MBEC-analüüsi protokoll 96-süvendilise plaadi sonikaatoriga UIP400MTP

MBEC-analüüsi kasutatakse selliste antimikroobsete ainete kontsentratsiooni määramiseks, mis on vajalikud pinnaste (peg) kaanele tekkinud biokilede hävitamiseks. Biokile elujõulisuse hindamiseks tuleb biokiled esmalt 96-süvendilise plaadi pinnastega kaanelt lahti saada. Ultraheli töötlus (sonikeerimine) on selleks kõige usaldusväärsem ja tõhusam meetod. Mitme süvendiga plaatide sonikaator UIP400MTP on spetsiaalselt loodud analüüsiplaatide töötlemiseks maksimaalse tõhususe ja mugavusega, muutes suure läbilaskevõimega MBEC-analüüsid sujuvamaks ja kiiremaks.

Ultraheli töötlus biokilede lahtisaamiseks

Ultraheli töötlus (sonikeerimine) on minimaalse biokilede hävitamise kontsentratsiooni (Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC) analüüside oluline etapp, mis võimaldab biokilerakke nende pinnakinnitusest tõhusalt lahti saada. Biokiled on oma olemuselt struktureeritud mikroorganismide kooslused, mis on ümbritsetud rakuvälise maatriksiga, mistõttu on nad planktonirakkudega võrreldes antimikroobsete ainete suhtes oluliselt vastupidavamad. MBEC-analüüside ajal tekitab ultraheli töötlus ultrahelilainetega kontrollitud kavitatsiooni, mis lõhub biokile maatriksi ja vabastab sinna kinnistunud rakud suspensiooni. See etapp tagab, et biokilerakud on taaskasvusöötmes ühtlaselt hajutatud, mis hõlbustab elujõulisuse täpset hindamist külvamise, lahjendamise või spektrofotomeetriliste meetodite abil. Ilma nõuetekohase biokilede lahtisaamiseta võivad maatriksi jääkkomponendid rakke varjata, mis toob kaasa antimikroobse toime alahindamise. Seetõttu on ultraheli töötlus möödapääsmatu usaldusväärsete ja korratavate MBEC-väärtuste saamiseks, mis kajastavad testitud ainete tegelikku hävitamispotentsiaali. Mitme süvendiga plaatide sonikaator UIP400MTP võimaldab analüüsiplaatides lihtsat suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistamist.

Minimaalse biokilede hävitamise kontsentratsiooni (MBEC) analüüsi protokoll

1. etapp: biokile moodustamine

1. Valmistage ette bakterisuspensioon:
   Kasvatage baktereid sobivas söötmes logaritmilise kasvufaasini.
   Lahjendage bakterikultuur kindla optilise tiheduseni (nt OD600 ~0,1).
2. Inokuleerige 96-süvendiline plaat:
   Lisage bakterisuspensioon (nt 150–200 µL) standardse 96-süvendilise mikrotiiterplaadi igasse süvendisse.
3. Kinnitage pinnastega kaas:
   Asetage pinnastega kaas inokuleeritud plaadile, et biokile saaks pinnaste pinnale tekkida.
4. Inkubeerige plaati:
   Inkubeerige seadet sobival temperatuuril (nt 37°C) 24–48 tundi ilma loksutamata, et soodustada biokile kasvu.

2. etapp: töötlemine antimikroobsete ainetega

• Valmistage ette antimikroobsed lahused:
  Valmistage värskes söötmes antimikroobsete kontsentratsioonide vahemik.
  Võtke biokiled antimikroobsete ainete toime alla:
  Eemaldage pinnastega kaas bakterikultuurilt ja loputage seda steriilses soolalahuses või PBS-is, et eemaldada planktonirakud.
  Asetage pinnastega kaas uude 96-süvendilisse plaati, mis sisaldab antimikroobseid lahuseid.
• Inkubeerige plaati:
  Inkubeerige määratud aja (nt 24 tundi), et võimaldada antimikroobset toimet.

3. etapp: ultraheli töötlus 96-süvendilise plaadi sonikaatoriga UIP400MTP

Ultraheli töötluse etapp on biokilede pinnastega kaanelt lahtisaamiseks elujõulisuse hindamiseks otsustava tähtsusega. Järgige sonikaatori UIP400MTP puhul neid samme:

1. Valmistage ette seade:
   Täitke värske 96-süvendiline plaat taaskasvusöötmega (nt neutraliseeriv puljong või värske kasvusööde) igas süvendis.
2. Viige pinnastega kaas üle:
   Eemaldage pinnastega kaas antimikroobse töötluse plaadilt.
   Loputage pinnastega kaant steriilses soolalahuses või PBS-is, et eemaldada antimikroobsete ainete jäägid.
3. Asetage plaat ja sonikaator õigesse asendisse:
   Kinnitage pinnastega kaas taaskasvusöötme plaadile.
   Asetage taaskasvusöötme plaat sonikaatori UIP400MTP platvormile, tagades, et plaat on tsentreeritud ja stabiilne.
4. Reguleerige ultraheli töötluse parameetreid:
   Seadistage UIP400MTP ultraheli töötluse parameetrid (seadeid saab biokilele kohandada):
   Amplituud: 70–100%.
   Ultraheli töötluse kestus: 1–3 minutit (kohandage vastavalt biokile vastupidavusele) tsüklirežiimis.
5. Sonikeerige:
   Alustage ultraheli töötlust. Ultrahelivibratsioon eraldab biokiled pinnaste pinnalt taaskasvusöötmesse.
6. Jälgige protsessi:
   Kasutage ühendatavat temperatuuriandurit, et jälgida proovi temperatuuri süvendites. Seadet UIP400MTP saab jahutamiseks ühendada laborijahutiga.
7. Käsitsemine pärast ultraheli töötlust:
   Viige taaskasvusööde (mis sisaldab nüüd lahtisaanud biokilesid) kohe üle värskesse steriilsesse plaati järgnevaks analüüsiks.

(A) Plaat, mis sisaldab 2% glükoosiga TSB-d, mida kasutati biokile moodustamiseks, rakkude taaskasvatamiseks ning
MIC ja MBCB määramiseks; (B) kaas pinnastega stafülokokkide biokilede moodustamiseks. MIC ja MBCB määramiseks; (B) kaas pinnastega stafülokokkide biokilede moodustamiseks.
Pinnastele tekkinud biokilerakud eraldati ultraheli töötlusega (Hielscher Ultrasound Technology) 5 minuti jooksul 96-süvendilistes plaatides, mis sisaldasid värsket kasvusöödet rakkude taaskasvatamiseks.
(Pilt ja uuring: ©de Oliveira et al., 2016)

4. etapp: elujõulisuse hindamine

Külvake lahtisaanud biokiled plaatidele ja kasvatage neid:

1. Tehke taaskasvusöötme jadalahjendused ja külvake agarile, et loendada kolooniaid moodustavaid ühikuid (CFU).
   Või kasutage kolorimeetrilist või fluorestsentsipõhist elujõulisuse analüüsi.
2. Salvestage tulemused:
   Määrake MBEC kui antimikroobse aine madalaim kontsentratsioon, mis hävitas tuvastatava biokile elujõulisuse.

Disain, tootmine ja nõustamine – kvaliteet, mis on valmistatud Saksamaal

Hielscheri ultraheli seadmed on tuntud oma parima kvaliteedi ja disainistandardite poolest. Töökindlus ja lihtne kasutamine võimaldavad meie ultraheli seadmeid sujuvalt tööstusrajatistesse integreerida. Hielscheri sonikaatorid tulevad kergesti toime karmide tingimuste ja nõudlike keskkondadega.

Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifitseeritud ettevõte ja paneb erilist rõhku suure jõudlusega ultraheli seadmetele, mis põhinevad tipptehnoloogial ja on kasutajasõbralikud. Loomulikult vastavad Hielscheri ultraheli seadmed CE nõuetele ning UL-i, CSA ja RoHs nõuetele.

Lugege siit, kuidas seadet UIP400MTP kasutatakse biokilede lahtisaamiseks proovide ettevalmistamise etapina ASTM E2799 protokollis, millega testitakse desinfektsioonivahendite tõhusust Pseudomonas aeruginosa biokile vastu MBEC-analüüsi abil.