Minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) analüüsi protokoll

Biofilmi-põhine minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) määramine on oluline meetod antimikroobsete ainete tõhususe hindamiseks biofilmi moodustavate mikroorganismide suhtes, mis näitavad oma kaitsva ekstratsellulaarse maatriksi tõttu kõrgendatud resistentsust. Selle määramise oluline etapp on biofilmi struktuuride lahtikleepimine, et vabastada sinna kinnitunud rakud eluvõimelisuse täpseks hindamiseks. UIP400MTP mitme auguga plaadi ultraheliseade hõlbustab seda protsessi, kasutades fokuseeritud ultraheli kontrollitud kavitatsiooni tekitamiseks, mis eemaldab biofilmi rakud tõhusalt ja hajutab need ühtlaseks suspensiooniks. See täpne ja korratav biofilmi lagundamine suurendab MIC-analüüside usaldusväärsust ja läbilaskevõimet, muutes UIP400MTP oluliseks vahendiks biofilmiuuringute edendamisel.

Miks peaksin MIC-määramiste käigus kasutama ultraheli töötlemist?

• Täpsed ja korratavad andmed: Saavutage ühtlased rakususpensioonid, mis välistavad maatriksi varjutava mõju, tagades, et kolooniate arv ja optilise tiheduse näidud peegeldavad tõepoolest antimikroobset efektiivsust.
• Suure läbilaskevõime tõhusus: Töötle kogu 96-auguga plaati korraga vaid 1–3 minutiga, asendades aeglase ja ebaühtlase käsitsi kraapimise sujuvama töövooga.
• Rakute eluvõime säilimine: Eemaldage kinnitunud rakud õrnalt, vältides kraapimisest tulenevat füüsilist kahjustust, tagades seeläbi kõrgemad ellujäämismäärad, mis võimaldavad usaldusväärseid MIC/MBEC arvutusi.
• Ristkontaminatsiooni oht puudub: Kasutage ära kontaktivaba kausikujulise sarve disaini eeliseid, mis võimaldab kõiki prooviauke ühtlaselt töödelda, ilma et sondid puudutaksid üksikuid proove või prooviauke.
• Standardile vastavus: Viige oma metoodika kooskõlla tunnustatud tööstusstandarditega, nagu ASTM E2799-22, et suurendada oma andmete usaldusväärsust regulatiivsetel või avaldamise eesmärkidel.
• Confident Drug & Ravi eelneva sõelumine: Usaldage oma tundlikkuse uuringute tulemusi, et teha targemaid otsuseid antimikroobikumide tõhususe, resistentsusprofiili või ravimite arendamise kohta.

Ultrahelitöötlus biokile eraldamiseks

Biokilel põhinev MIC-test mõõdab tavaliselt bakterite eluvõimelisust või kasvu pärssimist, kasutades selliseid meetodeid nagu plaatimine, kolooniate loendamine või optilise tiheduse mõõtmine. Sonikatsioon on biokilepõhiste MIC-testide kriitiline samm biokilega seotud mikroorganismide antimikroobse tundlikkuse hindamisel. Selle esmane ülesanne on biokile maatriksisse manustatud rakkude eraldamine ja hajutamine ühtlaseks suspensiooniks täpseks analüüsiks.
Biokiled on antimikroobsete ainete suhtes oluliselt resistentsemad kui planktonirakud, mistõttu on õige eraldumine täpse analüüsi jaoks kriitilise tähtsusega. Selle protsessi käigus tekitavad ultraheli lained kontrollitud kavitatsiooni, purustades biokile maatriksi ja vabastades manustatud rakud ühtlaseks suspensiooniks taastumiskeskkonnas. See etapp võimaldab täpselt hinnata biokiles dispergeeritud rakkude eluvõimelisust selliste meetodite abil nagu plaatimine, lahjendamine ja kolooniate loendamine. Õige biokile katkemine ultrahelitöötluse kaudu takistab jääkmaatriksi komponentide varjestusrakke, mis võib vastasel juhul viia antimikroobse toime alahindamiseni. Mitme kaevuga plaadi sonikaatori UIP400MTP sobib selleks eriti hästi, pakkudes täpseid ja reprodutseeritavaid ultrahelitöötlustingimusi, et tagada katseplaatide usaldusväärne ja suure läbilaskevõimega ettevalmistamine.

Miks on ultrahelitöötlus vajalik biokilepõhistes minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni testides

Eluvõimelisuse mõõtmiseks ja rakkude loendamiseks on vaja üksikute rakkude täielikku ja usaldusväärset eraldumist ja hajutamist. UIP400MTP soodustab ühtlast, mittekahjustavat biokile eraldumist ja rakkude dispersiooni tugevate analüüsitulemuste saavutamiseks.

• Biokile keerukus: Biokiled on struktureeritud mikroobikooslused, mis on ümbritsetud rakuvälise polümeerse aine (EPS) maatriksiga, mis kaitseb mikroorganisme ja muudab need antimikroobsete ainete suhtes resistentsemaks.
• Ühtlane dispersioon: Biokilesse manustatud rakkude elujõulisuse või nende antimikroobikumide suhtes vastuvõtlikkuse täpseks mõõtmiseks tuleb biokile kõigepealt eemaldada ja lagundada homogeenseks suspensiooniks.

Biokilel põhinev minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni analüüsi protokoll

Minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) test määrab mikroorganismide nähtava kasvu pärssimiseks vajaliku antimikroobse aine madalaima kontsentratsiooni. See protokoll on mõeldud biokilega seotud mikroorganismidele, kasutades biokile katkestamiseks UIP400MTP mitme auguga plaadi sonikaatorit.

1. samm: bakteriaalse inokulaadi valmistamine

1. Valmistage bakterisuspensioon:
   Kasvatage baktereid sobivas söötmes logaritmilise faasi keskpaigani.
   Kultuuri lahjendatakse standarditud rakutiheduse saavutamiseks (nt 0,5 McFarlandi standard või OD600 ~0,1).
2. Valmistage antimikroobsed lahused:
   Antimikroobne aine lahjendatakse sobivas keskkonnas, et tekiks kontsentratsioonide vahemik (nt kahekordsed seerialahjendused).
3. Jaotage 96welli plaadile:
   Antimikroobsed lahused lisatakse standardse 96 auguga plaadi aukudesse, mille lõplik maht on ~150–200 μL.
   Lisada kasvukontrollid (ei sisalda antimikroobseid aineid) ja steriilsuse kontrolle (ei sisalda bakteriaalset inokulaati).

2. samm: biokile moodustumine pulgakaanel

• Kinnitage tihvti kaas:
  Asetage spetsiaalne tihvti kaas inokuleeritud aukudesse, tagades, et tihvtid on täielikult bakterisuspensiooni sukeldatud.
• Plaati inkubeeritakse:
  Inkubeeritakse sobival temperatuuril (nt 37 °C) kindlaksmääratud aja jooksul (nt 24 tundi) staatilistes tingimustes, et võimaldada biokile moodustumist tihvtidele.

3. etapp: antimikroobne kokkupuude

• Loputage tihvtid:
  Eemaldage baktersuspensioonilt tihvti kaas ja loputage õrnalt steriilses soolalahuses või fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses, et eemaldada lõdvalt kinnitatud planktonirakud.
• Kokkupuude antimikroobsete ainetega:
  Viige tihvti kaas uuele 96welli plaadile, mis sisaldab varem valmistatud antimikroobseid lahjendusi.
  Inkubeeritakse kindlaksmääratud aja jooksul (nt 24 tundi) staatilistes tingimustes, et antimikroobne aine saaks biokiledele mõjuda.

4. samm: ultrahelitöötlus mikroplaadi sonikaatoriga UIP400MTP

Ultrahelitöötluse etapp on kriitilise tähtsusega biokilede eemaldamiseks tihvti kaantest, et hinnata elujõulisust. Järgige UIP400MTP sonikaatori jaoks neid samme:

1. Valmistage seadistus ette.
   Värske 96 auguga plaat täidetakse igas augus taastumissöötmega (nt neutraliseeriv puljong või steriilne kasvusööde).
2. Viige tihvti kaas üle:
   Eemaldage antimikroobse ravi plaadilt tihvti kaas.
   Antimikroobsete ainete jääkide eemaldamiseks loputage tihvti kaant steriilses soolalahuses või fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses.
3. Asetage plaat sonikaatorisse:
   Kinnitage tihvti kaas taastumiskeskkonna plaadile.
   Taastumissöötme plaat asetatakse sonikaatori UIP400MTP, tagades, et plaat istub keskel ja stabiilsena nagu kirjeldatud juhendis.
4. Reguleerige ultrahelitöötluse parameetreid:
   Määrake ultrahelitöötluse parameetrid UIP400MTP (seadeid võib kohandada biokilega):
   Amplituud: 70–100%.
   Sonikatsiooniaeg: 1–3 minutit (reguleerige vastavalt biokile struktuurile) tsükli režiimis.
5. Sonikaat:
   Alustage ultrahelitöötlusprotsessi. Ultraheli lained häirivad biokile maatriksit ja hajutavad rakud taastumiskeskkonda.
6. Jälgige protsessi:
   Kasutage ühendatavat temperatuuriandurit, et jälgida proovi temperatuuri süvendites. UIP400MTP saab jahutamiseks ühendada laborijahutiga.
7. Ultrahelitöötluse järgne käitlemine:
   Eemaldatud biokilesid sisaldav taastussööde kantakse kohe analüüsimiseks värskele steriilsele plaadile.

(A) TSB-d sisaldav plaat 2% glükoosiga, mida kasutatakse biokile moodustamiseks, rakkude taastamiseks ning MIC ja MBEC määramiseks; (B) Tihvtidega kaas stafülokokkide biokilede moodustamiseks.
Tihvtidele moodustatud biokilerakud eemaldati ultrahelitöötlusega (Hielscher Ultrasound Technology) 5 minutiks 96-süvendi plaatidel, mis sisaldasid värsket söödet rakkude taastumiseks.
(Pilt ja uuring: ©de Oliveira et al., 2016)

4. etapp: elujõulisuse hindamine

Plaadil ja kultuuris eraldatud biokiled:

1. Saagisöötme ja plaadi seerialahjendused tehakse agarile, et loendada kolooniaid moodustavaid ühikuid (CFU).
2. Hinnake MIC-d:
   Määrata MIC kui madalaim antimikroobne kontsentratsioon, mis pärsib täielikult mikroobide nähtavat kasvu taastumiskeskkonnas.

MIC minimaalne inhibeeriv kontsentratsioon: mikrotiiterplaadi näide ja mikrodilutsiooni tulemuste tõlgendamine.
(Uuring ja pilt: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Kes saab kasu ultrahelitöötlusest MIC-määramiste käigus?

• Meditsiiniseadmete tootjad: Pinnakattete tõhususe testimiseks ja biofilmi tekkimisele kalduvate seadmete puhastamisjuhendite kinnitamiseks.
• Kliinilised mikrobioloogid: Implantaadiga seotud infektsioonide (nt PJI) täpseks diagnoosimiseks, eraldades baktereid meditsiiniseadmetelt.
• Ravimiarendajad: Hinnata uute antimikroobsete ravimite tõhusust vastupidavate, biofilmi sisse kinnistunud patogeenide vastu.
• Akadeemilised teadlased: Viia läbi suure läbilaskevõimega ja korratavaid uuringuid biofilmi bioloogia ja antimikroobse resistentsuse mehhanismide kohta.
• Tööstuslikud kvaliteedikontrollimeeskonnad: Bioloogilise saastumise ja desinfektsioonivahendite tõhususe hindamiseks tööstuslikes tingimustes (nt standardite ASTM E2799-22 alusel).

Disain, tootmine ja nõustamine – Kvaliteet Valmistatud Saksamaal

Hielscheri ultrasonikaatorid on tuntud oma kõrgeimate kvaliteedi- ja disainistandardite poolest. Vastupidavus ja lihtne kasutamine võimaldavad meie ultrasonikaatorite sujuvat integreerimist tööstusrajatistesse. Hielscheri sonikaatorid saavad kergesti käsitseda karmid tingimused ja nõudlikud keskkonnad.

Hielscher Ultrasonics on ISO sertifitseeritud ettevõte ja paneb erilist rõhku suure jõudlusega ultrasonikaatoritele, millel on tipptasemel tehnoloogia ja kasutajasõbralikkus. Loomulikult on Hielscheri ultrasonikaatorid CE-nõuetele vastavad ja vastavad UL, CSA ja RoHs nõuetele.

Siit saate lugeda, kuidas UIP400MTP kasutatakse ASTM E2799 protokollis biokile eraldamiseks – Desinfektsioonivahendi efektiivsuse testimine Pseudomonas aeruginosa biokile vastu, kasutades MBEC-testi.