Minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) analüüsi protokoll
Biokilepõhine minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) analüüs on oluline meetod antimikroobsete ainete tõhususe hindamiseks biokilega seotud mikroorganismide vastu, mis on kaitsva rakuvälise maatriksi tõttu suurenenud resistentsusega. Selle analüüsi otsustav samm on biokilestruktuuride eraldamine, et vabastada kilesse kinnistunud rakud elumuse täpseks hindamiseks. Mitmekäsnaplaadi sonikaator UIP400MTP hõlbustab seda protsessi, kasutades fokuseeritud ultraheli kontrollitud kavitatsiooni tekitamiseks, mis eraldab biokile rakud tõhusalt ja hajutab need ühtlaseks suspensiooniks. Selline täpne ja korratav biokile lõhkumine parandab MIC-analüüside usaldusväärsust ja läbilaskevõimet, muutes UIP400MTP biokileuuringute edendamisel oluliseks vahendiks.
Miks peaksin MIC-analüüside ajal kasutama ultraheli töötlust (sonikeerimist)?
- Täpsed ja korratavad andmed: Saate ühtlased rakususpensioonid, mis kõrvaldavad maatriksi varjestava toime ning tagavad, et teie kolooniate arvud ja optilise tiheduse näidud peegeldavad tõepoolest antimikroobset tõhusust.
- Suure läbilaskevõimega tõhusus: Töödelge terve 96-kannuga plaat korraga vaid 1–3 minutiga, asendades aeglase ja ebaühtlase käsitsi kraapimise sujuvama töövooga.
- Säilinud rakkude elumus: Eraldage kinnistunud rakud õrnalt ilma kraapimisest tingitud füüsilise kahjustuseta, säilitades usaldusväärsete MIC/MBEC arvutuste jaoks kõrgema ellujäämismäära.
- Null ristsaastumisriski: Kasutage ära kontaktivaba tassisarvekujulist (cup-horn) konstruktsiooni, mis töötleb kõiki kannusid ühtlaselt, ilma et sondid üksikuid proove või kannusid puudutaksid.
- Standarditele vastav: Viige oma metoodika vastavusse valideeritud tööstusprotokollidega, nagu ASTM E2799-22, mis annab teie andmetele suurema usaldusväärsuse regulatiivsetel või avaldamiseesmärkidel.
- Kindel ravimite ja ravimeetodite sõeluuring: Usaldage oma tundlikkuse tulemusi, et teha nutikamaid otsuseid antimikroobse tõhususe, resistentsusprofiilide määramise või terapeutilise arenduse kohta.
Suurendage oma labori toodangut, säilitades samal ajal rakkude elumuse. Öelge meile oma mikroplaadi tüüp ja saate soovitusi tõhusaks biokile eraldamiseks ja rakkude hajutamiseks suure läbilaskevõimega ultraheli töötlusega.
UIP400MTP mikroplaadi sonikaator täpselt juhitavaks biokile eraldamiseks MIC- ja MBEC-analüüsides.
Ultraheli töötlus biokile eraldamiseks
Biokilepõhine MIC-analüüs mõõdab tavaliselt bakterite elumust või kasvu inhibeerimist selliste meetoditega nagu külv, kolooniate loendamine või optilise tiheduse mõõtmine. Ultraheli töötlus on biokilepõhistes MIC-analüüsides kriitiline samm biokilega seotud mikroorganismide antimikroobse tundlikkuse hindamisel. Selle peamine ülesanne on eraldada biokilemaatriksisse kinnistunud rakud ja hajutada need täpse analüüsi jaoks ühtlaseks suspensiooniks.
Biokiled on antimikroobsete ainete suhtes oluliselt resistentsemad kui planktonrakud, mistõttu on nõuetekohane eraldamine täpse analüüsi jaoks kriitilise tähtsusega. Selle protsessi käigus tekitavad ultrahelilained kontrollitud kavitatsiooni, mis lõhub biokilemaatriksi ja vabastab kinnistunud rakud ühtlaseks suspensiooniks taastussöötmes. See samm võimaldab täpselt hinnata biokilest hajutatud rakkude elumust selliste meetoditega nagu külv, lahjendamine ja kolooniate loendamine. Nõuetekohane biokile lõhkumine ultraheli töötlusega hoiab ära jääkmaatriksikomponentide poolt rakkude varjestamise, mis võiks muidu viia antimikroobse toime alahindamiseni. Mitmekäsnaplaadi sonikaator UIP400MTP sobib selleks eesmärgiks eriti hästi, pakkudes täpseid ja korratavaid ultraheli töötluse tingimusi, et tagada analüüsiplaatide usaldusväärne ja suure läbilaskevõimega ettevalmistus.
Miks on ultraheli töötlus biokilepõhistes minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni analüüsides vajalik
Elumuse mõõtmiseks ja rakkude loendamiseks on vajalik üksikrakkude täielik ja usaldusväärne eraldamine ning hajutamine. UIP400MTP soodustab ühtlast, kahjustamata biokile eraldamist ja rakkude hajutamist töökindlate analüüsitulemuste saamiseks.
- Biokile keerukus: Biofilmid on struktureeritud mikroobikooslused, mida ümbritseb rakuväline polümeerne aine (EPS) maatriks, mis kaitseb mikroorganisme ja muudab need antimikroobsete ainete suhtes vastupidavamaks.
- Ühtlane dispersioon: Biofilmi sisalduvate rakkude elujõulisuse või nende tundlikkuse antimikroobsete ainete suhtes täpseks mõõtmiseks tuleb biofilm kõigepealt lahti kiskuda ja lagundada homogeenseks suspensiooniks.
Kuigi standardne MIC mõõdab planktoonset resistentsust, on ultraheli töötlus (sonikeerimine) biofilmi-MIC ja MBEC testide jaoks hädavajalik, et tagada õige rakkude algtaseme taastumine.
Biofilmipõhise minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni testi protokoll
Minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) test määrab antimikroobse aine madalaima kontsentratsiooni, mis on vajalik mikroorganismide nähtava kasvu pärssimiseks. See protokoll on mõeldud biofilmiga seotud mikroorganismidele ning kasutab biofilmi lõhkumiseks mitme süvendiga plaatide sonikaatorit UIP400MTP.
1. samm: bakteriaalse inokulumi ettevalmistamine
- Valmista ette bakterisuspensioon:
Kasvata baktereid sobivas söötmes keskmise logaritmilise faasini.
Lahjenda kultuuri, et saavutada standardiseeritud rakutihedus (nt 0,5 McFarlandi standard või OD600 ~0,1). - Valmista ette antimikroobsed lahused:
Lahjenda antimikroobset ainet sobivas söötmes, et saada kontsentratsioonide vahemik (nt kahekordsed järjestikused lahjendused). - Jaota 96-süvendilisse plaati:
Lisa antimikroobsed lahused standardse 96-süvendilise plaadi süvenditesse, mille lõplik süvendi maht on ~150–200 µL.
Lisa kasvukontrollid (ilma antimikroobse aineta) ja steriilsuskontrollid (ilma bakteriaalse inokulumita).
2. samm: biofilmi moodustumine tihvtkaanel
- Kinnita tihvtkaas:
Aseta spetsiaalne tihvtkaas inokuleeritud süvenditele, tagades, et tihvtid on bakterisuspensiooni täielikult sukeldatud. - Inkubeeri plaati:
Inkubeeri sobival temperatuuril (nt 37°C) kindlaksmääratud aja (nt 24 tundi) staatilistes tingimustes, et võimaldada biofilmi moodustumist tihvtidel. - Loputa tihvte:
Eemalda tihvtkaas bakterisuspensioonist ning loputa seda õrnalt steriilses soolalahuses või PBS-is, et eemaldada lõdvalt kinnitunud planktoonsed rakud. - Allutada antimikroobsetele ainetele:
Tõsta tihvtkaas uude 96-süvendilisse plaati, mis sisaldab varem valmistatud antimikroobseid lahjendusi.
Inkubeeri kindlaksmääratud aja (nt 24 tundi) staatilistes tingimustes, et antimikroobne aine saaks biofilmidele toimida.
3. samm: kokkupuude antimikroobsete ainetega
Mitme süvendiga plaatide sonikaator UIP400MTP suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistamiseks
4. samm: ultraheli töötlus (sonikeerimine) mikroplaatide sonikaatoriga UIP400MTP
Ultraheli töötluse (sonikeerimise) etapp on biofilmide tihvtkaantelt lahtikiskumisel elujõulisuse hindamiseks kriitilise tähtsusega. Järgi sonikaatori UIP400MTP puhul neid samme:
- Valmista ette seadistus:
Täida uus 96-süvendiline plaat igas süvendis taastussöötmega (nt neutraliseeriv puljong või steriilne kasvusööde). - Tõsta tihvtkaas üle:
Eemalda tihvtkaas antimikroobse töötluse plaadilt.
Loputa tihvtkaant steriilses soolalahuses või PBS-is, et eemaldada antimikroobsete ainete jäägid. - Aseta plaat sonikaatorisse:
Kinnita tihvtkaas taastussöötme plaadile.
Aseta taastussöötme plaat sonikaatorisse UIP400MTP, tagades, et plaat asub tsentreeritult ja stabiilselt, nagu kasutusjuhendis kirjeldatud. - Reguleeri ultraheli töötluse parameetreid:
Sea ultraheli töötluse parameetrid seadmel UIP400MTP (seadeid võib biofilmile vastavalt kohandada):
Amplituud: 70–100%.
Ultraheli töötluse aeg: 1–3 minutit (kohanda vastavalt biofilmi struktuurile) tsüklirežiimis. - Sonikeeri:
Alusta ultraheli töötlust. Ultrahelilained lõhuvad biofilmi maatriksi ja kiskuvad rakud lahti taastussöötmesse. - Jälgi protsessi:
Kasuta ühendatavat temperatuuriandurit, et jälgida proovi temperatuuri süvendites. Sonikaatorit UIP400MTP saab jahutamiseks ühendada laborijahutiga. - Käsitsemine pärast ultraheli töötlust:
Tõsta lahtikistud biofilme sisaldav taastussöötme kohe uude steriilsesse plaati järgnevaks analüüsiks.
(A) Plaat, mis sisaldab TSB-d 2% glükoosiga ja mida kasutati biokile moodustamiseks, rakkude taaskasvatamiseks ning MIC ja MBEC määramiseks; (B) Kaas tihvtidega stafülokokk-biokilede moodustamiseks.
Tihvtidele moodustunud biokilerakud eraldati ultraheli töötlusega (Hielscher Ultrasound Technology) 5 min jooksul 96-augulistes plaatides, mis sisaldasid värsket kasvukeskkonda rakkude taaskasvatamiseks.
(Pilt ja uuring: ©de Oliveira et al., 2016)
4. samm: elujõulisuse hindamine
Eraldatud biokilede külvamine ja kultiveerimine:
- Tehke taaskasvukeskkonnast seeriahalvendused ja külvake need agarile, et loendada kolooniaid moodustavaid ühikuid (CFU).
- MIC hindamine:
Määrake MIC kui madalaim antimikroobne kontsentratsioon, mis inhibeerib täielikult mikroobide nähtava kasvu taaskasvukeskkonnas.
MIC ehk minimaalne inhibeeriv kontsentratsioon: näide mikrotiiterplaadist ja mikrohalvenduse tulemuste tõlgendamisest.
(Uuring ja pilt: ©Jaskiewicz et al. 2019)
Minge üle täppis-kontaktivabale ultraheli töötlusele, et tagada ühtlane rakususpensioon ja usaldusväärsed MIC tulemused!
Kellele on ultraheli töötlusest MIC analüüside ajal kasu?
- Meditsiiniseadmete tootjad: Pinnakatete tõhususe testimiseks ja puhastusprotokollide valideerimiseks seadmetel, mis kalduvad biokilet moodustama.
- Kliinilised mikrobioloogid: Implantaadiga seotud infektsioonide (näiteks PJI) täpseks diagnoosimiseks, eraldades baktereid meditsiinilistelt implantaatidelt.
- Farmaatsiaarendajad: Uute antimikroobsete ainete tõhususe hindamiseks vastupidavate biokilesse põimunud patogeenide vastu.
- Akadeemilised teadlased: Suure läbilaskevõimega ja reprodutseeritavate uuringute läbiviimiseks biokile bioloogia ja antimikroobse resistentsuse mehhanismide kohta.
- Tööstuslikud kvaliteedikontrolli meeskonnad: Biosaastumise ja desinfektsioonivahendite tõhususe hindamiseks tööstuslikes tingimustes (nt ASTM E2799-22 standardite kasutamine).
Disain, tootmine ja nõustamine – Saksamaal valmistatud kvaliteet
Hielscheri ultraheliseadmed on tuntud oma kõrgeima kvaliteedi ja disainistandardite poolest. Töökindlus ja lihtne kasutamine võimaldavad meie ultraheliseadmeid sujuvalt integreerida tööstusrajatistesse. Hielscheri sonikaatorid tulevad kergesti toime raskete tingimuste ja nõudlike keskkondadega.
Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifitseeritud ettevõte ja pöörab erilist tähelepanu suure jõudlusega ultraheliseadmetele, mis põhinevad tipptehnoloogial ja on kasutajasõbralikud. Loomulikult vastavad Hielscheri ultraheliseadmed CE nõuetele ning UL, CSA ja RoHs nõuetele.
Sujuvam proovide ettevalmistus 96-augulistes plaatides ja analüüsiplaatides mitme augu plaadi sonikaatori UIP400MTP abil
Kirjandus / viited
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Korduma kippuvad küsimused
Mis on MIC analüüs?
Minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) analüüs on standardiseeritud test, mida kasutatakse antimikroobse aine madalaima kontsentratsiooni määramiseks, mis on vajalik mikroorganismi nähtava kasvu inhibeerimiseks. Seda tehakse tavaliselt puljongi mikrohalvenduse või agari halvenduse meetodil, kus mikroorganisme eksponeeritakse antimikroobse aine seeriahalvendustele. MIC analüüsid on üliolulised antimikroobse tõhususe hindamisel, kliinilise ravi suunamisel ning resistentsuse taseme hindamisel nii planktoniliste kui ka biokilega seotud mikroorganismide puhul.
Mis vahe on biokilepõhisel minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni analüüsil ja MBIC analüüsil?
Biofilmil põhinev minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) test ja minimaalse biofilmi inhibeeriva kontsentratsiooni (MBIC) test on omavahel seotud, kuid eesmärgi ja metoodika poolest erinevad.
Biofilmil põhinev MIC-test hindab antimikroobse aine madalaimat kontsentratsiooni, mis on vajalik biofilmi nähtava kasvu või elujõulisuse pärssimiseks, keskendudes biofilmiga seotud rakkudele, mitte planktonilistele bakteritele. Seevastu MBIC-test mõõdab spetsiifiliselt antimikroobse aine võimet takistada biofilmi teket, mitte ei käsitle eelnevalt moodustunud biofilmide ravi. Kuigi mõlemad testid tegelevad biofilmiga seotud bakteritega, käsitleb biofilmil põhinev MIC-test ravi ja MBIC-test rõhutab ennetamist, mistõttu on need teineteist täiendavad vahendid antimikroobse toime uurimiseks biofilmide vastu.
Milliseid biofilme kasutatakse MIC-testides?
Mikroobseid biofilme ja planktonilisi rakke kasutatakse mõlemaid minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) testides, et uurida antimikroobset toimet erinevates tingimustes.
- Planktonilised rakud:
Planktonilised rakud on vabalt hõljuvad üksikud mikroobirakud, mis on traditsiooniliste MIC-testide standardmudel. Levinud mikroorganismid on Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ja Candida albicans. Need testid määravad MIC, mis on vajalik vabalt elavate rakkude kasvu pärssimiseks, ning on olulised antimikroobsete ainete esmasel sõeluuringul. - Biofilmiga seotud rakud:
Biofilmi rakud on mikroorganismid, mis on kinnistunud rakuvälisesse maatriksisse, mis suurendab oluliselt nende resistentsust antimikroobsete ainete suhtes. Biofilmi MIC-testid hõlmavad sageli järgmist:- Gramnegatiivsed bakterid: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ja Klebsiella pneumoniae, mis on tuntud biofilmi moodustumise poolest infektsioonides ja tööstuslikes keskkondades.
- Grampositiivsed bakterid: Staphylococcus aureus (sealhulgas MRSA), Staphylococcus epidermidis ja Enterococcus faecalis, mis on sageli seotud seadmetega seotud infektsioonidega.
- Seened: Candida albicans ja sellega seotud liigid, mis on olulised biofilmiga seotud seeninfektsioonides.
- Mitme liigi biofilmid: Neid kasutatakse mõnikord looduslike polümikroobsete biofilmide jäljendamiseks, näiteks need, mida leidub krooniliste haavade juures või tööstuslikus biofouling’us.
Võrreldes planktoniliste rakkude ja biofilmiga seotud rakkude MIC väärtusi, saavad teadlased hinnata biofilmide suurenenud resistentsust ning tuvastada ained, mis on tõhusad nende vastupidavamate mikroobikooslustega.
Mis vahe on MIC ja MBEC vahel?
Minimaalne inhibeeriv kontsentratsioon (MIC) on antimikroobse aine madalaim kontsentratsioon, mis on vajalik biofilmi tekke vältimiseks, samas kui minimaalne biofilmi hävitamise kontsentratsioon (MBEC) on madalaim kontsentratsioon, mis on vajalik väljakujunenud biofilmi hävitamiseks. MIC keskendub biofilmi ennetamisele, samas kui MBEC hindab ravi tõhusust küpsete biofilmide vastu.
Milliseid plaate kasutatakse MBEC-testides tavaliselt?
MBEC-testides tavaliselt kasutatavad mikrotiiterplaadid on tavaliselt 96-kannuga plaadid, mis on valmistatud polüstüreenist või polüpropüleenist. Need materjalid pakuvad biofilmi moodustumiseks sobivat pinda ja on keemiliselt vastupidavad testi käigus uuritavatele antimikroobsetele ainetele. Polüstüreenplaate eelistatakse laialdaselt nende optilise läbipaistvuse tõttu, mis on kasulik järgnevateks analüüsideks, nagu spektrofotomeetrilised või fluorestsentsil põhinevad mõõtmised. Nende plaatide konstruktsioon sisaldab eemaldatavaid piiritinaga kaasasid kaasi, mis on testi jaoks hädavajalikud, kuna biofilmid moodustuvad tihvtidel, mis on sukeldatud kasvusöödet sisaldavatesse kannudesse. Standardiseeritud plaadid, näiteks need, mis vastavad MBEC-testi protokollile, on spetsiaalselt konstrueeritud reprodutseeritavuse ning ühilduvuse tagamiseks UIP400MTP sonikaatori või muu töötlusseadmega.
Mis on PEG-kaanega plaadid?
PEG-kaanega plaadid on spetsiaalsed mitmekannulised plaadisüsteemid, mille kaas on varustatud väikeste polüetüleenglükooli (PEG) tihvtide või nõeltega, mis ulatuvad igasse kannu. Need tihvtid pakuvad kontrollitud tingimustes pinda mikroobsete biokilede tekkeks, jäljendades biokile kasvu reaalses keskkonnas. Konstruktsioon võimaldab biokiledel areneda tihvtidel, samal ajal kui kannud sisaldavad kasvukeskkonda või antimikroobseid aineid, võimaldades suure läbilaskevõimega biokilede tundlikkuse testimist ravimeetodite suhtes, näiteks MBEC-, MBIC- ja MIC-analüüsides.
Mis on ultrahelil põhineva biokile eraldamise eelis rakkude kaapimise ees?
Ultrahelil põhinev biokile eraldamine pakub olulist eelist rakkude kaapimise ees, kuna see on mitteinvasiivne, ühtlane ja väga tõhus meetod biokilede eemaldamiseks pindadelt. Erinevalt kaapimisest, mis võib olla ebaühtlane ning kahjustada aluspinda või rakke, tungivad ultrahelilained biokile maatriksisse ja lõhuvad selle, kahjustamata külgnevate struktuuride terviklikkust. See meetod tagab korratavuse, vähendab saastumisriski ja on eriti tõhus rakendustes, mis nõuavad täpset biokile eemaldamist, näiteks mikrobioloogilistes uuringutes või meditsiiniseadmete testimisel. Loe lähemalt, kuidas UIP400MTP sonikaator ületab rakkude kaapimist!
Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid alates laboriskaalast kuni tööstusliku mõõtkavani.