validated in Peer-Reviewed Proteomics Study
Korduma kippuvad küsimused
Mis on MBEC-test?
Minimaalse biokile likvideerimiskontsentratsiooni (MBEC) test on standardiseeritud meetod, mida kasutatakse biokilega seotud bakterite hävitamiseks vajaliku antimikroobse aine madalaima kontsentratsiooni määramiseks. See hõlmab biokilede kasvatamist spetsiaalsetel pindadel, nende kokkupuudet erinevate antimikroobsete kontsentratsioonidega ja eraldatud rakkude elujõulisuse hindamist pärast biokile katkemist, tavaliselt ultrahelitöötluse kaudu, et hinnata ravi efektiivsust.
Mis on MBIC-il ja MBEC-il?
Minimaalne biokile inhibeeriv kontsentratsioon (MBIC) on biokile tekke vältimiseks vajaliku antimikroobse aine madalaim kontsentratsioon, samas kui minimaalne biokile likvideerimise kontsentratsioon (MBEC) on madalaim kontsentratsioon, mis on vajalik väljakujunenud biokile hävitamiseks. MBIC keskendub biokilede ennetamisele, samas kui MBEC hindab ravi efektiivsust küpsete biokilede suhtes.
Milliseid plaate kasutatakse tavaliselt MBEC-testides?
MBEC-analüüsides tavaliselt kasutatavad mikrotiiterplaadid on tavaliselt 96 süvendiga plaadid, mis on valmistatud polüstüreenist või polüpropüleenist. Need materjalid tagavad sobiva pinna biokile moodustamiseks ja on keemiliselt resistentsed katse käigus testitud antimikroobsete ainete suhtes. Polüstüreenplaate eelistatakse laialdaselt nende optilise selguse tõttu, mis on kasulik järgnevateks analüüsideks, näiteks spektrofotomeetrilisteks või fluorestsentspõhisteks mõõtmisteks. Nende plaatide konstruktsioon sisaldab eemaldatavaid tihvtkaane, mis on katse jaoks hädavajalikud, kuna kasvukeskkonda sisaldavatesse aukudesse sukeldatud tihvtidele moodustuvad biokiled. Standardiseeritud plaadid, näiteks need, mis vastavad MBEC katseprotokollile, on spetsiaalselt konstrueeritud, et tagada reprodutseeritavus ja ühilduvus UIP400MTP sonikaatori või muude töötlemisseadmetega.
Mis on PEG-kaanega plaadid?
PEG-kaanega plaadid on spetsiaalsed mitme süvendiga plaadisüsteemid, kus kaas on varustatud väikeste polüetüleenglükooli (PEG) tihvtide või tihvtidega, mis ulatuvad igasse süvendisse. Need tihvtid pakuvad pinda mikroobide biokile moodustamiseks kontrollitud tingimustes, jäljendades reaalset biokile kasvu. Disain võimaldab biokiledel areneda tihvtidel, samal ajal kui augud sisaldavad kasvukeskkonda või antimikroobseid aineid, võimaldades suure läbilaskevõimega testida biokile vastuvõtlikkust ravile, näiteks MBEC ja MBIC testides.
Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid alates Lab kuni tööstuslik suurus.