Minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) analüüsi protokoll
Biokilel põhineva minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) test on oluline meetod antimikroobsete ainete tõhususe hindamiseks biokilega seotud mikroorganismide vastu, millel on kaitsva rakuvälise maatriksi tõttu suurem resistentsus. Oluline samm selles katses on biokile struktuuride katkestamine, et vabastada manustatud rakud täpseks elujõulisuse hindamiseks. UIP400MTP mitme kaevuga plaadi sonikaator hõlbustab seda protsessi, kasutades kontrollitud kavitatsiooni genereerimiseks fokuseeritud ultraheli, eemaldades tõhusalt biokilerakud ja hajutades need ühtlaseks suspensiooniks. See täpne ja reprodutseeritav biokile katkestus suurendab MIC-testide usaldusväärsust ja läbilaskevõimet, muutes UIP400MTP oluliseks vahendiks biokileuuringute edendamisel.
Ultrahelitöötlus biokile eraldamiseks
Biokilel põhinev MIC-test mõõdab tavaliselt bakterite eluvõimelisust või kasvu pärssimist, kasutades selliseid meetodeid nagu plaatimine, kolooniate loendamine või optilise tiheduse mõõtmine. Sonikatsioon on biokilepõhiste MIC-testide kriitiline samm biokilega seotud mikroorganismide antimikroobse tundlikkuse hindamisel. Selle esmane ülesanne on biokile maatriksisse manustatud rakkude eraldamine ja hajutamine ühtlaseks suspensiooniks täpseks analüüsiks.
Biokiled on antimikroobsete ainete suhtes oluliselt resistentsemad kui planktonirakud, mistõttu on õige eraldumine täpse analüüsi jaoks kriitilise tähtsusega. Selle protsessi käigus tekitavad ultraheli lained kontrollitud kavitatsiooni, purustades biokile maatriksi ja vabastades manustatud rakud ühtlaseks suspensiooniks taastumiskeskkonnas. See etapp võimaldab täpselt hinnata biokiles dispergeeritud rakkude eluvõimelisust selliste meetodite abil nagu plaatimine, lahjendamine ja kolooniate loendamine. Õige biokile katkemine ultrahelitöötluse kaudu takistab jääkmaatriksi komponentide varjestusrakke, mis võib vastasel juhul viia antimikroobse toime alahindamiseni. Mitme kaevuga plaadi sonikaatori UIP400MTP sobib selleks eriti hästi, pakkudes täpseid ja reprodutseeritavaid ultrahelitöötlustingimusi, et tagada katseplaatide usaldusväärne ja suure läbilaskevõimega ettevalmistamine.
UIP400MTP mikroplaadi sonikaator täpselt kontrollitavaks biokile eemaldamiseks MIC- ja MBEC-testides.
Miks on ultrahelitöötlus vajalik biokilepõhistes minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni testides
Eluvõimelisuse mõõtmiseks ja rakkude loendamiseks on vaja üksikute rakkude täielikku ja usaldusväärset eraldumist ja hajutamist. UIP400MTP soodustab ühtlast, mittekahjustavat biokile eraldumist ja rakkude dispersiooni tugevate analüüsitulemuste saavutamiseks.
- Biokile keerukus: Biokiled on struktureeritud mikroobikooslused, mis on ümbritsetud rakuvälise polümeerse aine (EPS) maatriksiga, mis kaitseb mikroorganisme ja muudab need antimikroobsete ainete suhtes resistentsemaks.
- Ühtlane dispersioon: Biokilesse manustatud rakkude elujõulisuse või nende antimikroobikumide suhtes vastuvõtlikkuse täpseks mõõtmiseks tuleb biokile kõigepealt eemaldada ja lagundada homogeenseks suspensiooniks.
Biokilel põhinev minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni analüüsi protokoll
Minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) test määrab mikroorganismide nähtava kasvu pärssimiseks vajaliku antimikroobse aine madalaima kontsentratsiooni. See protokoll on mõeldud biokilega seotud mikroorganismidele, kasutades biokile katkestamiseks UIP400MTP mitme auguga plaadi sonikaatorit.
1. samm: bakteriaalse inokulaadi valmistamine
- Valmistage bakterisuspensioon:
Kasvatage baktereid sobivas söötmes logaritmilise faasi keskpaigani.
Kultuuri lahjendatakse standarditud rakutiheduse saavutamiseks (nt 0,5 McFarlandi standard või OD600 ~0,1). - Valmistage antimikroobsed lahused:
Antimikroobne aine lahjendatakse sobivas keskkonnas, et tekiks kontsentratsioonide vahemik (nt kahekordsed seerialahjendused). - Jaotage 96welli plaadile:
Antimikroobsed lahused lisatakse standardse 96 auguga plaadi aukudesse, mille lõplik maht on ~150–200 μL.
Lisada kasvukontrollid (ei sisalda antimikroobseid aineid) ja steriilsuse kontrolle (ei sisalda bakteriaalset inokulaati).
2. samm: biokile moodustumine pulgakaanel
- Kinnitage tihvti kaas:
Asetage spetsiaalne tihvti kaas inokuleeritud aukudesse, tagades, et tihvtid on täielikult bakterisuspensiooni sukeldatud. - Plaati inkubeeritakse:
Inkubeeritakse sobival temperatuuril (nt 37 °C) kindlaksmääratud aja jooksul (nt 24 tundi) staatilistes tingimustes, et võimaldada biokile moodustumist tihvtidele. - Loputage tihvtid:
Eemaldage baktersuspensioonilt tihvti kaas ja loputage õrnalt steriilses soolalahuses või fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses, et eemaldada lõdvalt kinnitatud planktonirakud. - Kokkupuude antimikroobsete ainetega:
Viige tihvti kaas uuele 96welli plaadile, mis sisaldab varem valmistatud antimikroobseid lahjendusi.
Inkubeeritakse kindlaksmääratud aja jooksul (nt 24 tundi) staatilistes tingimustes, et antimikroobne aine saaks biokiledele mõjuda.
3. etapp: antimikroobne kokkupuude
Mitme kaevuga plaadi sonikaatori UIP400MTP suure läbilaskevõimega proovi ettevalmistamiseks
4. samm: ultrahelitöötlus mikroplaadi sonikaatoriga UIP400MTP
Ultrahelitöötluse etapp on kriitilise tähtsusega biokilede eemaldamiseks tihvti kaantest, et hinnata elujõulisust. Järgige UIP400MTP sonikaatori jaoks neid samme:
- Valmistage seadistus ette.
Värske 96 auguga plaat täidetakse igas augus taastumissöötmega (nt neutraliseeriv puljong või steriilne kasvusööde). - Viige tihvti kaas üle:
Eemaldage antimikroobse ravi plaadilt tihvti kaas.
Antimikroobsete ainete jääkide eemaldamiseks loputage tihvti kaant steriilses soolalahuses või fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses. - Asetage plaat sonikaatorisse:
Kinnitage tihvti kaas taastumiskeskkonna plaadile.
Taastumissöötme plaat asetatakse sonikaatori UIP400MTP, tagades, et plaat istub keskel ja stabiilsena nagu kirjeldatud juhendis. - Reguleerige ultrahelitöötluse parameetreid:
Määrake ultrahelitöötluse parameetrid UIP400MTP (seadeid võib kohandada biokilega):
Amplituud: 70–100%.
Sonikatsiooniaeg: 1–3 minutit (reguleerige vastavalt biokile struktuurile) tsükli režiimis. - Sonikaat:
Alustage ultrahelitöötlusprotsessi. Ultraheli lained häirivad biokile maatriksit ja hajutavad rakud taastumiskeskkonda. - Jälgige protsessi:
Kasutage ühendatavat temperatuuriandurit, et jälgida proovi temperatuuri süvendites. UIP400MTP saab jahutamiseks ühendada laborijahutiga. - Ultrahelitöötluse järgne käitlemine:
Eemaldatud biokilesid sisaldav taastussööde kantakse kohe analüüsimiseks värskele steriilsele plaadile.
(A) TSB-d sisaldav plaat 2% glükoosiga, mida kasutatakse biokile moodustamiseks, rakkude taastamiseks ning MIC ja MBEC määramiseks; (B) Tihvtidega kaas stafülokokkide biokilede moodustamiseks.
Tihvtidele moodustatud biokilerakud eemaldati ultrahelitöötlusega (Hielscher Ultrasound Technology) 5 minutiks 96-süvendi plaatidel, mis sisaldasid värsket söödet rakkude taastumiseks.
(Pilt ja uuring: ©de Oliveira et al., 2016)
4. etapp: elujõulisuse hindamine
Plaadil ja kultuuris eraldatud biokiled:
- Saagisöötme ja plaadi seerialahjendused tehakse agarile, et loendada kolooniaid moodustavaid ühikuid (CFU).
- Hinnake MIC-d:
Määrata MIC kui madalaim antimikroobne kontsentratsioon, mis pärsib täielikult mikroobide nähtavat kasvu taastumiskeskkonnas.
MIC minimaalne inhibeeriv kontsentratsioon: mikrotiiterplaadi näide ja mikrodilutsiooni tulemuste tõlgendamine.
(Uuring ja pilt: ©Jaskiewicz et al. 2019)
Disain, tootmine ja nõustamine – Kvaliteet Valmistatud Saksamaal
Hielscheri ultrasonikaatorid on tuntud oma kõrgeimate kvaliteedi- ja disainistandardite poolest. Vastupidavus ja lihtne kasutamine võimaldavad meie ultrasonikaatorite sujuvat integreerimist tööstusrajatistesse. Hielscheri sonikaatorid saavad kergesti käsitseda karmid tingimused ja nõudlikud keskkonnad.
Hielscher Ultrasonics on ISO sertifitseeritud ettevõte ja paneb erilist rõhku suure jõudlusega ultrasonikaatoritele, millel on tipptasemel tehnoloogia ja kasutajasõbralikkus. Loomulikult on Hielscheri ultrasonikaatorid CE-nõuetele vastavad ja vastavad UL, CSA ja RoHs nõuetele.
Tõhustada proovi ettevalmistamist 96 auguga plaatidel ja analüüsiplaatidel kasutades mitme kaevuga plaadi sonikaatorit UIP400MTP
Kirjandus / Viited
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Korduma kippuvad küsimused
Mis on MIC-test?
Minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) test on standardiseeritud test, mida kasutatakse mikroorganismi nähtava kasvu pärssimiseks vajaliku antimikroobse aine madalaima kontsentratsiooni määramiseks. Seda tehakse tavaliselt puljongi mikrodilutiooni või agari lahjendamise meetodite abil, kus mikroorganismid puutuvad kokku antimikroobse aine seerialahjendustega. MIC-testid on kriitilise tähtsusega antimikroobse efektiivsuse hindamisel, kliinilise ravi suunamisel ja resistentsuse taseme hindamisel nii planktoni kui ka biokilega seotud mikroorganismides.
Mis on biokilel põhineva minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni testi ja MBIC-testi vahel?
Biokilel põhinev minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) test ja minimaalse biokile inhibeeriva kontsentratsiooni (MBIC) test on omavahel seotud, kuid erinevad oma eesmärgi ja metoodika poolest.
Biokilel põhinevas MIC-testis hinnatakse antimikroobse aine madalaimat kontsentratsiooni, mis on vajalik nähtava biokile kasvu või elujõulisuse pärssimiseks, keskendudes pigem biokilega seotud rakkudele kui planktonibakteritele. Seevastu MBIC-test mõõdab konkreetselt antimikroobse aine võimet takistada biokile teket, selle asemel et töödelda eelnevalt moodustunud biokilesid. Kuigi mõlemad testid käsitlevad biokilega seotud baktereid, käsitleb biokilepõhine MIC-test ravi ja MBIC-test rõhutab ennetamist, muutes need täiendavateks vahenditeks antimikroobse efektiivsuse uurimiseks biokilede vastu.
Milliseid biokilesid kasutatakse MIC-testides?
Nii mikroobseid biokilesid kui ka planktonirakke kasutatakse minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) testides, et uurida antimikroobset efektiivsust erinevates tingimustes.
- Planktoni rakud:
Planktonirakud on vabalt ujuvad üksikud mikroobirakud, mis on traditsiooniliste MIC-testide standardmudeliks. Tavaliste mikroorganismide hulka kuuluvad Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ja Candida albicans. Need analüüsid määravad vabalt elavate rakkude kasvu pärssimiseks vajaliku MIC-i ja on kriitilise tähtsusega esialgse antimikroobse sõeluuringu jaoks. - Biokilega seotud rakud:
Biokile rakud on mikroorganismid, mis on paigutatud ekstratsellulaarsesse maatriksisse, mis suurendab oluliselt nende resistentsust antimikroobsete ainete suhtes. Biokile MIC-testid hõlmavad sageli järgmist:- Gramnegatiivsed bakterid: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ja Klebsiella pneumoniae, mis on tuntud biokile moodustumise poolest infektsioonides ja tööstuskeskkonnas.
- Grampositiivsed bakterid: Staphylococcus aureus (sealhulgas MRSA), Staphylococcus epidermidis ja Enterococcus faecalis, mis on tavaliselt seotud seadmega seotud infektsioonidega.
- Seened: Candida albicans ja sellega seotud liigid, mis on olulised biokilega seotud seeninfektsioonide korral.
- Segaliikide biokiled: neid kasutatakse mõnikord looduslike polümikroobsete biokilede, näiteks krooniliste haavade või tööstusliku bioreostuse paljundamiseks.
Võrreldes planktonirakkude ja biokilega seotud rakkude MIC-väärtusi, saavad teadlased hinnata biokilede suurenenud resistentsust ja tuvastada nende vastupidavamate mikroobikoosluste vastu tõhusaid aineid.
Mis on MIC ja MBEC vahel?
Minimaalne inhibeeriv kontsentratsioon (MIC) on biokile tekke vältimiseks vajaliku antimikroobse aine madalaim kontsentratsioon, samas kui minimaalne biokile likvideerimise kontsentratsioon (MBEC) on madalaim kontsentratsioon, mis on vajalik väljakujunenud biokile hävitamiseks. MIC keskendub biokilede ennetamisele, samas kui MBEC hindab ravi efektiivsust küpsete biokilede suhtes.
Milliseid plaate kasutatakse tavaliselt MBEC-testides?
MBEC-analüüsides tavaliselt kasutatavad mikrotiiterplaadid on tavaliselt 96 süvendiga plaadid, mis on valmistatud polüstüreenist või polüpropüleenist. Need materjalid tagavad sobiva pinna biokile moodustamiseks ja on keemiliselt resistentsed katse käigus testitud antimikroobsete ainete suhtes. Polüstüreenplaate eelistatakse laialdaselt nende optilise selguse tõttu, mis on kasulik järgnevateks analüüsideks, näiteks spektrofotomeetrilisteks või fluorestsentspõhisteks mõõtmisteks. Nende plaatide konstruktsioon sisaldab eemaldatavaid tihvtkaane, mis on katse jaoks hädavajalikud, kuna kasvukeskkonda sisaldavatesse aukudesse sukeldatud tihvtidele moodustuvad biokiled. Standardiseeritud plaadid, näiteks need, mis vastavad MBEC katseprotokollile, on spetsiaalselt konstrueeritud, et tagada reprodutseeritavus ja ühilduvus UIP400MTP sonikaatori või muude töötlemisseadmetega.
Mis on PEG-kaanega plaadid?
PEG-kaanega plaadid on spetsiaalsed mitme süvendiga plaadisüsteemid, kus kaas on varustatud väikeste polüetüleenglükooli (PEG) tihvtide või tihvtidega, mis ulatuvad igasse süvendisse. Need tihvtid pakuvad pinda mikroobide biokile moodustamiseks kontrollitud tingimustes, jäljendades reaalset biokile kasvu. Disain võimaldab biokiledel areneda tihvtidel, samal ajal kui augud sisaldavad kasvukeskkonda või antimikroobseid aineid, võimaldades suure läbilaskevõimega testida biokile vastuvõtlikkust ravile, näiteks MBEC-, MBIC- ja MIC-testides.
Mis on ultraheli biokile nihkumise eelis võrreldes rakkude kraapimisega?
Ultraheli biokile dislodging pakub olulist eelist rakkude kraapimise ees, pakkudes mitteinvasiivset, ühtlast ja väga tõhusat meetodit biokilede eemaldamiseks pindadelt. Erinevalt kraapimisest, mis võib olla ebajärjekindel ja kahjustada aluspinda või rakke, tungivad ultraheli lained biokile maatriksisse, purustades selle ilma külgnevate struktuuride terviklikkust kahjustamata. See meetod tagab reprodutseeritavuse, minimeerib saastumise riski ja on eriti tõhus rakenduste puhul, mis nõuavad täpset biokile eemaldamist, näiteks mikrobioloogilistes uuringutes või meditsiiniseadmete testimisel. Loe lähemalt, kuidas UIP400MTP Sonicator paistab silma rakkude kraapimisega!
Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid alates Lab kuni tööstuslik suurus.